本申請(qǐng)基于2015年6月5日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/171,523，2015年5月14日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/161,709；2014年10月27日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/069,198；和2014年7月15日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/024,856，并且要求它們的權(quán)益，每個(gè)申請(qǐng)通過引用并入本文。

發(fā)明背景

本公開一般涉及基于生物傳感器的檢測(cè)，更具體地涉及可用于核酸測(cè)序的生物傳感器。

目前可用的用于測(cè)序dna的商業(yè)平臺(tái)相對(duì)昂貴。這些平臺(tái)中的大多數(shù)使用所謂的“合成測(cè)序”方法，這是因?yàn)樵跈z測(cè)每個(gè)單體(即核苷酸)添加到生長的聚合酶結(jié)構(gòu)的情況下合成dna聚合物。因?yàn)槟０錮na鏈嚴(yán)格指導(dǎo)新dna聚合物的合成，所以可以從在合成期間添加到生長鏈的一系列核苷酸單體中推斷模板dna的序列。監(jiān)測(cè)反應(yīng)使用相對(duì)昂貴的硬件，如激光，檢測(cè)光學(xué)和復(fù)雜的流體遞送系統(tǒng)。迄今為止最成功的商業(yè)平臺(tái)也需要昂貴的試劑和硬件以在可以甚至開始合成測(cè)序前擴(kuò)增dna模板。這些平臺(tái)的復(fù)雜性和費(fèi)用阻礙了它們?cè)谀承┡R床和研究環(huán)境中的使用，其中顯然需要dna測(cè)序技術(shù)。

因此，存在對(duì)核酸測(cè)序平臺(tái)的改進(jìn)的需要，以使它們更具成本效益，快速和方便。本公開解決了這種需要并且還提供了其它優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明概述

本公開提供了第一種核酸測(cè)序方法。該方法可以包括以下步驟：(a)提供拴系到固體支持物電荷傳感器的聚合酶；(b)提供一種或多種經(jīng)標(biāo)記的核苷酸，由此當(dāng)標(biāo)記物接近(inproximityto)電荷傳感器(chargesensor)時(shí)，電荷傳感器可以檢測(cè)標(biāo)記物的存在；并且(c)檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的核苷酸對(duì)與模板核酸互補(bǔ)的新生鏈的摻入。

本公開還提供了用于將反應(yīng)組分附著到電荷傳感器的方法。該方法可以包括以下步驟：(a)提供包括多個(gè)電荷傳感器的固體支持物，其中每個(gè)電荷傳感器具有附著多個(gè)反應(yīng)組分的能力；(b)提供含有特定類型的多個(gè)反應(yīng)組分的流體；和(c)在下述條件下使固體支持物與流體接觸，其中(i)特定類型的多個(gè)反應(yīng)組分與多個(gè)電荷傳感器流體連通，(ii)特定類型的反應(yīng)組分的數(shù)目在流體中大于在固體支持物上的電荷傳感器的數(shù)目；并且(iii)來自流體的特定類型的反應(yīng)組分在導(dǎo)致固體支持的條件下附著到電荷傳感器，其中將每個(gè)電荷傳感器附著到反應(yīng)組分中的單一一種(whereeachofthechargesensorsisattachedtoasingleoneofthereactioncomponents)。

在一些實(shí)施方案中，用于將反應(yīng)組分附著到電荷傳感器的方法可以包括以下步驟：(a)提供包括多個(gè)電荷傳感器的固體支持物，其中每個(gè)電荷傳感器具有附著多個(gè)反應(yīng)組分的能力；(b)提供含有特定類型的多個(gè)反應(yīng)組分的流體，其中特定類型的每個(gè)反應(yīng)組分與排斥部分結(jié)合；和(c)在下述條件下使固體支持物與流體接觸，其中(i)特定類型的多個(gè)反應(yīng)組分與多個(gè)電荷傳感器流體連通，(ii)特定類型的反應(yīng)組分的數(shù)目在流體中大于在固體支持物上的電荷傳感器的數(shù)目；(iii)來自流體的反應(yīng)組分附著到電荷傳感器，和(iv)結(jié)合到每個(gè)反應(yīng)組分的排斥部分防止多個(gè)反應(yīng)組分中的多于一個(gè)的反應(yīng)組分附著到每個(gè)電荷傳感器。

用于將反應(yīng)組分附著到電荷傳感器的方法可以包括以下步驟：(a)提供包括多個(gè)電荷傳感器的固體支持物，其中每個(gè)電荷傳感器具有附著多個(gè)反應(yīng)組分的能力；(b)提供含有特定類型的多個(gè)反應(yīng)組分的流體；(c)在下述條件下使固體支持物與流體接觸，其中(i)特定類型的多個(gè)反應(yīng)組分與多個(gè)電荷傳感器流體連通，(ii)特定類型的反應(yīng)組分的數(shù)目在流體中大于在固體支持物上的電荷傳感器的數(shù)目；和(iii)來自流體的特定類型的反應(yīng)組分附著到電荷傳感器，從而形成附著到來自流體的特定類型的多個(gè)反應(yīng)組分的經(jīng)修飾的電荷傳感器；并且(d)從每個(gè)經(jīng)修飾的電荷傳感器中除去特定類型的一種或多種反應(yīng)組分，以留下附著到每個(gè)經(jīng)修飾的電荷傳感器的特定類型的反應(yīng)組分的單一一種。

本公開提供了檢測(cè)核苷酸的方法。該方法可以包括以下步驟：(a)提供栓系于固體支持物電荷傳感器的核苷酸結(jié)合蛋白(例如聚合酶)；(b)提供一種或多種經(jīng)標(biāo)記的核苷酸，由此當(dāng)標(biāo)記物接近電荷傳感器時(shí)，電荷傳感器可以檢測(cè)標(biāo)記物的存在；并且(c)使用電荷傳感器檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的核苷酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合。

在具體實(shí)施方案中，核酸測(cè)序的方法可以通過(a)提供拴系到固體支持物電荷傳感器的聚合酶；(b)提供一種或多種經(jīng)標(biāo)記的核苷酸，由此當(dāng)標(biāo)記物接近電荷傳感器時(shí)，電荷傳感器可以檢測(cè)標(biāo)記物的存在；并且(c)使用電荷傳感器檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的核苷酸對(duì)與模板核酸互補(bǔ)的新生鏈的摻入。

由本公開提供的核酸測(cè)序的方法可以包括以下步驟：(a)提供拴系到固體支持物電荷傳感器的聚合酶；(b)提供一種或多種經(jīng)標(biāo)記的核苷酸，由此當(dāng)標(biāo)記物接近電荷傳感器時(shí)，電荷傳感器可以檢測(cè)標(biāo)記物的存在，其中一種或多種經(jīng)標(biāo)記的核苷酸具有可逆的終止劑部分；(c)使用電荷傳感器檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)經(jīng)標(biāo)記的核苷酸對(duì)與模板核酸互補(bǔ)的新生鏈的摻入，從而形成可逆終止的新生鏈；(d)修飾可逆終止的新生鏈，以使所述新生鏈能夠進(jìn)一步摻入核苷酸；并且(e)重復(fù)(b)至(d)以獲得模板核酸的序列。

還提供了核酸測(cè)序的方法，其包括以下步驟：(a)提供拴系到固體支持物電荷傳感器的聚合酶；(b)在下述條件下使聚合酶與模板核酸和一種或多種不同核苷酸類型接觸，其中聚合酶催化添加一種或多種核苷酸類型以形成核酸模板的核酸互補(bǔ)物并且其中添加一種或多種不同的核苷酸類型產(chǎn)生來自由電荷傳感器檢測(cè)的聚合酶的構(gòu)象信號(hào)變化；(c)使用所述電荷傳感器檢測(cè)來自所述聚合酶的信號(hào)的變化；并且(d)確定用于添加一種或多種不同核苷酸類型的信號(hào)變化的速率，極性，幅度或時(shí)間持續(xù)，從而確定模板核酸的核苷酸序列。

附圖簡述

圖1顯示了通過系鏈附著到電荷傳感器的聚合酶。

圖2顯示了經(jīng)由核酸系鏈附著到電荷傳感器并結(jié)合到核苷酸的聚合酶，所述核苷酸可以基于電荷或與傳感器的接近性區(qū)分。

圖3顯示了經(jīng)由核酸系鏈附著到電荷傳感器并結(jié)合核苷酸的聚合酶，所述核苷酸可基于電荷區(qū)分。

圖4顯示了栓系到電荷傳感器的聚合酶，其中電荷傳感器也附著到能夠結(jié)合核苷酸上的標(biāo)記物的多個(gè)寡核苷酸。

圖5顯示了在標(biāo)記物的寡核苷酸部分的末端具有兩個(gè)帶負(fù)電荷的氧的核苷酸標(biāo)記物。

圖6顯示了可以使用電荷傳感器檢測(cè)的電荷標(biāo)簽。

圖7顯示了klenow片段(polixxo)和bsu-lf(bsuxxx1)的比對(duì)序列，其中klenow片段的o螺旋指結(jié)構(gòu)域的位置和bsu-lf中的比對(duì)位置是框示的。在右邊的插圖中還顯示了模型，其顯示了與納米管模型并置的klenow片段o-螺旋指的幾個(gè)殘基的三維位置。

圖8顯示了具有夾緊區(qū)(pinchedregion)的電荷傳感器和在夾緊區(qū)處栓系到電荷傳感器的聚合物。聚合酶與核酸的模板鏈和新生鏈復(fù)合。

圖9顯示了使用局部氧化將夾點(diǎn)(pinch)引入硅中的方法的示意圖。

圖10顯示了通過具有核酸序列(通常表示為10ns的序列)的系鏈附著到聚合酶(pol)的電荷傳感器。聚合酶與靶核酸復(fù)合，并且指示與四種不同核苷酸(分別為atp，gtp，ctp和ttp)相關(guān)的標(biāo)記的結(jié)合位點(diǎn)。

圖11顯示通過具有核酸序列(通常表示為10ns的序列)的系鏈附著到聚合酶(pol)的電荷傳感器。聚合酶與靶核酸和標(biāo)記的ctp類似物復(fù)合。ctp類似物上的標(biāo)記物包括具有肌苷(i)的核酸區(qū)和與系鏈(abc)上的互補(bǔ)區(qū)雜交的特異性區(qū)(a’b’c’)。

圖12顯示了由于四種不同核苷酸類似物的結(jié)合而相對(duì)于電荷傳感器處于四種不同位置狀態(tài)的拴系的聚合酶。每個(gè)核苷酸類似物具有與其它3個(gè)核苷酸類似物相同長度的寡核苷酸部分，但每個(gè)核苷酸類似物具有與其它核苷酸類似物結(jié)合的區(qū)域相比結(jié)合到該系鏈的不同區(qū)域的特異性結(jié)合序列。

發(fā)明詳述

一般而言，本公開的實(shí)施方案涉及用于單核分子檢測(cè)的裝置，組合物和方法，其可用于諸如在核酸測(cè)序程序中檢測(cè)的核苷酸摻入事件等的應(yīng)用中。需要改進(jìn)的檢測(cè)系統(tǒng)，其以高通量方式提供長測(cè)序讀段。本文所闡述的本發(fā)明的實(shí)施方案滿足這種需要并且還提供其它優(yōu)點(diǎn)。

基于互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(complementarymetal–oxide–semiconductor,cmos)的感測(cè)方案已經(jīng)用于核酸測(cè)序。當(dāng)前基于cmos的感測(cè)方案利用在sbs反應(yīng)中發(fā)生的dna聚合的副產(chǎn)物(例如質(zhì)子或焦磷酸鹽)的電化學(xué)檢測(cè)。這些方法提供了無光和無標(biāo)記物的優(yōu)點(diǎn)。無光，反應(yīng)不需要用于檢測(cè)的昂貴的光學(xué)儀器。當(dāng)使用無標(biāo)記物的試劑時(shí)，制備試劑的成本和復(fù)雜性通常降低。然而，當(dāng)前基于cmos的感測(cè)方案的缺點(diǎn)是要檢測(cè)的反應(yīng)副產(chǎn)物是移動(dòng)的，并且具有從反應(yīng)區(qū)擴(kuò)散出來的自然趨勢(shì)，這可導(dǎo)致當(dāng)試圖執(zhí)行多重測(cè)序反應(yīng)時(shí)在相鄰位點(diǎn)之間的串?dāng)_。鑒于大多數(shù)基因組的大尺寸和典型測(cè)序反應(yīng)的有限讀段長度，多重化(multiplexing)對(duì)于實(shí)現(xiàn)測(cè)序技術(shù)的研究和臨床應(yīng)用的期望覆蓋水平是非常重要的。

一般而言，本公開提供了可以用于核酸測(cè)序和用于檢測(cè)核酸和其它分析物的獨(dú)特檢測(cè)模式。在圖1中顯示示例性實(shí)施方案。簡言之，用系鏈3在硅納米線(nanowire)場效應(yīng)晶體管(field-effecttransistor,fet)2的門極(gate)5上固定聚合酶1。任選地，納米線可以由除硅之外的材料制成，或者納米線可以用納米管替代。任選地，系鏈3可以是導(dǎo)電聚合物鏈(conductivepolymerstrand)，如由在聚合酶近端的系鏈末端的正電荷6和在聚合酶遠(yuǎn)端并且附著到門極5的系鏈末端的負(fù)電荷7指示。在與核苷酸和其它反應(yīng)物一起被引入溶液中之后，ssdna4被附著到聚合酶1。當(dāng)合成自由鏈時(shí)，產(chǎn)生在fet2附近的電荷分布的干擾，或是作為聚合酶1的構(gòu)象變化的結(jié)果，或者由于核苷酸的擴(kuò)散，可能在fet2附近用電活性標(biāo)簽修飾。電荷分布的那些修飾由納米線-fet2感測(cè)并且檢測(cè)為fet跨導(dǎo)電流中的調(diào)制(modulation)。

本文闡述的基于fet的裝置和方法的一些優(yōu)點(diǎn)是：(1)可以利用適當(dāng)縮放的fet實(shí)現(xiàn)單分子靈敏度；(2)促進(jìn)高度并行化(parallelization)(也稱為“多路復(fù)用性(multiplexability)”)，因?yàn)闄z測(cè)到的電荷干擾定位在聚合酶附近，從而避免相鄰fet位點(diǎn)之間的串?dāng)_；(3)傳導(dǎo)系鏈的任選使用有助于將電荷擾動(dòng)傳輸?shù)介T極，并使從生物溶液中篩選的不期望的影響最小化，以及(4)硅納米線fet可以使用與半導(dǎo)體制造設(shè)施兼容的工藝方便地制造。

本文使用的術(shù)語將被理解為采取它們的普通含義，除非另有規(guī)定。本文使用的幾個(gè)術(shù)語的實(shí)例及其定義如下所述。

如本文所使用的，術(shù)語“陣列”是指附著到一個(gè)或多個(gè)固相基底的電荷傳感器或分子的群體，使得電荷傳感器或分子可以根據(jù)它們的相對(duì)位置彼此區(qū)分。陣列可以包括不同的分子，它們各自位于固相基底上的不同的可尋址位置(例如，在不同的電荷傳感器處)?；蛘?，陣列可以包括各自攜帶不同分子的單獨(dú)的固相基底，其中可以根據(jù)附著固相基底的表面上固相基底的位置或根據(jù)固相基底在諸如流體流的液體中的位置鑒定。陣列的分子可以是核酸引物，核酸探針，核酸模板或核酸酶，如聚合酶和外切核酸酶。

如本文所使用的，術(shù)語“附著”是指兩個(gè)物體彼此連接，緊固，粘附，聯(lián)接或結(jié)合的狀態(tài)。例如，反應(yīng)組分，如聚合酶，可以通過共價(jià)或非共價(jià)鍵附著到固相組分，如電荷傳感器。共價(jià)鍵的特征在于原子之間共享電子對(duì)。非共價(jià)鍵是不涉及電子對(duì)的共享的化學(xué)鍵，并且可以包括例如氫鍵，離子鍵，范德華力，親水相互作用和疏水相互作用。

如本文所使用的，術(shù)語“電荷傳感器”旨在表示將其表面或其周圍電場處的擾動(dòng)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)的檢測(cè)裝置。例如，電荷傳感器可以將反應(yīng)組分的到達(dá)或離開轉(zhuǎn)化為電信號(hào)。電荷傳感器還可以將兩個(gè)反應(yīng)組分之間的相互作用或單個(gè)反應(yīng)組分中的構(gòu)象變化轉(zhuǎn)化為電信號(hào)。示例性電荷傳感器是場效應(yīng)晶體管(fet)，諸如碳納米管(cnt)，基于單壁碳納米管(swnt)的fet，硅納米線(sinw)fet，石墨烯納米帶fet(graphenenanoribbonfet)(以及由2d材料如mos2，硅化物等制作的相關(guān)納米帶fet)，隧道fet(tunnelfet,tfet)和陡峭的亞閾值斜率裝置(steepsubthresholdslopedevice)(參見例如swaminathan等人,proceedingsofthe51stannualdesignautomationconferenceondesignautomationconference,pg1-6,isbn:978-1-4503-2730-5(2014)以及ionescu等人,nature479,329–337(2011))?？梢栽诒竟_的方法和裝置中使用的fet和swnt傳感器的實(shí)例在美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2013/0078622a1中列出，其通過引用并入本文。

如本文所使用的，術(shù)語“可切割的系鏈”意指具有可通過化學(xué)或物理處理選擇性斷裂的鍵的化學(xué)接頭。通常，鍵斷裂就化學(xué)或物理處理而言是選擇性的，所述處理對(duì)存在的其它反應(yīng)組分沒有實(shí)質(zhì)性的不利影響?？闪呀獾南垫溈梢詫?duì)用作用劑，如但不限于光，堿，酸，熱，酶和化學(xué)試劑的選擇性鍵斷裂易感。電場和物理攪拌也可用于切割系鏈。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，接頭是核苷酸接頭。在一些情況下，接頭包含由序列特異性限制性內(nèi)切核酸酶切割的位點(diǎn)。然而，序列特異性切割位點(diǎn)不需要存在于根據(jù)本文列出的方法使用的一些接頭中。

如本文所使用的，術(shù)語“連環(huán)體重復(fù)”意指單個(gè)核酸分子中特定核苷酸序列的連續(xù)重復(fù)串。連環(huán)體重復(fù)可以例如通過滾環(huán)擴(kuò)增(rca)產(chǎn)生，其中重復(fù)的核苷酸序列是由rca復(fù)制的模板的互補(bǔ)物。

如本文所使用的，術(shù)語“傳導(dǎo)系鏈(conductingtether)”旨在表示可以傳導(dǎo)電或可以傳輸電場的電效應(yīng)的化學(xué)接頭。傳導(dǎo)系鏈可用于將反應(yīng)組分化學(xué)連接到電荷傳感器，并在反應(yīng)組分和電荷傳感器之間傳導(dǎo)電。示例性傳導(dǎo)系鏈包括但不限于具有摻雜聚噻吩、聚(3,4-亞乙基二氧噻吩)、聚乙炔、聚吡咯、聚苯胺、聚芴、聚苯撐、聚芘、聚薁、聚萘、聚咔唑、聚吲哚或聚氮雜卓結(jié)構(gòu)的那些?？梢杂米鱾鲗?dǎo)系鏈的接頭也在美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2010/0073847a1中列出，其通過引用并入本文。

如本文所使用的，術(shù)語“構(gòu)象信號(hào)變化”是指響應(yīng)于分子部分的結(jié)構(gòu)，形狀或排列的變化，來自分子的可檢測(cè)信號(hào)的出現(xiàn)，消失或改變。例如，信號(hào)變化可以是由于標(biāo)記物與分子的第一部分的相互作用的變化，以與分子的第二部分相互作用。該術(shù)語當(dāng)具體描述時(shí)意在區(qū)分源自分子的標(biāo)記物的信號(hào)變化，由于標(biāo)記物與特異性結(jié)合分子的反應(yīng)物的相互作用的變化或者標(biāo)記物與源自該分子的催化活性的產(chǎn)物的相互作用的變化。

如本文所使用的，術(shù)語“構(gòu)象標(biāo)記的”當(dāng)用于指分子時(shí)，是指具有響應(yīng)于分子結(jié)構(gòu)變化，分子形狀變化或分子的各部分的排列變化的至少一個(gè)標(biāo)記物。分子可以是例如聚合酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，外切核酸酶或其它核酸酶，如下文列出的那些。分子的部分可以是例如由于圍繞在原子之間的分子結(jié)構(gòu)中發(fā)生的一個(gè)或多個(gè)化學(xué)鍵的旋轉(zhuǎn)而改變相對(duì)位置的原子。分子的部分可以是大分子的結(jié)構(gòu)域，如相關(guān)領(lǐng)域中通常已知的那些。例如，聚合酶包括稱為指，掌和拇指結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域。在蛋白質(zhì)的情況下，所述部分可以是二級(jí)，三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域。標(biāo)記物可以例如通過共價(jià)連接附著到分子。然而，標(biāo)記物不需要附著到分子，例如位于分子附近。在具體實(shí)施方案中，標(biāo)記物不附著到分子的反應(yīng)物或產(chǎn)物，如核苷酸或核酸。

如本文所使用的，術(shù)語“不同的”當(dāng)用于指核酸時(shí)，是指核酸具有彼此不同的核苷酸序列。兩種或更多種不同的核酸可以具有沿其整個(gè)長度不同的核苷酸序列。或者，兩種或更多種不同的核酸可以具有沿其長度的實(shí)質(zhì)性部分不同的核苷酸序列。例如，兩種或更多種不同的核酸可以具有對(duì)于兩種或更多種分子不同的靶核苷酸序列部分，同時(shí)還具有在兩種或更多種分子上相同的通用序列部分。術(shù)語“不同的”可以類似地應(yīng)用于其它分子，如聚合酶和核酸酶。

如本文所使用的，當(dāng)用于指項(xiàng)集合時(shí)，術(shù)語“每個(gè)”旨在鑒定集合中的單個(gè)項(xiàng)，但不一定指的是集合中的每個(gè)項(xiàng)目。如果明確披露或上下文另有明確規(guī)定，則可發(fā)生異常。

如本文所使用的，術(shù)語“流體連通(fluidiccommunication)”當(dāng)用于指流體中的分子和與流體接觸的位點(diǎn)時(shí)，是指分子在流體中移動(dòng)或通過流體接觸或進(jìn)入位點(diǎn)的能力。該術(shù)語還可以指分子從該位點(diǎn)分離或離開進(jìn)入溶液的位點(diǎn)的能力。當(dāng)沒有阻止分子進(jìn)入位點(diǎn)，與位點(diǎn)接觸，從位點(diǎn)分離和/或離開位點(diǎn)的屏障時(shí)，可發(fā)生流體連通。然而，流體連通理解為存在，即使擴(kuò)散被延遲，減少或改變，只要不是絕對(duì)防止存取(access)。

如本文所使用的，術(shù)語“標(biāo)記物”當(dāng)用于指反應(yīng)組分時(shí)，意在表示可檢測(cè)的反應(yīng)組分或反應(yīng)組分的可檢測(cè)部分。有用的標(biāo)記物是可以由電荷傳感器檢測(cè)的電荷標(biāo)記物(也稱為電荷標(biāo)簽)。標(biāo)記物可以是待檢測(cè)的反應(yīng)組分(例如聚合酶的帶電荷氨基酸)固有的或標(biāo)記物可以是反應(yīng)組分(例如氨基酸的非天然存在的修飾)外在的。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記物可包括具有單獨(dú)功能的多個(gè)部分。例如，標(biāo)記物可以包括接頭組分(如核酸)和電荷標(biāo)簽組分。

如本文所使用的，術(shù)語“非天然的”當(dāng)用于指分子的部分時(shí)，意圖指發(fā)現(xiàn)在其天然環(huán)境中或在未受人，技術(shù)干預(yù)干擾的生物系統(tǒng)中未與分子附著的部分。通常，非天然部分是分子的合成修飾，其使得分子在結(jié)構(gòu)上或化學(xué)上不同于未修飾的分子或具有天然修飾的分子。如本文所使用的，術(shù)語“非天然的”當(dāng)用于指用于方法的類似物時(shí)，意指在方法發(fā)生的天然環(huán)境中沒有發(fā)現(xiàn)的類似物。通常，非天然類似物是在結(jié)構(gòu)上或化學(xué)上不同于類似物所屬類別中的其它分子類型的合成類似物。

如本文所使用的，術(shù)語“核酸”旨在與其在本領(lǐng)域中的用途一致，并且包括天然存在的核酸或其功能類似物。特別有用的功能類似物能夠以序列特異性方式與核酸雜交或能夠用作特定核苷酸序列復(fù)制的模板。天然存在的核酸通常具有含有磷酸二酯鍵的主鏈。類似結(jié)構(gòu)可以具有替代的主鏈連接，包括本領(lǐng)域中已知的多種連接的任何一種，如肽核酸(pna)或鎖定核酸(lna)。天然存在的核酸通常具有脫氧核糖(例如存在于脫氧核糖核酸(dna)中)或核糖(例如存在于核糖核酸(rna)中)。

核酸可以含有本領(lǐng)域已知的這些糖部分的多種類似物中的任何一種。核酸可以包括天然或非天然堿基。在這點(diǎn)上，天然脫氧核糖核酸可具有選自腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶或鳥嘌呤的一種或多種堿基，并且核糖核酸可具有選自尿嘧啶，腺嘌呤，胞嘧啶或鳥嘌呤的一個(gè)或多個(gè)堿基?？梢园ㄔ诤怂嶂械挠杏玫姆翘烊粔A基是本領(lǐng)域已知的。

如本文所使用的，術(shù)語“核苷酸”意圖包括天然核苷酸，其類似物，核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，雙脫氧核糖核苷酸和稱為核苷酸的其它分子。該術(shù)語可以用于指存在于聚合物中的單體單元，例如以鑒定存在于dna或rna鏈中的亞基。該術(shù)語還可以用于指不一定存在于聚合物中的分子，例如能夠通過聚合酶以模板依賴性方式摻入多核苷酸中的分子。該術(shù)語可以指在5’碳上具有例如0、1、2、3或更多個(gè)磷酸酯的核苷單元。例如，四磷酸核苷酸和五磷酸核苷酸可以是特別有用的。示例性天然核苷酸包括但不限于atp、utp、ctp、gtp、adp、udp、cdp、gdp、amp、ump、cmp、gmp、datp、dttp、dctp、dgtp、dadp、dtdp、dcdp、dgdp、damp、dtmp、dcmp、和dgmp。

非天然核苷酸在本文中也稱為核苷酸類似物，包括不存在于天然生物系統(tǒng)中或在其天然環(huán)境中基本上不通過聚合酶摻入多核苷酸的那些，例如在表達(dá)聚合酶的非重組細(xì)胞中。特別有用的非天然核苷酸包括通過聚合酶以下述速率摻入多核苷酸鏈中的那些，所述速率比通過聚合酶將另一種核苷酸，如與相同watson-crick互補(bǔ)堿基堿基配對(duì)的天然核苷酸摻入鏈中的速率實(shí)質(zhì)性更快或更慢。例如，當(dāng)與天然核苷酸的摻入速率相比時(shí)，可以以至少2倍不同，5倍不同，10倍不同，25倍不同，50倍不同，100倍不同，1000倍不同，10000倍不同或更多摻入非天然核苷酸。非天然核苷酸在摻入多核苷酸后能夠進(jìn)一步延伸。實(shí)例包括具有3’羥基的核苷酸類似物或在3’位置具有可逆終止劑部分的核苷酸類似物，其可被除去以允許已經(jīng)摻入核苷酸類似物中的多核苷酸進(jìn)一步延伸?？梢允褂玫目赡娼K止劑的實(shí)例描述于例如美國專利號(hào)7,427,673；7,414,116；和7,057,026及pct公開wo91/06678和wo07/123744，每篇通過引用并入本文。應(yīng)當(dāng)理解，在一些實(shí)施方案中，可以在摻入核苷酸類似物的多核苷酸不進(jìn)一步延伸的條件下使用具有3’終止劑部分或缺少3’羥基的核苷酸類似物(例如雙脫氧核苷酸類似物)。在一些實(shí)施方案中，核苷酸不包括可逆的終止劑部分，或者核苷酸不包括非可逆的終止劑部分，或者核苷酸將不包括任何終止劑部分。在5’位置具有修飾的核苷酸類似物也是有用的。

如本文所使用的，術(shù)語“保護(hù)部分”旨在表示附著到反應(yīng)組分以防止反應(yīng)組分經(jīng)歷特定反應(yīng)的化合物或其部分。例如，核酸分子可以與核酸酶結(jié)合，使得核酸分子通過否則會(huì)引起酶的降解或修飾的處理來防止核酸酶降解或修飾?？贵w還可以用于結(jié)合反應(yīng)組分以保護(hù)反應(yīng)組分免于降解，失活或其它反應(yīng)。

如本文所使用的，術(shù)語“反應(yīng)組分”意指參與反應(yīng)的分子。實(shí)例包括在反應(yīng)中消耗的反應(yīng)物，由反應(yīng)創(chuàng)建的產(chǎn)物，促進(jìn)反應(yīng)的催化劑如酶，溶劑，鹽，緩沖劑和其它分子。

如本文所使用的，術(shù)語“排斥部分”意指將占據(jù)空間以防止或抑制空間處另一分子占據(jù)或抑制空間附近另一分子并置的分子或其部分。排斥部分可以通過空間排除，電荷排斥，疏水-親水排斥或其它力起作用。

如本文所使用的，術(shù)語“終止劑部分”當(dāng)用于指核苷酸時(shí)，是指抑制或阻止核苷酸與第二核苷酸形成共價(jià)連接的核苷酸的一部分。例如，在具有戊糖部分的核苷酸的情況下，終止劑部分可以防止在核苷酸的3’氧和第二核苷酸的5’磷酸之間形成磷酸二酯鍵。終止劑部分可以是作為存在于核酸聚合物中的單體單元的核苷酸的一部分，或者終止劑部分可以是游離核苷酸(例如核苷酸三磷酸)的一部分。作為核苷酸的一部分的終止劑部分可以是可逆的，使得可以修飾終止劑部分以使核苷酸能夠形成與第二核苷酸的共價(jià)連接。在具體的實(shí)施方案中，終止劑部分，如可逆終止劑部分，可以附著到核苷酸類似物的戊糖部分的3’位置或2’位置。

如本文所使用的，術(shù)語“固體支持物”是指不溶于水性液體的剛性基底。基底可以是無孔的或多孔的?；卓梢匀芜x地能夠吸收液體(例如由于孔隙率(porosity))，但是通常將具有足夠的剛性，使得當(dāng)吸收液體時(shí)基底不會(huì)實(shí)質(zhì)性膨脹，并且當(dāng)通過干燥除去液體時(shí)基底不會(huì)實(shí)質(zhì)性收縮。無孔固體支持物通常對(duì)液體或氣體是不可滲透的。示例性的固體載體包括但不限于玻璃和改性或功能化玻璃，塑料(包括丙烯酸類(acrylics)，聚苯乙烯(polystyrene)和苯乙烯和其它材料的共聚物，聚丙烯，聚乙烯，聚丁烯，聚氨酯，teflon^tm，環(huán)烯烴，聚酰亞胺等)，尼龍，陶瓷，樹脂，zeonor，二氧化硅(silica)或基于二氧化硅的材料，包括硅和改性硅，碳，金屬，無機(jī)玻璃，光纖束和聚合物。對(duì)于一些實(shí)施方案，特別有用的固體支持物位于流動(dòng)池裝置內(nèi)。下面進(jìn)一步詳細(xì)闡述示例性流動(dòng)池。

如本文所使用的，術(shù)語“類型”(或“種類”)用于鑒定具有相同化學(xué)結(jié)構(gòu)的分子。例如，核苷酸的混合物可以包括幾個(gè)dctp分子。dctp分子將被理解為彼此相同的類型或種類。類似地，具有相同核苷酸序列的單個(gè)dna分子是相同類型或種類。

可以根據(jù)上述定義來理解以下闡述的并且在權(quán)利要求書中記載的實(shí)施方案。

本公開提供了可用于在應(yīng)用中的單分子檢測(cè)的裝置，組合物和方法，如在核酸測(cè)序程序中檢測(cè)的核苷酸摻入事件。本文列出的裝置，組合物和方法特別可用于例如單分子核酸測(cè)序反應(yīng)，如合成測(cè)序。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本文列出的裝置，組合物和方法可用于任何其它合適的檢測(cè)方案，包括但不限于單分子檢測(cè)。

本公開提供了第一核酸測(cè)序方法。該方法可以包括以下步驟：(a)提供拴系到固體支持物電荷傳感器的聚合酶；(b)提供一種或多種經(jīng)標(biāo)記的核苷酸，由此當(dāng)標(biāo)記物接近電荷傳感器時(shí)，電荷傳感器可以檢測(cè)標(biāo)記物的存在；和(c)檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的核苷酸對(duì)與模板核酸互補(bǔ)的新生鏈中的摻入。

在第一核酸測(cè)序方法中使用的聚合酶可以用包含核酸的系鏈附著到固體支持物電荷傳感器。例如，系鏈可以包括脫氧核糖核酸(dna)，核糖核酸(rna)或蛋白質(zhì)核酸(pna)。

在第一核酸測(cè)序方法的一些實(shí)施方案中，經(jīng)標(biāo)記的核苷酸在核苷酸的γ-磷酸位置標(biāo)記。標(biāo)記物可以包含寡核苷酸，并且任選地，寡核苷酸能夠與固定的核酸雜交。

進(jìn)一步任選地，在第一核酸測(cè)序方法中使用的固定化核酸是系鏈的一部分，該系鏈將聚合酶固定到固體支持物電荷傳感器。

在第一核酸測(cè)序方法的一些配置(configuration)中，聚合酶保持在與電荷傳感器小于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1nm的接近性中(polymeraseisheldinproximityoflessthan10,9,8,7,6,5,4,3,2,or1nmtothechargesensor)。

在第一核酸測(cè)序方法的一些實(shí)施方案中，在摻入后例如通過聚合酶從核苷酸切割標(biāo)記物。

任選地，在第一核酸測(cè)序方法中，一個(gè)或多個(gè)經(jīng)標(biāo)記的核苷酸包含多個(gè)電荷標(biāo)簽。例如，一種或多種經(jīng)標(biāo)記的核苷酸可以包含四種類型核苷酸中的每一種的獨(dú)特電荷標(biāo)簽。電荷標(biāo)簽可以是負(fù)電荷標(biāo)簽，例如，包括下列一種或多種：磷酸基團(tuán)，dmt和/或fmoc?；蛘?，電荷標(biāo)簽可以是正電荷標(biāo)簽，任選地包含伯胺。

第一核酸測(cè)序方法中的一個(gè)或多個(gè)經(jīng)標(biāo)記的核苷酸可以包括能夠與多個(gè)固定的系鏈序列雜交的多個(gè)不同的寡核苷酸(即寡核苷酸部分)。或者或另外，多種不同的寡核苷酸可以能夠與用于固定聚合酶的特定系鏈內(nèi)的多個(gè)不同位置雜交。

在第一核酸測(cè)序方法的一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)經(jīng)標(biāo)記的核苷酸包含4個(gè)不同的電荷標(biāo)簽，并且每個(gè)所述經(jīng)標(biāo)記的核苷酸包含能夠與相同的固定的系鏈序列雜交的寡核苷酸。

在第一核酸測(cè)序方法的一些實(shí)施方案中，聚合酶系鏈和標(biāo)記核苷酸上的標(biāo)記物包含彼此互補(bǔ)結(jié)合的脫氧核糖核苷酸，彼此互補(bǔ)結(jié)合的核糖核苷酸或與核糖核苷酸互補(bǔ)結(jié)合的脫氧核糖核苷酸。例如，聚合酶系鏈和經(jīng)標(biāo)記的核苷酸上的標(biāo)記物可以形成dna:dna雙鏈體，rna:rna雙鏈體或dna:rna異雙鏈體。脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸可以是增加或修飾雙鏈體穩(wěn)定性的核苷酸類似物。例如，可以使用2’-o-甲基(2’-o-me)或2’-氟(2’-f)修飾的核糖核苷酸。已2’-o-me和2’-frna修飾使rna:rna雙鏈體的解鏈溫度每堿基對(duì)增加0.5℃至1℃，但是僅導(dǎo)致rna:dna穩(wěn)定性的小變化(majlessi等人,nucleicacidsres.26:2224-9(1998)，通過引用并入本文)。修飾的rna:rna堿基對(duì)的穩(wěn)定性的增加可以用于沿著rna系鏈精確定位標(biāo)簽，如下所討論。

此外，電荷傳感器可以用捕獲寡核苷酸功能化，并且經(jīng)標(biāo)記的核苷酸可以包括在第一核酸測(cè)序方法中與一個(gè)或多個(gè)捕獲寡核苷酸雜交的寡核苷酸標(biāo)記物。

在第一核酸測(cè)序方法中使用的電荷傳感器可以包括納米線fet。任選地，電荷傳感器包括碳納米管。

第一核酸測(cè)序方法中的電荷傳感器可以是電荷傳感器陣列的一部分。

第一種核酸測(cè)序方法的檢測(cè)步驟可以包括連續(xù)檢測(cè)多個(gè)摻入事件。

本文所述的方法和裝置可以提供長的核酸測(cè)序讀段；快速讀段；高通量測(cè)序能力；和可縮放(scalable)的測(cè)序平臺(tái)。在一些實(shí)施方案中，由于本文所闡述的方法和裝置提供并行執(zhí)行的讀段次數(shù)中的通量的能力，可以通過執(zhí)行多個(gè)重疊讀段來減輕單個(gè)讀取精確性的任何損害。

在圖1中顯示示例性傳感器。這里，聚合酶1創(chuàng)建反應(yīng)位點(diǎn)，其中核苷酸可以被摻入引發(fā)的dna模板4中。聚合酶1通過系鏈3附著到納米線fet2上。該裝置提供單分子靈敏度。在反應(yīng)位點(diǎn)的電荷分布的變化(例如聚合酶構(gòu)象變化，核苷酸摻入，帶電標(biāo)簽的到達(dá)或離開，聚合酶與電荷傳感器的接近性的變化等)傳遞到門級(jí)并且可以被檢測(cè)。

在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的裝置或方法使用深度縮放的finfet晶體管作為單分子電荷傳感器。finfet傳感器受益于前沿半導(dǎo)體制造商已經(jīng)在開發(fā)的技術(shù)。此外，可以使用先前公開的組分，包括但不限于(1)用于在cnt上固定溶菌酶以實(shí)時(shí)觀察酶持續(xù)合成能力(processivity)的那些，如choi等，science,335,319(2012)中描述，(2)用于將pol1klenow片段固定在cnt上并實(shí)時(shí)觀察dna持續(xù)合成能力的那些，如olsen等人，j.amer.chem.soc.,135,7885(2013)中描述，(3)用于闡明由于蛋白質(zhì)變構(gòu)運(yùn)動(dòng)而移動(dòng)帶電荷殘基的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的那些，如chi等人，nanolett13,625(2013)中所述。本方法還可以采用美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2013/0078622a1中所述的裝置，裝置的部件和方法。每個(gè)上述參考文獻(xiàn)通過引用并入本文。

美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2013/0078622a1中列出的裝置和方法在50-100mmnacl中提供1-2nm的debye篩選長度。在該裝置中，變構(gòu)運(yùn)動(dòng)必須接近聚合酶與晶體管的附著點(diǎn)。另外，變構(gòu)運(yùn)動(dòng)必須是堿基依賴性的，以使得能夠?qū)崟r(shí)區(qū)分不同類型的核苷酸。以前尚未證明這種分辨率。

在圖2中顯示可以用于克服利用基于變構(gòu)的檢測(cè)的一些裝置的限制的實(shí)施方案。這里，聚合酶可以固定到電荷傳感器，如單壁碳納米管，硅納米線或finfet。固定可以通過包括dna，rna，pna或其類似物的系鏈。為了方便演示，該圖顯示了栓系到電荷傳感器的四種聚合酶，每種聚合酶也結(jié)合不同的γ-磷酸經(jīng)標(biāo)記的核苷酸類型。如所示，核苷酸具有附著到γ-磷酸的寡核苷酸部分。與靶核酸的模板鏈正確匹配的β-或γ-磷酸經(jīng)標(biāo)記的核苷酸通過也與模板結(jié)合聚合酶保持就位(heldinplace)，所述模板足夠長以使寡核苷酸部分暫時(shí)雜交到系鏈(例如經(jīng)由watson-crick堿基互補(bǔ)性)。雜交使寡核苷酸部分干擾電荷傳感器周圍的場，所述電荷傳感器由于通過電荷傳感器的晶體管電流的變化，產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。該圖顯示了進(jìn)入電荷傳感器的1-2nm內(nèi)的場的寡核苷酸部分。正確匹配的β-或γ-磷酸經(jīng)標(biāo)記的核苷酸將被摻入與模板核酸雜交的新生鏈。繼而，這將斷裂β磷酸和新?lián)饺氲暮塑账嶂g的鍵。結(jié)果，寡核苷酸部分(無論連接在核苷酸的β或γ位置)是自由的，以從系鏈中去雜交并且遠(yuǎn)離電荷傳感器擴(kuò)散開來，從而使傳感器周圍的場返回到其非擾動(dòng)狀態(tài)。當(dāng)電荷傳感器周圍的場被干擾并分別返回到非擾動(dòng)狀態(tài)時(shí)，信號(hào)的出現(xiàn)和消失可以與核苷酸對(duì)靶核酸的新生鏈中的摻入相關(guān)。

具體實(shí)施方案可以利用γ-磷酸經(jīng)標(biāo)記的核苷酸與聚合酶和系鏈的協(xié)同結(jié)合。寡核苷酸部分:系鏈復(fù)合物的穩(wěn)定性可以相對(duì)低，使得不形成復(fù)合物用于γ-磷酸鹽經(jīng)標(biāo)記的核苷酸，其也不與聚合酶結(jié)合(即在溶液中游離的γ-磷酸鹽經(jīng)標(biāo)記的核苷酸基本上不結(jié)合系鏈)。然而，核苷酸部分對(duì)聚合酶的親和力和寡核苷酸部分對(duì)系鏈的親和力的協(xié)同效應(yīng)加起來總體上允許實(shí)質(zhì)性的結(jié)合親和力。在一些實(shí)施方案中，協(xié)同效應(yīng)可以利用核苷酸標(biāo)記物和系鏈之間的特異性結(jié)合親和力以及由非特異性結(jié)合相互作用產(chǎn)生的弱親和力的組合。例如，特異性結(jié)合可由標(biāo)準(zhǔn)watson-crick堿基配對(duì)產(chǎn)生，而非特異性結(jié)合相互作用可由混雜堿基(例如肌苷)與天然核苷酸的相互作用產(chǎn)生。因此，當(dāng)γ-磷酸經(jīng)標(biāo)記的核苷酸在摻入期間結(jié)合到聚合酶時(shí)，發(fā)生協(xié)同結(jié)合，這極大地增加了寡核苷酸部分和系鏈之間的相互作用的穩(wěn)定性。在酶切割γ磷酸之后，協(xié)同效應(yīng)喪失，并且寡核苷酸部分將從系鏈解離。

在模板鏈的每個(gè)位置摻入新生鏈中的核苷酸的類型可以基于摻入每種類型的核苷酸的標(biāo)記物的獨(dú)特性質(zhì)來確定。例如，四種類型的dntp可以通過寡核苷酸部分與系鏈雜交的位置，寡核苷酸部分的長度和/或標(biāo)記物上帶電荷部分的存在來區(qū)分。圖2提供了使用2個(gè)電荷標(biāo)簽(除了寡核苷酸部分的帶負(fù)電荷的磷酸外)和兩個(gè)系鏈雜交位置實(shí)現(xiàn)四種狀態(tài)區(qū)分的實(shí)例。特別地，dctp用帶負(fù)電荷的外在部分獨(dú)特標(biāo)記，dttp用帶正電荷的外在部分獨(dú)特標(biāo)記，datp和dgtp基于不存在任何外在電荷部分與其它兩種核苷酸類型區(qū)別，并且datp與dgtp區(qū)別，基于當(dāng)它們與系鏈雜交時(shí)寡核苷酸部分與電荷傳感器的差異接近性。

應(yīng)當(dāng)理解，可以基于正電荷部分，負(fù)電荷部分和/或系鏈雜交位置的多種組合中的任一種來區(qū)分不同的核苷酸類型?；蛘呋蛄硗?，用于區(qū)分不同類型的核苷酸的電荷部分可以在電荷的強(qiáng)度方面不同，即使電荷具有相同的符號(hào)。另外，圖3中顯示的示例性配置提供了基于單一系鏈雜交位置和四個(gè)不同電荷部分的四態(tài)辨別。具體地，dgtp和dctp都含有將它們與datp和dttp區(qū)分開的帶負(fù)電荷的部分，并且dgtp可以由于可區(qū)別地高于dctp上的電荷的電荷而與dctp區(qū)分開。類似地，由于與dttp部分相比datp部分的更高的正電荷，datp和dttp可以彼此區(qū)分。

如本文中先前所述，可以通過使用具有核糖核苷酸的系鏈和具有2’-o-me和2’f修飾的rna堿基的核苷酸標(biāo)記物增強(qiáng)沿著系鏈在特異性雜交位置處的標(biāo)簽放置精密度。替代配置可以使用含有2’-o-me和2’f修飾的核糖核苷酸的系鏈及具有核糖核苷酸的標(biāo)記物，或者系鏈和標(biāo)記物兩者都可以包含天然核糖核苷酸和2’-o-me和2’f修飾的核糖核苷酸的混合物。盡管可以使用主要由rna組成的系鏈和/或寡核苷酸部分，但可能期望使用基于dna或基于pna的系鏈和/或寡核苷酸以避免與rna相關(guān)的核酸酶敏感性。例如，基于dna或基于pna的系鏈和/或寡核苷酸可包括天然核糖核苷酸或非天然核糖核苷酸類似物，以實(shí)現(xiàn)本文中列出的結(jié)合優(yōu)勢(shì)，同時(shí)降低不想要的核酸酶消化的風(fēng)險(xiǎn)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，系鏈可以包括與核苷酸標(biāo)記物中的核糖核苷酸互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)脫氧核糖核苷酸，或者備選系鏈可以包括與核苷酸標(biāo)記物中的脫氧核糖核苷酸互補(bǔ)的核糖核苷酸。

將聚合酶附著到電荷傳感器的系鏈可以具有不同核苷酸類似物的不同結(jié)合位置，如本文中的幾個(gè)示例性實(shí)施方案中列出的。兩個(gè)或更多個(gè)核苷酸類似物的結(jié)合位置可以重疊，或者它們可以是離散的，沒有重疊。例如，如圖10中所示，atp和gtp類似物的結(jié)合位點(diǎn)在系鏈上重疊2個(gè)核苷酸(即在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)之間有1個(gè)核苷酸偏移)。為了說明的目的，將系鏈序列描繪為一系列通用的“n”核苷酸?？梢愿鶕?jù)互補(bǔ)性和期望的雜交強(qiáng)度和特異性的規(guī)則使用多種序列中的任一種。也如圖10中所示，系鏈上的atp和ttp的結(jié)合位點(diǎn)沒有重疊，是離散的并且以1個(gè)核苷酸分開。根據(jù)系鏈的長度，結(jié)合位點(diǎn)的長度和寡核苷酸部分在核苷酸類似物上的長度，系鏈上的一些，全部或無連接位點(diǎn)可以重疊。

核苷酸類似物的寡核苷酸部分可以具有與系鏈上的互補(bǔ)序列特異性雜交的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸部分還可以包括非特異性結(jié)合系鏈的混雜核苷酸位置。此類位置可以提供寡核苷酸部分和系鏈之間的弱相互作用，其促進(jìn)特定雜合物結(jié)構(gòu)的形成。例如，如圖11中所示，寡核苷酸部分可以包括幾個(gè)肌苷(i)，已知所述肌苷與dna的所有四種天然核苷酸混雜地(盡管弱地)結(jié)合。寡核苷酸部分和系鏈可以通過寡核苷酸部分中的肌苷與系鏈中的天然核苷酸之間的相互作用形成弱復(fù)合物。這可以允許序列的特異性部分(例如，在圖中指示為abc及其互補(bǔ)物a’b’c’)比缺乏弱復(fù)合物的形成在擴(kuò)散需要時(shí)它們會(huì)具有的情況更快地締合。此外，一旦形成了特異性復(fù)合物，肌苷可提供進(jìn)一步的穩(wěn)定性。

圖11中的示例性寡核苷酸部分包括在特定序列兩側(cè)側(cè)翼的混雜核苷酸位置。然而，應(yīng)當(dāng)理解，一個(gè)或多個(gè)混雜核苷酸位置可以僅位于特定序列的5’或3’側(cè)?；祀s核苷酸位置的其它實(shí)例包括通過簡并寡核苷酸合成形成的那些或與本領(lǐng)域已知與2種或更多種類型的核苷酸混雜雜交的其它核苷酸類似物形成的那些。

在圖10和圖11中顯示的實(shí)例以及本文中列出的其它實(shí)例中，系鏈?zhǔn)桥c核苷酸類似物的寡核苷酸部分雜交的核酸。應(yīng)當(dāng)理解，其它結(jié)合配偶體可以用作系鏈和標(biāo)記物部分而不是核酸。結(jié)合位點(diǎn)可以是離散的或重疊的，如上文針對(duì)核酸所舉例說明的。此外，結(jié)合位點(diǎn)可以包括弱的、非特異性相互作用配偶體以及較強(qiáng)的、特異性相互作用配偶體的組合。

本文中列出的幾個(gè)實(shí)施方案已經(jīng)舉例說明了具有不同長度的寡核苷酸部分的多種不同核苷酸類似物的用途。在此類實(shí)施方案中，可以基于寡核苷酸部分的不同長度區(qū)分不同的核苷酸類型。或者，不同的核苷酸類似物可以具有相同長度的寡核苷酸部分。然而，與其它核苷酸類似物結(jié)合的區(qū)域相比，每個(gè)核苷酸類似物可以具有結(jié)合系鏈的不同區(qū)域的特異性結(jié)合序列。示例性配置在圖12中顯示，其中聚合酶與不同核苷酸類似物的結(jié)合使聚合酶處于四種可區(qū)分的狀態(tài)之一。用于atp類似物的寡核苷酸部分結(jié)合系鏈上最靠近系鏈對(duì)聚合酶的附著點(diǎn)的位置，用于ttp類似物的寡核苷酸部分結(jié)合系鏈上距離系鏈對(duì)聚合物的附著點(diǎn)最遠(yuǎn)的位置，并且用于gtp和ctp類似物的寡核苷酸部分分別結(jié)合系鏈上距其它兩種核苷酸類似物的結(jié)合位點(diǎn)的中間距離的位置。因此，不同核苷酸類似物與聚合酶的結(jié)合將使聚合酶位于離電荷傳感器不同的距離(例如引起不同大小的環(huán)在系鏈中形成，如圖中顯示)?？梢曰趯?duì)聚合酶與傳感器的不同距離產(chǎn)生的信號(hào)的差異來區(qū)分不同的核苷酸類型。在一個(gè)或多個(gè)核苷酸類似物包括電荷標(biāo)簽或其它可檢測(cè)部分(例如在核苷酸部分遠(yuǎn)端的寡核苷酸部分末端附著)的實(shí)施方案中，寡核苷酸部分和系鏈之間的結(jié)合將使可檢測(cè)部分位于距離電荷傳感器的不同距離。在這種情況下，可以基于針對(duì)可檢測(cè)部分與傳感器的不同距離產(chǎn)生的信號(hào)的差異來區(qū)分不同的核苷酸類型。

如由圖4中圖示的實(shí)施方案證明，將聚合酶附著到電荷傳感器的系鏈不需要能夠與存在于核苷酸上的標(biāo)簽雜交。相反，可以將電荷傳感器官能化以附著與檢測(cè)的一種或多種核苷酸類型互補(bǔ)的一種或多種寡核苷酸?？梢曰陔姾傻姆?hào)、電荷的強(qiáng)度、與表面附著的寡核苷酸雜交的寡核苷酸部分的長度或表面附著的寡核苷酸上寡核苷酸部分雜交的鄰近/位置、或其組合來實(shí)現(xiàn)不同核苷酸的辨別。

上文列出的幾種配置的優(yōu)點(diǎn)包括例如通過以原子精確性將電荷置于門極的1-2nm內(nèi)克服屏蔽問題(screeningissue)、通過使用電荷標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)更高水平的電流調(diào)制的能力，以及由于檢測(cè)不需要堿基特異性變構(gòu)運(yùn)動(dòng)而開放可用聚合酶的空間。

可以用于本文中列出的裝置和方法的示例性電荷標(biāo)簽是磷酸酯部分，例如，位于核酸部分的5’端。此部分可以在可用的寡核苷酸合成方案期間容易地添加，并且將在寡核苷酸部分的末端產(chǎn)生兩個(gè)帶負(fù)電荷的氧，如圖5中顯示。通過使用2-[2-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)乙基磺?；鵠乙基-(2-氰基乙基)-(n,n-二異丙基)-亞磷酰胺(獲自glenresearch，sterlingva，產(chǎn)品目錄號(hào)cpr10-1900)將dmt保護(hù)基轉(zhuǎn)化為5’磷酸基團(tuán)實(shí)現(xiàn)寡核苷酸合成期間的化學(xué)磷酸化?？梢允褂萌?2,2,2-[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)丙基氧基甲基]乙基-[(2-氰基乙基)-(n,n-二異丙基)]-亞磷酰胺(獲自glenresearch,sterlingva，產(chǎn)品目錄號(hào)10-1922-xx)，1,3-雙-[5-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)戊基酰氨基]丙基-2-[(2-氰基乙基)-(n,n-二異丙基)]-亞磷酰胺(獲自glenresearch,sterlingva，產(chǎn)品目錄號(hào)10-1920-xx)，1-[5-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)戊基酰氨基]-3-[5-芴甲氧基羰基氧基戊基酰氨基]-丙基-2-[(2-氰基乙基)-(n,n-二異丙基)]-亞磷酰胺(獲自glenresearch,sterlingva，產(chǎn)品目錄號(hào)10-1921-xx)，或oligonucleotidedendrimerswhich含有各種數(shù)目的dmt(4,4’-二甲氧基三苯甲基)或fmoc(芴基甲氧基羰基)模塊，諸如那些獲自glenresearch或圖6中顯示的模塊制備具有不同數(shù)目的負(fù)電荷的電荷標(biāo)簽系列。另一種有用的帶正電荷的部分是在合適的ph將具有單一正電荷的5’伯胺。

表i提供了可用作本文中列出的裝置或方法的標(biāo)記物的有用的修飾和電荷的列表。

表i

本公開內(nèi)容提供了用于將反應(yīng)組分附著到電荷傳感器的方法。方法可以包括以下步驟：(a)提供包含多個(gè)電荷傳感器的固體支持物，其中每個(gè)電荷傳感器具有附著多個(gè)反應(yīng)組分的能力；(b)提供含有特定類型的多個(gè)反應(yīng)組分的流體；并且(c)在下述條件下使固體支持物與流體接觸，其中(i)特定類型的多個(gè)反應(yīng)組分與多個(gè)電荷傳感器流體連通，(ii)特定類型的反應(yīng)組分的數(shù)目在流體中大于固體支持物上的電荷傳感器的數(shù)目；和(iii)來自流體的特定類型的反應(yīng)組分在導(dǎo)致固體支持物的條件下附著到電荷傳感器，其中將每個(gè)電荷傳感器附著到反應(yīng)組分中的單一一種。

在一些實(shí)施方案中，用于將反應(yīng)組分附著到電荷傳感器的方法可以包括以下步驟：(a)提供包含多個(gè)電荷傳感器的固體支持物，其中每個(gè)所述電荷傳感器具有附著多個(gè)反應(yīng)組分的能力；(b)提供含有特定類型的多個(gè)反應(yīng)組分的流體，其中特定類型的每個(gè)反應(yīng)組分與排斥部分結(jié)合；和(c)在下述條件下使所述固體支持物與所述流體接觸，其中(i)特定類型的多個(gè)反應(yīng)組分與所述多個(gè)電荷傳感器流體連通，(ii)特定類型的反應(yīng)組分的數(shù)目在流體中大于所述固體支持物上的電荷傳感器的數(shù)目；(iii)來自流體的反應(yīng)組分附著到電荷傳感器，并且(iv)結(jié)合到每個(gè)反應(yīng)組分的排斥部分防止多個(gè)反應(yīng)組分中的多于一個(gè)反應(yīng)組分附著到每個(gè)電荷傳感器。

用于將反應(yīng)組分附著到電荷傳感器的方法可以包括以下步驟：(a)提供包括多個(gè)電荷傳感器的固體支持物，其中每個(gè)電荷傳感器具有附著多個(gè)反應(yīng)組分的能力；(b)提供含有特定類型的多個(gè)反應(yīng)組分的流體；(c)在下述條件下使固體支持物與流體接觸，其中(i)特定類型的多個(gè)反應(yīng)組分與多個(gè)電荷傳感器流體連通，(ii)特定類型的反應(yīng)組分的數(shù)目在流體中大于所述固體支持物上的電荷傳感器的數(shù)目；和(iii)來自流體的特定類型的反應(yīng)組分附著到電荷傳感器，從而形成附著到來自流體的特定類型的多個(gè)反應(yīng)組分的經(jīng)修飾的電荷傳感器；和(d)從每個(gè)經(jīng)修飾的電荷傳感器中除去特定類型的一種或多種反應(yīng)組分，以留下附著到每個(gè)經(jīng)修飾的電荷傳感器的特定類型的反應(yīng)組分中的單一一種。

有用的電荷裝置包括分析裝置，其可以以允許反應(yīng)事件快速且方便轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)信號(hào)的方式，將反應(yīng)組分引入與轉(zhuǎn)導(dǎo)元件直接空間接觸?；趫鲂?yīng)晶體管(fet)的器件可以直接將反應(yīng)組分(例如聚合酶)和晶體管表面之間的相互作用轉(zhuǎn)化為可讀電信號(hào)。在標(biāo)準(zhǔn)fet中，電流沿著與兩個(gè)電極(源極和漏極)連接的導(dǎo)電路徑(通道)流動(dòng)。通過可以經(jīng)由電介質(zhì)薄層電容耦合的第三(門極)電極打開或關(guān)閉源極和漏極之間的通道電導(dǎo)。

在具體的實(shí)施方案中，fet經(jīng)配置以實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)。更具體地，這些電荷傳感器可以配置為監(jiān)測(cè)單分子反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)。通常在場效應(yīng)晶體管中發(fā)現(xiàn)的任何類型的導(dǎo)電通道可以用于本文中列出的裝置或方法中。示例性導(dǎo)電通道由金屬、金屬氧化物、半導(dǎo)體或納米級(jí)導(dǎo)體，如納米線或石墨烯形成。

對(duì)于單分子檢測(cè)特別有用的電荷傳感器是單壁碳納米管(swnt)。參見，例如staretal.,nano.lett.3,459(2003)；staretal.,org.lett.6,2089(2004)；bestermanetal.,nano.lett.3,727(2003)；gruner,anal.biooanal.chem.384,322(2005)；chenetal.proc.natl.acad.sci.u.s.a.100,4984(2003)和美國專利公開號(hào)2013/0078622a1，每篇通過引用并入本文。swnt是極小的導(dǎo)體，通常約1納米級(jí)的直徑。

可以用化學(xué)選擇性聚合物、金屬或金屬氧化物納米顆?；蚍磻?yīng)組分，如蛋白質(zhì)、核酸或抗體包被swnt。參見例如bestermanetal.,nano.lett.3,727(2003)；及chenetal.proc.natl.acad.sci.u.s.a.100,4984(2003)?？梢允褂帽疚闹辛谐龅姆椒▽蝹€(gè)反應(yīng)組分附著到這些swnt和其它電荷傳感器。

在一些實(shí)施方案中，可以通過例如使用goldsmithetal.science315,77(2007)(其通過引用并入本文)中列出的技術(shù)在電荷傳感器上創(chuàng)建一個(gè)單一共價(jià)缺陷將單個(gè)反應(yīng)組分附著到電荷傳感器。例如，可以產(chǎn)生具有單個(gè)缺陷的swnt，使得可以使用多種附著化學(xué)來選擇性將單個(gè)反應(yīng)組分與反應(yīng)性缺陷位點(diǎn)連接，而不用額外的反應(yīng)組分包被swnt的剩余部分。也可以例如使用chenetal,j.am.chem.soc.123,3838(2001)(其通過引用并入本文)中列出的技術(shù)，通過非共價(jià)手段將swnt附著到反應(yīng)組分。可以如本文中列出的那樣修改這些方法，以將單個(gè)反應(yīng)組分以非共價(jià)方式可靠地結(jié)合到swnt。

swnt是具有電子帶隙的半導(dǎo)體，所述電子帶隙可以從1電子伏特變化到有效地0。swnt可用作導(dǎo)電通道，因?yàn)閱畏肿痈袦y(cè)裝置在具有或不具有門極電極的情況下，并且在玻璃、塑料或硅基底上從任何類型的swnt線制作。在美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2013/0078622a1(其通過引用并入本文)中列出了用于單分子檢測(cè)的有用的swnt和它們的構(gòu)造。

可以修改以用于本文中列出的裝置或方法的其它電荷傳感器包括但不限于硅納米線(sinw)fet、由iii-v材料制成的fet、硅finfet、石墨烯納米帶(nanoribbon)fet以及來自其它2d材料，如mos2和硅烯(silicene)的納米帶fet，隧道fet(tfet)和陡峭的亞閾值斜率器件(參見例如swaminathanetal.,proceedingsofthe51stannualdesignautomationconferenceondesignautomationconference,pg1-6,isbn:978-1-4503-2730-5(2014)及ionescuetal.,nature479,329–337(2011))。碳納米管也可以是有用的。

可以以電荷傳感器陣列的形式提供多個(gè)電荷傳感器。陣列可以包括至少10、100、1x10³、1x10⁴、1x10⁴、1x10⁴或更多個(gè)電荷傳感器。每個(gè)單獨(dú)的電荷傳感器可以位于陣列中與陣列中的其它電荷傳感器分離的離散位置。例如，每個(gè)電荷傳感器可以駐留在固體支持物中的孔或凹陷中。這些位置(即使當(dāng)彼此分離時(shí))可以任選地與總體溶液(bulksolution)流體接觸。在此類配置中，可以通過經(jīng)由大量流體遞送將常見的試劑遞送到所有電荷傳感器在電荷傳感器陣列上發(fā)生多重反應(yīng)。以核酸測(cè)序反應(yīng)為例，可以通過總體溶液將核苷酸遞送到孔(或其它特征)的陣列，每個(gè)孔(或其它特征)容納個(gè)別的測(cè)序反應(yīng)。核苷酸遞送將導(dǎo)致在孔(或其它特征)處的平行測(cè)序反應(yīng)。

電荷傳感器(如si納米線)可具有小于10nm寬且大于100nm長的尺寸。可以將si納米線或其它電荷傳感器置于10nmx10nm，50nmx100nm或更大的孔中。例如，電荷傳感器駐留的孔可以在表面上具有至少100nm²、1000nm²、5000nm²、1x10⁴nm²或更大的開口。從電荷感測(cè)元件讀出信號(hào)的電路可以占據(jù)1微米x1微米或更大的固體支持物的面積。

在一些實(shí)施方案中，電荷傳感器將沿著整個(gè)長度具有一致的寬度。或者，電荷傳感器沿其長度可具有實(shí)質(zhì)的可變的寬度。例如，電荷傳感器可以包括相對(duì)窄的寬度的區(qū)域，類似于“夾緊”區(qū)域。夾點(diǎn)區(qū)域的寬度可以具有例如電荷傳感器的相對(duì)較大寬度的區(qū)域的直徑的75％、50％、40％、30％、20％或10％的直徑。夾點(diǎn)可以提供增加聚合酶的帶電殘基運(yùn)動(dòng)對(duì)傳感器的影響的優(yōu)點(diǎn)。另一個(gè)益處是通道制作的放松的容忍(relaxedtolerances)和fet傳感器的第一層電介質(zhì)鈍化的打開/對(duì)準(zhǔn)。例如，具有20nm直徑及10nm夾緊區(qū)域的電荷傳感器可以是特別有用的。具有夾緊區(qū)域的電荷傳感器的其它尺寸包括例如至少25、30、35或40nm或更大的直徑及至多10、20、30、40或50nm長的夾緊區(qū)域。也可以使用具有較小直徑的傳感器，例如具有至少5、10、15或20nm的直徑的那些傳感器可以具有在示例的范圍中的長度的夾緊區(qū)域。應(yīng)當(dāng)理解，在一些實(shí)施方案中，電荷傳感器的最大直徑將是50nm、40nm、30nm、20nm、10nm或更小。

可以將用于聚合酶或其它酶的系鏈附著到夾緊區(qū)域或在夾緊區(qū)域近端的點(diǎn)處。因此，可以放置系鏈以在夾緊區(qū)域附近定位聚合酶或其它酶。

在圖8中顯示了具有夾緊區(qū)域的電荷傳感器的示例性實(shí)施方式。可以經(jīng)由適當(dāng)?shù)墓饪萄谀?lithographicmask)設(shè)計(jì)制作夾緊區(qū)域，其中掩模的形狀使得它產(chǎn)生期望的夾點(diǎn)?；蛘?，在光刻圖案化期間的鄰近效應(yīng)可以用于通過將與傳感器正交的電極放置成緊密鄰近待夾緊的區(qū)域來局部夾緊電荷傳感器。在產(chǎn)生期望的夾點(diǎn)外，接近性電極(proximityelectrode)可以用于產(chǎn)生將酶定位于夾點(diǎn)區(qū)域處的電泳力。

圖9中顯示了另一個(gè)示例性實(shí)施方式。這里，使用局部氧化將夾點(diǎn)引入硅中。在第一步中，用氧化屏障(如氮化硅(sinx))包被硅線?？梢允褂镁植抗饪瘫┞豆杈€的區(qū)域以蝕刻掉氧化屏障。然后，可以氧化部分包被的線以減小暴露區(qū)域處的硅線的寬度?？梢詫?shí)施進(jìn)一步的蝕刻以暴露用于化學(xué)偶聯(lián)的硅夾點(diǎn)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，用于在電荷傳感器中產(chǎn)生夾點(diǎn)的上述方法是示例性的而非限制性的；可以利用半導(dǎo)體制造中常見的許多其它方法，例如經(jīng)由使用犧牲層、選擇性沉積和蝕刻、或額外的光刻掩模等來產(chǎn)生夾點(diǎn)。

陣列的密度可以是每平方cm為2至多達(dá)10億或更多個(gè)不同的反應(yīng)位點(diǎn)。極高密度陣列在本發(fā)明中是有用的，包括例如具有至少約10,000,000個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)/cm²，包括例如至少約100,000,000個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)/cm²、1,000,000,000個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)/cm²、直至約2,000,000,000個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)/cm²或更高的那些。也可以使用高密度陣列，包括例如在約100,000個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)/cm²至約10,000,000個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)/cm²范圍內(nèi)的那些。可用于本發(fā)明的中等密度陣列的范圍可以為約10,000個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)/cm²至約100,000個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)/cm²。低密度陣列通常小于約10,000個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)/cm²。

可以將多種反應(yīng)組分之中的任一種附著到電荷傳感器。例如，受體，如抗體或凝集素；配體，如核苷酸，表位，碳水化合物或候選藥物；核酸，如靶核酸，系鏈核酸或與本文中列出的反應(yīng)有關(guān)的列出的其它核酸；或酶，如聚合酶或其它核酸結(jié)合酶，激酶，磷酸酶，外切核酸酶，蛋白酶，或代謝酶。其它有用的反應(yīng)組分包括但不限于本文中列出或分子生物學(xué)或生物化學(xué)領(lǐng)域中已知的反應(yīng)的組分。

多重實(shí)施方案(包括例如采用電荷傳感器陣列的實(shí)施方案)可以配置成使得將單個(gè)類型的反應(yīng)部件附著到每個(gè)電荷傳感器。例如，可以將多重實(shí)施方案中的電荷傳感器基本上全部附著到聚合酶。此外，可以將相同種類的聚合酶附著到每個(gè)電荷傳感器。此配置可以提供來自每個(gè)電荷傳感器的預(yù)期的均勻輸出，但是提供與每個(gè)相應(yīng)電荷傳感器接觸的其它反應(yīng)組分的差異。可以通過提供當(dāng)將聚合酶附著到電荷傳感器時(shí)就具有單一類型的聚合酶而言均質(zhì)的流體來實(shí)現(xiàn)此類配置。

可以在本文中列出的方法或組合物中使用多種聚合酶之中的任一種，包括例如從生物系統(tǒng)分離的基于蛋白質(zhì)的酶或其功能性變體。除非另有指示，提及特定聚合酶(如下文例示的那些聚合酶)將理解為包括其功能變體。聚合酶的特別有用的功能是使用現(xiàn)有核酸作為模板催化核酸鏈的聚合。在本文中別處描述其它有用的功能。有用的聚合酶的實(shí)例包括dna聚合酶和rna聚合酶。示例性dna聚合酶包括已經(jīng)通過結(jié)構(gòu)同源性分類為鑒定為a、b、c、d、x、y和rt的家族的那些dna聚合酶。家族a中的dna聚合酶包括例如t7dna聚合酶、真核線粒體dna聚合酶γ、大腸桿菌dnapoli、棲熱水生菌(thermusaquaticus)poli、和嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillusstearothermophilus)poli。家族b中的dna聚合酶包括例如真核dna聚合酶α、δ、和ε；dna聚合酶ζ；t4dna聚合酶，phi29dna聚合酶，和rb69噬菌體dna聚合酶。家族c包括例如大腸桿菌dna聚合酶iiiα亞基。家族d包括例如源自古細(xì)菌的廣古生菌界(euryarchaeota)亞結(jié)構(gòu)域的聚合酶。家族x中的dna聚合酶包括例如真核聚合酶polβ、polσ、polλ和polμ，以及釀酒酵母(s.cerevisiae)pol4。家族y中的dna聚合酶包括例如polη、poliota、polkappa、大腸桿菌poliv(dinb)和大腸桿菌polv(umud’2c)。dna聚合酶的rt(逆轉(zhuǎn)錄酶)家族包括例如逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和真核端粒酶。示例性rna聚合酶包括但不限于病毒rna聚合酶，如t7rna聚合酶；真核rna聚合酶，如rna聚合酶i、rna聚合酶ii、rna聚合酶iii、rna聚合酶iv和rna聚合酶v；和古細(xì)菌rna聚合酶。

提供上述分類用于例示目的。應(yīng)當(dāng)理解，分類系統(tǒng)中的變化是可能的。例如，在至少一個(gè)分類系統(tǒng)中，家族c聚合酶已經(jīng)分類為家族x的亞類。此外，聚合酶可以根據(jù)其它特征(無論是功能的還是結(jié)構(gòu)的)分類，所述特征可以或可以不與上文例示的結(jié)構(gòu)特征重疊。在下文更為詳細(xì)列出了一些示例性特性。

具有固有3’-5’校對(duì)外切核酸酶活性的聚合酶可用于一些實(shí)施方案?；旧先狈?’-5’校對(duì)外切核酸酶活性的聚合酶也可用于一些實(shí)施方案，例如在大多數(shù)測(cè)序?qū)嵤┓桨钢?。外切核酸酶活性的缺乏可以是野生型特征或由變體或工程化聚合酶結(jié)構(gòu)賦予的特征。例如，外切負(fù)(exominus)klenow片段是缺乏3’-5’校正外切核酸酶活性的klenow片段的突變形式。klenow片段及其外切負(fù)變體可以用于本文中列出的方法或組合物。另一方面，a家族dna聚合酶的大片段(如bsudna聚合酶i(bsu-lf))天然缺乏3’-5’外切核酸酶功能。

具有3’至5’外切核酸酶活性的聚合酶經(jīng)歷分子內(nèi)和分子間轉(zhuǎn)換，如例如記載于lamichhaneetal.j.am.chem.soc.135:4735-4742(2013)，其通過引用并入本文。在一些實(shí)施方案中，需要使用缺乏3’至5\x26#39；核酸外切酶活性的聚合酶。例如，在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)換可以引起難以與由于聚合酶活性而發(fā)生并且用于測(cè)序或其它分析的一種或多種構(gòu)象變化區(qū)別的構(gòu)象變化。可以通過除去整個(gè)或部分的3’至5’外切核酸酶結(jié)構(gòu)域或通過將功能喪失突變引入3’至5’外切核酸酶結(jié)構(gòu)域除去3’至5’外切核酸酶活性。

可以進(jìn)一步修飾a家族dna聚合酶的大片段，如bsudna聚合酶i(bsu-lf)以用于本文中列出的方法中。天然bsu-lf不具有半胱氨酸(cys)殘基?？梢栽赽su-lf的表面可接近位置處工程化改造一個(gè)或多個(gè)cys殘基，以允許具有巰基反應(yīng)性部分的系鏈或其它接頭的方便的附著位點(diǎn)。可以通過檢查bsu-lf或其它同源a家族聚合酶的晶體結(jié)構(gòu)來確定用于引入cys突變的候選位點(diǎn)。

還可能期望工程化改造bsu-lf以引入將與電荷傳感器有利地相互作用的帶電的殘基。例如，有益的修飾是將來自klenow片段的o-螺旋指結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)殘基引入bsu-lf的相當(dāng)位置中，其最終結(jié)果是將更多的帶電荷的氨基酸引入突變體bsu-lf中。關(guān)于klenow片段的o螺旋指結(jié)構(gòu)域的位置(圖中的polixxo)和圖中的bsu-lf中要替換的位置(bsuxxx1)，參見圖7?？梢詫?duì)其它a家族聚合酶如taqdna聚合酶或bstdna聚合酶進(jìn)行類似的變化。

聚合酶可以根據(jù)其持續(xù)合成能力來表征。聚合酶可具有至少約50個(gè)核苷酸、100個(gè)核苷酸、1,000個(gè)核苷酸、10,000個(gè)核苷酸、100,000個(gè)核苷酸或更多的平均持續(xù)合成能力?；蛘?另外，如本文中所述使用的聚合酶的平均持續(xù)合成能力可以是例如至多100萬個(gè)核苷酸、100,000個(gè)核苷酸、10,000個(gè)核苷酸、1,000個(gè)核苷酸、100個(gè)核苷酸或50個(gè)核苷酸。聚合酶還可以根據(jù)其持續(xù)合成能力或核苷酸摻入的速率來表征。例如，許多天然聚合酶可以以每秒至少1,000個(gè)核苷酸的速率摻入核苷酸。在一些實(shí)施方案中，可以期望較慢的速率。例如，合適的聚合酶和反應(yīng)條件可以用于實(shí)現(xiàn)每秒至多500個(gè)核苷酸、每秒100個(gè)核苷酸、每秒10個(gè)核苷酸、每秒1個(gè)核苷酸、每10秒1個(gè)核苷酸、每分鐘1個(gè)核苷酸或更慢的平均速率。如本文中別處更為詳細(xì)列出，可以使用具有比天然存在的核苷酸更慢或更快的摻入速率的核苷酸類似物。應(yīng)當(dāng)理解，可以修飾來自多種來源中的任一種的聚合酶以增加或降低其平均持續(xù)合成能力或其平均持續(xù)合成能力速率(例如核苷酸摻入的平均速率)或兩者。因此，可以使用合適的聚合酶、核苷酸類似物、核酸模板和其它反應(yīng)條件實(shí)現(xiàn)期望的反應(yīng)速率。

根據(jù)待使用的實(shí)施方案，聚合酶可以是嗜熱的或熱可失活的。嗜熱性聚合酶通?？捎糜诟邷貤l件或熱循環(huán)條件，如用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)技術(shù)的那些聚合酶。嗜熱性聚合酶的實(shí)例包括但不限于9°ndna聚合酶、taqdna聚合酶，dna聚合酶、pfudna聚合酶、rb69dna聚合酶、koddna聚合酶和dna聚合酶。從非嗜熱性生物體分離的大多數(shù)聚合酶是熱可失活的。實(shí)例是來自噬菌體的dna聚合酶。應(yīng)當(dāng)理解，可以修飾來自多種來源之中的任一種的聚合酶以增加或降低它們對(duì)高溫條件的耐受性。熱尖峰(即，升高的溫度的短暫時(shí)間段)可以用于使陣列中的一種或多種熱可失活的聚合酶失活，同時(shí)使嗜熱性聚合酶處于活性狀態(tài)，用于隨后的反應(yīng)或用于測(cè)序反應(yīng)的后續(xù)循環(huán)。

在一個(gè)備選實(shí)施方案中，可以在電荷傳感器的多重收集間附著幾種不同類型的反應(yīng)組分。例如，可以將陣列中的電荷傳感器的第一子集附著到第一種聚合酶，并且可以將陣列中的電荷傳感器的第二子集附著到第二種聚合酶。可以使用兩種、三種或更多種聚合酶。當(dāng)不同的聚合酶對(duì)不同類型的核苷酸或不同的模板序列具有不同的特異性或敏感度時(shí)，使用不同種類的聚合酶可以是有用的。例如，當(dāng)將相同類型的核苷酸摻入核酸的新生鏈中時(shí)，不同類型的聚合酶可產(chǎn)生可由電荷傳感器檢測(cè)的可相互區(qū)分的信號(hào)。在另一個(gè)實(shí)例中，不同類型的聚合酶可以包括至少一種dna聚合酶和至少一種rna聚合酶?？梢酝ㄟ^提供流體實(shí)現(xiàn)此類配置，所述流體在將聚合酶附著到電荷傳感器時(shí)就具有多種類型的聚合酶而言是異質(zhì)的。

在一些配置中，電荷傳感器將具有附著特定類型的多于一個(gè)反應(yīng)組分的能力。例如，電荷傳感器可以具有附著多于一種聚合酶的能力。根據(jù)電荷傳感器的大小和由聚合酶占據(jù)的體積，電荷傳感器可以具有附著至少2、3、4、5、10、15、25或更多種聚合酶的能力。陣列中的多個(gè)電荷傳感器可以就是如此。如下文會(huì)更為詳細(xì)列出，可以暫時(shí)施加條件以降低電荷傳感器的容量、增加聚合酶(或其它反應(yīng)組分)的空間體積(stericbulk)、或者以其它方式有利于將單一聚合酶(或其它反應(yīng)組件)附著到單獨(dú)的電荷傳感器。再一次，可以將條件應(yīng)用于電荷傳感器的陣列。

可以使用本領(lǐng)域中已知的多種化學(xué)品之中的任一種將反應(yīng)組分附著到電荷傳感器。例如，可以使用化學(xué)接頭。在許多實(shí)施方案中，電荷傳感器的表面是sio2、al2o3、hfo2、ta2o5之一。也可以使用其它氧化物，例如來自鑭系元素組。氮化物和氮氧化合物(oxinytrides)也是可能的?？梢苑奖愕赝ㄟ^表面羥基進(jìn)行對(duì)接頭的附著。在具體的實(shí)施方案中，接頭分子包括至少第一和第二官能團(tuán)。通常，第一官能團(tuán)與電荷傳感器相互作用，并且第二官能團(tuán)與反應(yīng)組分相互作用。示例性的第一官能團(tuán)包括芘、苯、環(huán)己烷和2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌。示例性的第二官能團(tuán)是馬來酰亞胺?？梢允褂靡阎獙⒌鞍踪|(zhì)與表面或其它部分共價(jià)連接的其它化學(xué)品，如由thermofisher(waltham，ma)或sigmaaldrich(st.louis，mo)出售的那些。附著到系鏈的聚合酶上的化學(xué)基團(tuán)可以是硫醇，胺或羧基基團(tuán)。在傳導(dǎo)通道是swnt的某些實(shí)施方案中，swnt的表面是大約一個(gè)原子厚的石墨層。可以將接頭分子與一個(gè)或幾個(gè)碳原子共價(jià)連接，或者它可以通過pi-pi堆疊與swnt的側(cè)壁相互作用。

可以通過非共價(jià)連接(如在受體和配體之間形成的非共價(jià)連接)將反應(yīng)組分附著到電荷傳感器。特別有用的連接是鏈霉親合素(或其變體或類似物)和生物素(或其類似物)之間的那些連接、互補(bǔ)核酸之間的那些連接、抗體和表位之間的那些連接，等等?？梢詫⑸鲜鰧?duì)的成員分別附著到反應(yīng)組分和電荷傳感器，使得含有反應(yīng)組分的流體與具有電荷傳感器的固體支持物接觸將導(dǎo)致形成非共價(jià)鍵，該非共價(jià)鍵將反應(yīng)組分附著到電荷傳感器。

在一些實(shí)施方案中，來自流體的反應(yīng)組分附著到電荷傳感器以形成傳導(dǎo)系鏈。示例性傳導(dǎo)系鏈包括具有包括摻雜聚噻吩、聚(3,4-亞乙基二氧噻吩)、聚乙炔、聚吡咯、聚苯胺、聚芴、聚苯撐、聚芘、聚薁、聚萘、聚咔唑、聚吲哚或聚氮雜卓的結(jié)構(gòu)的那些傳導(dǎo)系鏈?？梢酝ㄟ^聚合酶的氧化實(shí)現(xiàn)這些系鏈結(jié)構(gòu)的電荷摻雜。在vernitskayaetal.russ.chem.rev.66:443ff(1997)；macdiarmid,angew.chem.,int.ed.40:2581-2590(2001)；或mcneilletal.,aust.j.chem.16:1056-75(1963)(每篇通過引用并入本文)中列出了示例性的傳導(dǎo)系鏈及其創(chuàng)建方法。

在具體的實(shí)施方案中，固體支持物可以在容器，如孔、管、通道、小杯、培養(yǎng)皿、瓶等內(nèi)或者是所述容器的部分。特別有用的容器是流動(dòng)池，例如如記載于us2010/0111768a1或bentleyetal.,nature456:53-59(2008)，每篇通過引用并入本文。示例性流動(dòng)池是可購自illumina,inc.(sandiego,ca)的那些流動(dòng)池。對(duì)于在將反應(yīng)組分附著到電荷傳感器期間或者在用電荷傳感器上的反應(yīng)組分實(shí)施的后續(xù)反應(yīng)期間將本體試劑(bulkreagents)遞送到電荷傳感器的陣列，流動(dòng)池是方便的。循環(huán)過程，如核酸測(cè)序反應(yīng)特別良好地適用于流動(dòng)池裝置。另一個(gè)特別有用的容器是多孔板或微量滴定板中的孔。

本文中列出的方法可以包括以下步驟：在下述條件下使多個(gè)電荷傳感器與含有特定類型的多個(gè)反應(yīng)組分的流體接觸，其中反應(yīng)組分與多個(gè)電荷傳感器流體連通并且反應(yīng)組分附著到電荷傳感器。結(jié)果可以是即使當(dāng)流體中的反應(yīng)組分的數(shù)目大于由流體接觸的電荷傳感器的數(shù)目時(shí)，每個(gè)電荷傳感器也被附著到反應(yīng)組分中的單一一種。預(yù)期附著到特定類型的反應(yīng)組分之一且僅之一的電荷傳感器的分?jǐn)?shù)將符合泊松分布。泊松分布為下述電荷傳感器的分?jǐn)?shù)設(shè)置37％占據(jù)的最大值，所述電荷傳感器當(dāng)將那些反應(yīng)組分遞送到本體流體中的電荷傳感器時(shí)附著到特定類型的僅單一反應(yīng)組分。然而，根據(jù)本文中列出的方法，特定類型的反應(yīng)組分(例如聚合酶或其它核酸酶)的本體流體遞送可導(dǎo)致所述多個(gè)中的大于35％、40％、50％、75％、90％、95％或99％的電荷傳感器被特定類型的單一反應(yīng)組分占據(jù)。

在方法的一些實(shí)施方案中，可以例如通過擴(kuò)散或其它被動(dòng)過程將反應(yīng)組分從本體溶液轉(zhuǎn)移到電荷傳感器。因此，反應(yīng)組分對(duì)電荷傳感器的附著可以例如根據(jù)本文中列出的或本領(lǐng)域中已知的化學(xué)品發(fā)生?；蛘撸梢岳缤ㄟ^電場(e-場)輔助轉(zhuǎn)運(yùn)將反應(yīng)組分主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)到電荷傳感器。再一次，使用本文中列出或本領(lǐng)域中已知的化學(xué)品可以得到反應(yīng)組分對(duì)電荷傳感器的附著。

可以修改本文中列出的方法以使用反應(yīng)組分到含有電荷傳感器的位點(diǎn)的電場(e-場)輔助轉(zhuǎn)運(yùn)。例如，固體支持物上的每個(gè)電荷傳感器可存在于電耦合到電源以產(chǎn)生電場的位點(diǎn)處，所述電場將聚合酶或其它反應(yīng)組分吸引到所述位點(diǎn)并且與所述位點(diǎn)處的電荷傳感器接近。用于使用e-場輔助將分析物吸引到陣列的位點(diǎn)的示例性方法和裝置記載于us2009/0032401a1，其通過引用并入本文。e-場輔助可用于本公開的方法中，例如，在下述條件下，其中多種不同聚合酶(或其它反應(yīng)組分)處于溶液中，使得聚合酶與多個(gè)電荷傳感器流體連通?？梢哉{(diào)節(jié)每個(gè)電荷傳感器的位點(diǎn)處的電荷以實(shí)現(xiàn)聚合酶(或任何其它特定類型的反應(yīng)組分)的轉(zhuǎn)運(yùn)的期望的速率或量。

在利用e-場輔助轉(zhuǎn)運(yùn)的具體實(shí)施方案中，可以貫穿用于將聚合酶(或任何其它特定類型的反應(yīng)組分)附著到電荷傳感器的反應(yīng)過程一致地應(yīng)用e-場。或者，隨著附著反應(yīng)進(jìn)行并且電荷傳感器充滿聚合酶(或任何其它特定類型的反應(yīng)組分)，可以改變(例如增加或減少)e-場。例如，增加e-場可以提供增加附著到聚合酶的電荷傳感器的數(shù)目的益處?？梢赃x擇增加e-場的速率和增加的幅度范圍，以平衡隨時(shí)間的反應(yīng)組分轉(zhuǎn)運(yùn)到電荷傳感器的增加速率與在該相同的時(shí)間段里已經(jīng)被附著到聚合酶上的電荷傳感器的增加的數(shù)目。e-場的變化速率可以基于聚合酶附著的預(yù)測(cè)或預(yù)期速率?；蛘撸梢皂憫?yīng)聚合酶附著到電荷傳感器的經(jīng)驗(yàn)檢測(cè)改變e-場，如本文中更為詳細(xì)列出。

在具體的實(shí)施方案中，可以將e-場基本上均勻地施加到具有電荷傳感器的陣列的所有位點(diǎn)。因此，溶液中的聚合酶(或其它反應(yīng)組分)將具有被轉(zhuǎn)運(yùn)到任何給定電荷傳感器的相等概率。在一個(gè)備選實(shí)施方案中，可以將e-場僅應(yīng)用于陣列中存在的電荷傳感器位點(diǎn)的子集。這樣，可以使用e-場輔助相對(duì)于其它電荷傳感器選擇性地將聚合酶(或其它反應(yīng)組分)附著到一些電荷傳感器。此外，若想要的話，可以在電荷傳感器位點(diǎn)的第一子集處施加吸引電荷，以將聚合酶轉(zhuǎn)運(yùn)到位點(diǎn)的第一子集，并且同時(shí)可以將排斥電荷施加到電荷傳感器位點(diǎn)的第二子集以抑制聚合酶被轉(zhuǎn)運(yùn)到那些位點(diǎn)或從位點(diǎn)的第二子集除去(例如通過解吸或降解)聚合酶。類似地，可以將排斥電荷施加到陣列的不含電荷傳感器的間隙區(qū)域，以抑制聚合酶被轉(zhuǎn)運(yùn)到間隙區(qū)域或從間隙區(qū)域除去(例如通過解吸或降解)聚合酶。

在許多配置中，用于電荷傳感器的放大器將占據(jù)比傳感器自身實(shí)質(zhì)性更多的空間。例如，讀出電路可以占據(jù)檢測(cè)裝置的從2x2微米到20x20微米的任何值的面積，而單一納米線晶體管可以占據(jù)小至100x500納米。在一些實(shí)施方案中，電荷傳感器陣列的大小和尺寸可以受到由多個(gè)放大器占據(jù)的空間限制，例如若每個(gè)電荷傳感器存在放大器的話。在本裝置和方法的具體實(shí)施方案中，可以通過配置電荷傳感器的陣列，使得每個(gè)放大器與幾個(gè)電荷傳感器可操作連接來克服所述限制。例如，可以將2、3、4、5、6、8、10個(gè)或更多個(gè)電荷傳感器與同一個(gè)放大器連接。因此，與在放大器和電荷傳感器之間存在一對(duì)一連接性的配置中相比，陣列上可以存在更高密度的電荷傳感器。在操作中，可以分配放大器以放大來自與其連接(或曾經(jīng)連接)的多個(gè)電荷傳感器中的僅一個(gè)的信號(hào)。例如，電荷傳感器陣列可以通過使其與包含特定類型的多個(gè)反應(yīng)組分的流體接觸來加載。此種加載技術(shù)可以導(dǎo)致大量的電荷傳感器附著到特定類型的多于一個(gè)反應(yīng)組分，并且根本不對(duì)其它電荷傳感器加載所述類型的反應(yīng)組分之任一。在與共同的放大器連接的幾個(gè)電荷傳感器中，可以將僅已經(jīng)附著到單一反應(yīng)組分的單一傳感器與其它過載(overloaded)或無載(unloaded)的其它傳感器區(qū)分開，并且可以分配放大器以從單一加載電荷傳感器獲取信號(hào)，而不從與其連接(或曾經(jīng)連接)的其它電荷傳感器獲取信號(hào)。

在一些實(shí)施方案中，單獨(dú)的電荷傳感器將具有特定類型的大于一個(gè)反應(yīng)組分的容量。以聚合酶為例，每個(gè)電荷傳感器可以具有一次附著幾種聚合酶分子的容量。在此類情況下，可以將聚合酶附著到占據(jù)空間體積的排斥部分，所述空間體積空間阻礙多于一個(gè)與另一個(gè)排斥部分結(jié)合的聚合酶附著到單獨(dú)的電荷傳感器。類似地，排斥部分可以具有靜電阻礙與另一個(gè)排斥部分結(jié)合的多于一個(gè)聚合酶附著到相同電荷傳感器的電荷極性。

特別有用的排斥部分是核酸。排斥核酸可提供空間和靜電阻礙兩者以限制占據(jù)。排斥核酸非常適合于對(duì)核酸具有結(jié)合親和力的聚合酶、核酸酶和其它反應(yīng)組分。然而，應(yīng)當(dāng)理解，這種類型的親和力不是必需的，因?yàn)楹铣煞椒梢杂糜趯⑴懦夂怂岣街椒磻?yīng)組分，例如使用本文中列出的或本領(lǐng)域中已知的接頭、系鏈和附著化學(xué)品進(jìn)行?？梢哉{(diào)節(jié)排斥核酸的長度、序列組成或二級(jí)結(jié)構(gòu)以實(shí)現(xiàn)期望的占據(jù)。例如，當(dāng)電荷傳感器對(duì)于將與電荷傳感器附著的反應(yīng)組分具有相對(duì)高的容量時(shí)，可以使用較大的核酸。較小的核酸可以足以限制較小電荷傳感器的加載(或者當(dāng)使用相對(duì)大的反應(yīng)組分或高度帶電的反應(yīng)組分時(shí)，因此僅需要排斥性質(zhì)的小增加)。核酸也可用作排斥部分，因?yàn)榭梢赃x擇核酸的序列以實(shí)現(xiàn)對(duì)聚合酶或其它核酸酶的期望的結(jié)合特性。

在一些實(shí)施方案中，排斥核酸可以被壓縮成納米球結(jié)構(gòu)。將核酸壓縮的方法是本領(lǐng)域中已知的(例如，如由bloomfield,curr.opin.struct.biol.6(3):334-41(1996)，和美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2007/0099208a1描述，每篇通過引用并入本文)。例如，可以使用醇或多胺如精胺或亞精胺。壓縮的核酸將具有比在不存在壓縮劑或壓縮條件的情況下核酸的結(jié)構(gòu)更密集壓緊的結(jié)構(gòu)，并且該結(jié)構(gòu)通常類似于球或球體。此類壓縮的核酸球的產(chǎn)生可用于創(chuàng)建排斥部分?？梢允褂酶鞣N方法來產(chǎn)生期望大小的球，例如使用各種壓縮技術(shù)和/或改變擴(kuò)增子中的拷貝數(shù)進(jìn)行。通常，壓縮的擴(kuò)增子具有范圍為約0.1μm至約5μm，例如約0.1μm、約0.2μm、約0.5μm、約1μm、2μm、約3μm、約4μm和約5μm的平均直徑或?qū)挾取?/p>

其它聚合分子也可用作排斥部分，包括但不限于聚乙二醇、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、特氟隆(teflon)、尼龍、聚酰胺、聚縮醛、聚酯、布納橡膠(bunarubbers)、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯和聚氯三氟乙烯。由固體支持物材料或凝膠制成的珠或顆粒也可以發(fā)揮排斥部分的功能。

在反應(yīng)組分參與要由與反應(yīng)組分附著的電荷傳感器檢測(cè)的特定反應(yīng)時(shí)，排斥部分可以保持附著到反應(yīng)組分。例如，在將聚合酶加載到電荷傳感器上并附著到電荷傳感器時(shí)，與聚合酶結(jié)合的排斥部分可以在由電荷傳感器檢測(cè)的隨后的核苷酸添加反應(yīng)中保持附著到聚合酶。或者，在已經(jīng)將反應(yīng)組分附著到電荷傳感器之后，可以從反應(yīng)組分中除去排斥部分。再次以聚合酶為例，可以在聚合酶參與檢測(cè)的與靶核酸的反應(yīng)前，從聚合酶中除去排斥部分，如排斥核酸。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)除去與聚合酶或其它反應(yīng)組分結(jié)合的排斥部分以導(dǎo)致除去。例如，可以通過清洗或使用結(jié)合反應(yīng)組分的其它部分的競爭性置換除去非共價(jià)結(jié)合的部分?？梢酝ㄟ^化學(xué)或物理手段(如本文中就切割系鏈而言列出的那些手段)除去共價(jià)結(jié)合的部分。一旦從反應(yīng)組分中除去，可以從保持附著反應(yīng)組分的電荷傳感器洗去排斥部分。

在一些實(shí)施方案中，可以過載具有用于特定類型的多于一個(gè)反應(yīng)組分的容量的電荷傳感器，使得將單獨(dú)的電荷傳感器附著到幾個(gè)反應(yīng)組分，然后可以從電荷傳感器除去(或失活或降解)反應(yīng)組分，從而僅留下附著到單獨(dú)電荷傳感器的單一活性反應(yīng)組分。例如，可以實(shí)施將反應(yīng)組分附著到電荷傳感器的方法，以在每個(gè)反應(yīng)組分和與其附著的電荷傳感器之間創(chuàng)建可切割的系鏈。在一些情況下，在流體中遞送的反應(yīng)組分可以包括可切割系鏈的前體，電荷傳感器可以包括可切割系鏈的前體，或者反應(yīng)組分和電荷傳感器兩者都可以具有一起起反應(yīng)以形成可切割系鏈的前體。

可以通過由于物理或化學(xué)過程所致的鍵斷裂切割可切割的系鏈。例如，本文中列出的方法可以包括通過光化學(xué)切割、電化學(xué)切割、電場、機(jī)械攪拌、化學(xué)切割或熱切割可切割的系鏈的步驟。有用的可切割系鏈及其前體包括用于修飾蛋白質(zhì)的那些，并且例如可購自thermofisher(waltham,ma),orsigmaaldrich(st.louis,mo)。

可以使用其它方法從電荷傳感器中除去一種或多種反應(yīng)組分。例如，可以通過從每個(gè)電荷傳感器降解一種或多種反應(yīng)組分實(shí)現(xiàn)除去?？梢酝ㄟ^物理方法，如熱、光氧化、超聲處理等實(shí)現(xiàn)降解?；瘜W(xué)降解也是可能的，例如使用ph變化、化學(xué)變性劑、蛋白酶等。在一些情況下，可以通過使傳感器附著的反應(yīng)組分與保護(hù)部分接觸調(diào)節(jié)降解的程度?？梢缘味ü?yīng)到電荷傳感器陣列的保護(hù)部分的量，以導(dǎo)致平均每個(gè)電荷傳感器對(duì)單一反應(yīng)組分的結(jié)合。當(dāng)隨后進(jìn)行降解時(shí)，除了附著到每個(gè)電荷傳感器的受保護(hù)的反應(yīng)組分以外的全部都將被降解。這將留下附著到每個(gè)電荷傳感器的單一反應(yīng)組分。當(dāng)保護(hù)部分參與由電荷傳感器檢測(cè)的反應(yīng)時(shí)保護(hù)部分可以保持與反應(yīng)組分結(jié)合，或者可以除去保護(hù)部分。在一些情況下，通過用化學(xué)或光化學(xué)活性寡核苷酸類似物結(jié)合聚合酶活性位點(diǎn)可發(fā)生降解?？梢詰?yīng)用化學(xué)或光化學(xué)處理以使寡核苷酸類似物與聚合酶交聯(lián)。因此，可以使這些聚合酶不能接受靶核酸或引物，或者可以使聚合酶不能構(gòu)象變化(例如開放-關(guān)閉構(gòu)象變化)，所述構(gòu)象變化將由電荷傳感器檢測(cè)。

有用的保護(hù)部分的實(shí)例是核酸，如dna納米球。例如，可以使用核酸結(jié)合聚合酶或其它核酸酶以針對(duì)變性或化學(xué)修飾提供穩(wěn)定性。核酸還可以提供空間阻斷，阻止蛋白酶接近附著到電荷傳感器的聚合酶。另一個(gè)實(shí)例是引物雜交的單鏈dna；在此情況下，引物的3’末端將與聚合酶的催化中心結(jié)合，防止反應(yīng)性聚合酶失活部分的結(jié)合。保護(hù)部分的另一個(gè)實(shí)例是蛋白質(zhì)，如特異性靶向聚合酶的抗體。蛋白質(zhì)或抗體可以防止化學(xué)修飾或提供阻止蛋白酶進(jìn)入聚合酶的空間阻斷。如果期望除去抗體，那么可以使用例如熱除去抗體。合適的溫度將是抗體不再與聚合酶穩(wěn)定結(jié)合，而是聚合酶為穩(wěn)定的溫度。本文中已經(jīng)例示的用作排斥部分的其它材料可充當(dāng)保護(hù)部分。

可以在監(jiān)測(cè)或不監(jiān)測(cè)電荷傳感器的情況下進(jìn)行來自電荷傳感器的過多反應(yīng)組分的降解、失活或除去以測(cè)定降解或除去的程度。例如，在具體的實(shí)施方案中，從經(jīng)修飾的電荷傳感器除去特定類型的一種或多種反應(yīng)組分的過程可以包括以下步驟：(i)從每個(gè)經(jīng)修飾的電荷傳感器中除去一種或多種反應(yīng)組分，(ii)監(jiān)測(cè)所述電荷傳感器以區(qū)分多個(gè)反應(yīng)組分的存在與單一反應(yīng)組分的存在，并且(iii)中斷除去以留下附著到每個(gè)經(jīng)修飾的電荷傳感器的反應(yīng)組分的單一一種?？梢酝ㄟ^檢測(cè)來自電荷傳感器的信號(hào)的變化監(jiān)測(cè)電荷傳感器的狀態(tài)。或者/另外，可使用不同的傳感器檢測(cè)電荷傳感器的表面處反應(yīng)組分的存在或缺乏。可以使用多種檢測(cè)形式中的任一種，包括例如檢測(cè)反應(yīng)組分上的熒光標(biāo)記物的熒光測(cè)定法、光學(xué)散射法、檢測(cè)發(fā)色團(tuán)的吸光度法和本領(lǐng)域中已知的與蛋白質(zhì)和其它反應(yīng)組分的檢測(cè)有關(guān)的其它分析檢測(cè)方法。

本公開的方法可以包括以下步驟：對(duì)包含至少一個(gè)電荷傳感器的固體支持物提供一種或多種靶核酸。在具體實(shí)施方案中，先前將電荷傳感器附著到將在期望的反應(yīng)中與核酸起反應(yīng)的另一反應(yīng)組分，其實(shí)例包括核酸酶，如聚合酶。在其它實(shí)施方案中，可以在將其它反應(yīng)組分(例如核酸酶或聚合酶)遞送到電荷傳感器之前或同時(shí)將靶核酸遞送到電荷傳感器。

在本公開的方法或裝置中使用的靶核酸可以由dna、rna或其類似物組成。靶核酸的來源可以是基因組dna、信使rna或來自天然來源的其它核酸。在一些情況下，可以在本文中的方法或組合物中使用之前擴(kuò)增源自此類來源的靶核酸?？梢允褂枚喾N已知的擴(kuò)增技術(shù)中的任何一種，包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)、滾環(huán)擴(kuò)增(rca)、多重置換擴(kuò)增(mda)、或隨機(jī)引發(fā)擴(kuò)增(randomprimeamplification,rpa)。應(yīng)當(dāng)理解，在本文中列出的方法或裝置中使用前靶核酸的擴(kuò)增是任選的。因此，不會(huì)在本文中列出的方法和組合物的一些實(shí)施方案中使用前擴(kuò)增靶核酸。任選地，靶核酸可以源自合成文庫。合成核酸可以具有天然dna或rna組合物或可以是其類似物。

可以衍生靶核酸的示例性生物樣品包括例如來自哺乳動(dòng)物，如嚙齒類、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、有蹄動(dòng)物、馬、綿羊、豬、山羊、牛、貓、犬、靈長類、人或非人靈長類；植物，如擬南芥(arabidopsisthaliana)、玉米、高粱、燕麥、小麥、稻、芥花(canola)或大豆；藻，如萊茵衣藻(chlamydomonasreinhardtii)；線蟲，如秀麗隱桿線蟲(caenorhabditiselegans)；昆蟲，如黑腹果蠅(drosophilamelanogaster)、蚊、果蠅、蜜蜂或蜘蛛；魚，如斑馬魚；爬行類；兩棲類，如蛙或非洲爪蟾(xenopuslaevis)；盤基網(wǎng)柄菌(dictyosteliumdiscoideum)；真菌，如卡氏肺囊蟲(pneumocystiscarinii)，紅鰭東方鲀(takifugurubripes)，酵母，釀酒酵母(saccharamoycescerevisiae)或粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)；或惡性瘧原蟲(plasmodiumfalciparum)。靶核酸還可以源自原核生物，如細(xì)菌、大腸桿菌(escherichiacoli)、葡萄球菌(staphylococci)或肺炎支原體(mycoplasmapneumoniae)；古菌(archae)；病毒，如丙型肝炎病毒、埃博拉病毒(ebolavirus)或人免疫缺陷病毒；或類病毒。靶核酸可以源自上述生物體的均質(zhì)培養(yǎng)物或群體，或者備選源自幾種不同生物體的集合，例如在群落或生態(tài)系統(tǒng)中。

靶核酸不需要源自天然來源，而是可以使用已知技術(shù)合成。例如，可以合成基因表達(dá)探針或基因型分型探針，并且用于本文中列出的方法和裝置中。

在一些實(shí)施方案中，可以作為一個(gè)或多個(gè)較大核酸的片段獲得靶核酸?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的多種技術(shù)中的任一種進(jìn)行片段化，包括例如霧化、超聲處理、化學(xué)切割、酶促切割或物理剪切。片段化也可以源自使用通過僅復(fù)制較大核酸的一部分而產(chǎn)生擴(kuò)增子的特定擴(kuò)增技術(shù)。例如，pcr擴(kuò)增產(chǎn)生具有由原始模板上的核苷酸序列的長度限定的大小的片段，所述核苷酸序列在擴(kuò)增期間側(cè)翼引物雜交的位置之間。

靶核酸群體或其擴(kuò)增子可以具有對(duì)于本文中列出的方法或裝置的特定應(yīng)用期望或適合的平均鏈長度。例如，平均鏈長度可以小于約100,000個(gè)核苷酸、50,000個(gè)核苷酸、10,000個(gè)核苷酸、5,000個(gè)核苷酸、1,000個(gè)核苷酸、500個(gè)核苷酸、100個(gè)核苷酸、或50個(gè)核苷酸?；蛘?另外，平均鏈長度可以大于約10個(gè)核苷酸、50個(gè)核苷酸、100個(gè)核苷酸、500個(gè)核苷酸、1000個(gè)核苷酸、5,000個(gè)核苷酸、10,000個(gè)核苷酸、50,000個(gè)核苷酸或100,000個(gè)核苷酸。靶核酸群體或其擴(kuò)增子的平均鏈長度可以在上文列出的最大值和最小值之間的范圍內(nèi)。

在一些情況下，可以在條件下產(chǎn)生靶核酸群體或以其它方式構(gòu)建成具有其成員的最大長度。例如，在本文闡述的方法的一個(gè)或多個(gè)步驟中使用或存在于特定組合物中的成員的最大長度可以小于約100,000個(gè)核苷酸，50,000個(gè)核苷酸，10,000個(gè)核苷酸，5,000個(gè)核苷酸，1,000個(gè)核苷酸，500個(gè)核苷酸，100個(gè)核苷酸或50個(gè)核苷酸。或者或另外，靶核酸群或其擴(kuò)增子可在條件下產(chǎn)生或以其它方式構(gòu)造成具有其成員的最小長度。例如，在本文闡述的方法的一個(gè)或多個(gè)步驟中使用或存在于特定組合物中的成員的最小長度可以大于約10個(gè)核苷酸，50個(gè)核苷酸，100個(gè)核苷酸，500個(gè)核苷酸，1000個(gè)核苷酸，5,000個(gè)核苷酸，10,000個(gè)核苷酸，50,000個(gè)核苷酸或100,000個(gè)核苷酸。群體中靶核酸的最大和最小鏈長度可以在上述最大值和最小值之間的范圍內(nèi)。

本公開提供了檢測(cè)核苷酸的方法。方法可以包括以下步驟：(a)提供栓系于固體支持物電荷傳感器的核苷酸結(jié)合蛋白(例如聚合酶)；(b)提供一種或多種經(jīng)標(biāo)記的核苷酸，由此當(dāng)標(biāo)記物接近電荷傳感器時(shí)，可以通過電荷傳感器檢測(cè)標(biāo)記物的存在；并且(c)使用電荷傳感器檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的核苷酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合。

可以基于電荷標(biāo)記物向酶的募集檢測(cè)核苷酸與核酸結(jié)合酶(如聚合酶)的結(jié)合，所述募集繼而引起附著有酶的電荷傳感器周圍的場中的可檢測(cè)的擾動(dòng)。先前在本文中列出了示例性電荷標(biāo)記物。在具體實(shí)施方案中，將電荷標(biāo)記物附著到核苷酸的β-或γ-磷酸位置。在核苷酸的β-或γ-磷酸位置處附著標(biāo)記物的優(yōu)點(diǎn)是，當(dāng)將核苷酸摻入新生鏈中時(shí)，可以通過聚合酶的催化活性除去標(biāo)記物。然而，不需要通過聚合酶活性除去標(biāo)記物。因此，可以在核苷酸上的多個(gè)位置中的任何位置附著標(biāo)記物，包括例如通過接頭與核苷酸的堿基部分(參見例如美國專利號(hào)7,427,673；7,414,116；和7,057,026和pct公開文本wo91/06678和wo07/123744中列出的核苷酸位置和接頭，每篇通過引用并入本文)。也可以在核苷酸的α-磷酸位置或核苷酸的核糖部分處附著標(biāo)記物。任選地，可以在檢測(cè)后例如通過電荷接頭的切割從核苷酸切割附著到核苷酸的多個(gè)部分之任一個(gè)的標(biāo)記物。

用于本文中列出的方法或裝置中的標(biāo)記物可以進(jìn)一步包括寡核苷酸部分。示例性寡核苷酸部分包括如本文中先前列出的dna、rna和pna。如本文中先前示例的，寡核苷酸部分可以用于與核酸系鏈或其它核酸雜交，以局部化電場擾動(dòng)，從而以電荷傳感器的期望距離發(fā)生。寡核苷酸部分可以作為核苷酸和帶電荷的部分之間的中間結(jié)構(gòu)存在。然而，電荷部分是任選的，并且不需要位于寡核苷酸部分的末端，所述寡核苷酸部分在對(duì)核苷酸的附著點(diǎn)遠(yuǎn)端。盡管本文中參照具有與核酸系鏈相互作用的寡核苷酸部分的核苷酸類似物例示了幾個(gè)實(shí)施方案，但是應(yīng)當(dāng)理解，核苷酸類似物可以具有其它接頭組分替換寡核苷酸部分。接頭組分可以包括與作為系鏈的一部分的另一成員相互作用的結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員。

在一些實(shí)施方案中，可以將不同的核苷酸類型附著到不同的標(biāo)記物。因此，源自標(biāo)記物的信號(hào)差異可用于區(qū)分不同的核苷酸類型。這對(duì)于核酸測(cè)序方法是特別有用的，其中將幾種不同類型的核苷酸以在檢測(cè)事件期間幾種不同類型的核苷酸平行存在的方式遞送至聚合酶。例如，可以使用具有四個(gè)不同電荷部分的四種不同核苷酸，如先前在本文中就圖2和圖3而言例示?；蛘?另外，標(biāo)記物部分可以含有與不同的系鏈序列雜交以在電荷傳感器處產(chǎn)生相互截然不同的信號(hào)的寡核苷酸部分。在一些實(shí)施方案中，本文中列出的方法中使用的幾個(gè)經(jīng)標(biāo)記的核苷酸將分別具有不同的電荷標(biāo)記物，但每個(gè)所述經(jīng)標(biāo)記的核苷酸將具有能夠與相同的固定的系鏈序列雜交的寡核苷酸部分。如本文中先前列出，不同的核苷酸類似物可以具有有不同長度的寡核苷酸部分，或者備選地，兩個(gè)或更多個(gè)核苷酸類似物可以具有相同長度的寡核苷酸部分。

不同的核苷酸不需要具有不同的標(biāo)記物?？梢詫⒉煌暮塑账岱謩e遞送至反應(yīng)，使得基于何時(shí)和何地遞送核苷酸的認(rèn)識(shí)區(qū)分它們。例如，測(cè)序反應(yīng)可以包括每個(gè)循環(huán)連續(xù)添加四種不同的核苷酸，在核苷酸添加之間進(jìn)行清洗。可以完成核苷酸的此種分開的遞送，無論是將不同的核苷酸獨(dú)特標(biāo)記還是一致標(biāo)記。

在具體實(shí)施方案中，可以如下進(jìn)行核酸測(cè)序的方法：(a)提供拴系到固體支持物電荷傳感器的聚合酶；(b)提供一種或多種經(jīng)標(biāo)記的核苷酸，由此當(dāng)標(biāo)記物接近電荷傳感器時(shí)，可以通過電荷傳感器檢測(cè)標(biāo)記物的存在；并且(c)使用電荷傳感器檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的核苷酸對(duì)與模板核酸互補(bǔ)的新生鏈的摻入?？梢赃B續(xù)檢測(cè)多個(gè)摻入事件以測(cè)定序列。或者，對(duì)于每個(gè)新生鏈僅檢測(cè)單一摻入事件，并且將此信息與用于新生鏈(或其與其雜交的模板)的序列的知識(shí)組合以得到序列。

在多重實(shí)施方案中，固體支持物可以包括栓系于聚合酶的多個(gè)電荷傳感器，并且方法包括以下步驟：檢測(cè)在多個(gè)聚合酶中的每個(gè)聚合酶處將經(jīng)標(biāo)記的核苷酸摻入與模板核酸互補(bǔ)的新生鏈中。在多重實(shí)施方案中使用的多個(gè)聚合酶可以任選地包括至少兩種不同類型的聚合酶?？梢赃x擇不同類型的聚合酶以在將相同類型的核苷酸摻入核酸的新生鏈中時(shí)，產(chǎn)生可由電荷傳感器檢測(cè)的可相互區(qū)分的信號(hào)。這樣，具有不同的附著的聚合酶(例如每個(gè)電荷傳感器一個(gè))的電荷傳感器陣列可以比使用僅具有附著到電荷傳感器的一類聚合酶的陣列可獲得的情形區(qū)分更大的多種核酸序列或提供更大的靈敏性。例如，當(dāng)通過兩種不同聚合酶的作用測(cè)序時(shí)，相同的模板將產(chǎn)生兩種不同的信號(hào)系列?？梢员容^或以其它方式組合使用兩個(gè)系列的信號(hào)，以提供比來自僅一類聚合酶的僅一個(gè)系列的信號(hào)可推導(dǎo)出的核苷酸序列更準(zhǔn)確的核苷酸序列。

本公開的陣列(例如，已經(jīng)通過本文中列出的方法生產(chǎn)的陣列)可以用于多種應(yīng)用中的任何一種。特別有用的應(yīng)用是核酸測(cè)序。一個(gè)例子是合成測(cè)序(sbs)。在sbs中，監(jiān)測(cè)核酸引物沿核酸模板(例如靶核酸或其擴(kuò)增子)的延伸以測(cè)定模板中的核苷酸序列。基礎(chǔ)化學(xué)過程可以是聚合(例如，如通過聚合酶催化)。在特定的基于聚合酶的sbs實(shí)施方案中，以模板依賴性方式將核苷酸添加至引物(從而延伸引物)，使得添加至引物的核苷酸的順序和類型的檢測(cè)可用于測(cè)定模板的序列。在本文中列出的陣列的不同電荷傳感器處的多個(gè)不同模板可以在下述條件下經(jīng)受sbs技術(shù)，其中針對(duì)不同模板發(fā)生的事件可以由于它們?cè)陉嚵械奶囟姾蓚鞲衅魈幍奈恢枚鴧^(qū)分。

流動(dòng)池提供用于容納陣列的方便的形式，所述陣列通過本公開的方法產(chǎn)生并且經(jīng)受sbs或牽涉循環(huán)中重復(fù)傳遞試劑的其它檢測(cè)技術(shù)。例如，為了啟動(dòng)第一sbs循環(huán)，可以使一種或多種核苷酸(任選地具有電荷標(biāo)記物)流入/流過流動(dòng)池，所述流動(dòng)池容納電荷傳感器的陣列，每個(gè)電荷傳感器具有與核酸模板結(jié)合的附著的聚合酶?？梢詸z測(cè)引物延伸引起摻入核苷酸的陣列的那些位點(diǎn)。任選地，核苷酸可以進(jìn)一步包括一旦已經(jīng)將核苷酸添加到引物就終止進(jìn)一步引物延伸的可逆終止性質(zhì)。例如，可以將具有可逆終止劑部分的核苷酸類似物添加到引物，使得不能發(fā)生隨后的延伸，直到遞送去封閉劑以除去該部分。因此，對(duì)于使用可逆終止的實(shí)施方案，可以將去封閉試劑遞送到流動(dòng)池(在檢測(cè)發(fā)生之前或之后)?？梢栽诟鱾€(gè)遞送步驟之間進(jìn)行清洗。然后，可以將該循環(huán)重復(fù)n次以將引物延伸n個(gè)核苷酸，從而檢測(cè)長度n的序列?？梢匀菀椎馗木幰耘c通過本公開的方法產(chǎn)生的陣列一起使用的示例性sbs程序和流體系統(tǒng)記載于例如bentleyetal.,nature456:53-59(2008)，wo04/018497；us7,057,026；wo91/06678；wo07/123744；us7,329,492；us7,211,414；us7,315,019；us7,405,281，和us2008/0108082，每篇通過引用并入本文。

連接測(cè)序也是有用的，包括那些記載于shendureetal.science309:1728-1732(2005)；us5,599,675；和us5,750,341的，每篇通過引用并入本文。一些實(shí)施方案可包括雜交測(cè)序方法，如記載于例如bainsetal.,journaloftheoreticalbiology135(3),303-7(1988)；drmanacetal.,naturebiotechnology16,54-58(1998)；fodoretal.,science251(4995),767-773(1995)；和wo1989/10977，每篇通過引用并入本文。在連接測(cè)序和雜交測(cè)序程序兩者中，使靶核酸(或其擴(kuò)增子)經(jīng)歷寡核苷酸遞送和檢測(cè)的重復(fù)循環(huán)?？梢匀菀椎匦薷拇祟惙椒ㄒ詸z測(cè)連接酶構(gòu)象變化或檢測(cè)電荷標(biāo)記的寡核苷酸，替換發(fā)表的方法中描述的光學(xué)標(biāo)記物的熒光檢測(cè)。

本公開的陣列(例如已經(jīng)通過本文中列出的方法產(chǎn)生)的另一個(gè)有用的應(yīng)用是基因表達(dá)分析。可以使用rna測(cè)序技術(shù)(例如稱為數(shù)字rna測(cè)序的那些技術(shù))檢測(cè)或量化基因表達(dá)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的測(cè)序方法進(jìn)行rna測(cè)序技術(shù)，如上文列出的那些技術(shù)，只是可以用本文中列出的基于電荷的檢測(cè)方法替換光學(xué)經(jīng)標(biāo)記的核苷酸的熒光檢測(cè)。還可以使用通過與陣列的直接雜交進(jìn)行的雜交技術(shù)或使用多重測(cè)定法(其產(chǎn)物在陣列上檢測(cè))來檢測(cè)或量化基因表達(dá)?？捎糜诨陉嚵械谋磉_(dá)和基因型分型分析的示例性分子生物學(xué)測(cè)定法記載于美國專利號(hào)7,582,420；6,890,741；6,913,884或6,355,431或美國專利公開號(hào)2005/0053980a1；2009/0186349a1或us2005/0181440a1，每篇通過引用并入本文?？梢酝ㄟ^用本文中列出的基于電荷的檢測(cè)技術(shù)以及任選地電荷標(biāo)記物替換光學(xué)標(biāo)記物和熒光檢測(cè)改編這些方法。

由本公開提供的核酸測(cè)序的方法可以包括以下步驟：(a)提供拴系到固體支持物電荷傳感器的聚合酶；(b)提供一種或多種經(jīng)標(biāo)記的核苷酸，由此當(dāng)標(biāo)記物接近電荷傳感器時(shí)，可以通過電荷傳感器檢測(cè)標(biāo)記物的存在，其中一種或多種經(jīng)標(biāo)記的核苷酸具有可逆的終止劑部分；(c)使用電荷傳感器檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)經(jīng)標(biāo)記的核苷酸對(duì)與模板核酸互補(bǔ)的新生鏈的摻入，從而形成可逆終止的新生鏈；(d)修飾可逆終止的新生鏈，以使所述新生鏈能夠進(jìn)一步摻入核苷酸；和(e)重復(fù)(b)至(d)以獲得模板核酸的序列。

在測(cè)序反應(yīng)中使用可逆終止的核苷酸提供了對(duì)聚合酶延伸過程的步驟控制的優(yōu)點(diǎn)，所述聚合酶延伸過程在其它情況下將是連續(xù)的。此步驟控制可用于增加新延伸的核酸鏈在可檢測(cè)狀態(tài)中花費(fèi)的時(shí)間量。例如，可以在通過聚合酶添加后，且直到通過電荷傳感器累積期望的信號(hào)量，將在可逆終止的核苷酸上的電荷標(biāo)記物保持在新生鏈上。這可以允許增加的信號(hào)收集。然后，測(cè)序過程可以通過添加去封閉劑，接著是隨后的核苷酸添加循環(huán)來進(jìn)行。

通過使用可逆終止的核苷酸賦予的步驟控制的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是使經(jīng)歷相同反應(yīng)的反應(yīng)組分的整體同步的能力。因此，可以對(duì)在電荷傳感器所在的位點(diǎn)處與多個(gè)聚合酶結(jié)合的相同核酸的多個(gè)拷貝進(jìn)行本文中列出的測(cè)序方法(例如，可以將多個(gè)聚合酶附著到單一電荷傳感器)?？梢酝ㄟ^使用可逆終止的核苷酸有效地同步用于鑒定在聚合酶活性的每個(gè)循環(huán)期間添加的核苷酸的檢測(cè)步驟。雖然可逆終止的核苷酸提供了整體檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，但是應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)將單一聚合酶附著到單獨(dú)的電荷傳感器時(shí)，可以使用采用可逆終止的核苷酸的測(cè)序方法。

可以設(shè)置測(cè)序反應(yīng)的整體以包括附著到共同電荷傳感器的多個(gè)聚合酶，其中聚合酶與具有相同模板序列的靶核酸和具有相同序列的引物(或新生鏈)結(jié)合?？梢詫⒕酆厦父街诫姾蓚鞲衅?，如本文中先前列出。然后，可以使包含相同模板序列的多個(gè)重復(fù)的一個(gè)或多個(gè)靶核酸與聚合酶接觸。例如，可以將具有模板序列的多聯(lián)體重復(fù)的靶核酸分子將遞送至特定位點(diǎn)處的聚合酶。在此情況下，形成每個(gè)重復(fù)的序列的亞基可以作為單獨(dú)的模板序列發(fā)揮功能。任選地，可以切割編碼多聯(lián)體重復(fù)的核酸以形成各自具有單一模板序列的單獨(dú)分子。然后，可以通過位點(diǎn)處的聚合酶對(duì)這些單獨(dú)的分子進(jìn)行測(cè)序。可以通過滾環(huán)擴(kuò)增(rca)創(chuàng)建編碼多聯(lián)體重復(fù)的核酸，例如，如記載于lizardietal.,nat.genet.19:225-232(1998)和美國專利申請(qǐng)公開no.2007/0099208a1，每篇通過引用并入本文。

還提供了核酸測(cè)序的方法，其包括以下步驟：(a)提供拴系到固體支持物電荷傳感器的聚合酶；(b)在下述條件下使聚合酶與模板核酸和一種或多種不同核苷酸類型接觸，其中聚合酶催化添加一種或多種核苷酸類型以形成核酸模板的核酸互補(bǔ)物，并且其中添加一種或多種不同的核苷酸類型產(chǎn)生由電荷傳感器檢測(cè)的來自聚合酶的構(gòu)象信號(hào)變化；(c)使用電荷傳感器檢測(cè)來自聚合酶的信號(hào)的變化；并且(d)測(cè)定用于添加一種或多種不同核苷酸類型的信號(hào)變化的速率、極性、幅度或時(shí)間持續(xù)，從而測(cè)定模板核酸的核苷酸序列。

在具體實(shí)施方案中，核酸模板的核苷酸序列可以基于核酸酶，如聚合酶中發(fā)生的構(gòu)象變化測(cè)定。區(qū)分與酶相互作用的每種類型的核苷酸發(fā)生的構(gòu)象變化并且測(cè)定哪些變化的序列可用于測(cè)定核酸的序列。例如，序貫添加核苷酸到新生核酸鏈的聚合酶隨著每個(gè)核苷酸添加而經(jīng)歷構(gòu)象變化。如本文中更為詳細(xì)列出的，可以使用電荷傳感器(或基于將哪個(gè)/些核苷酸以流體遞送至監(jiān)測(cè)測(cè)序的基底的知識(shí))來區(qū)分添加的每種類型的核苷酸發(fā)生的構(gòu)象變化，并且可以檢測(cè)那些變化的序列以測(cè)定核酸的序列。

可以標(biāo)記核酸酶以在其與一種或多種反應(yīng)物，如核酸或核苷酸相互作用時(shí)產(chǎn)生一種或多種指示酶的構(gòu)象變化的信號(hào)。可以構(gòu)象標(biāo)記聚合酶，使得可以通過檢測(cè)變構(gòu)電荷移動(dòng)監(jiān)測(cè)聚合酶的活性。例如，可以構(gòu)象標(biāo)記聚合酶以允許檢測(cè)指示核苷酸結(jié)合的信號(hào)、指示核苷酸對(duì)生長的核酸分子添加的信號(hào)、或指示結(jié)合和催化之間的聚合酶構(gòu)象的中間變化的信號(hào)。因此，聚合酶可包括由電荷傳感器檢測(cè)的至少一個(gè)非天然標(biāo)記物部分。可以工程化改造聚合酶以具有負(fù)電荷和正電荷，其通過變構(gòu)移動(dòng)使每單位體積的電荷變化最大化。如果此單位體積接近電荷傳感器，則可以容易地檢測(cè)到此移動(dòng)。在具體實(shí)施方案中，由電荷傳感器從構(gòu)象標(biāo)記的聚合酶檢測(cè)的信號(hào)可以區(qū)分結(jié)合事件與催化事件。然而，此類區(qū)別對(duì)于一些實(shí)施方案可能不是必需的，并且信號(hào)可以僅僅指示核苷酸的總體添加?；蛘?另外，信號(hào)可以區(qū)分正確堿基配對(duì)的核苷酸的結(jié)合與不正確堿基配對(duì)的核苷酸的結(jié)合。

可以附著到本文中列出的方法或裝置中使用的聚合酶或其它核酸酶的特別有用的標(biāo)記物部分是負(fù)電荷標(biāo)記物，其實(shí)例包括但不限于磷酸根基團(tuán)、羧基基團(tuán)、氨基酸、dmt和/或fmoc。正電荷標(biāo)記物也是有用的，包括例如伯胺。內(nèi)在標(biāo)記物，如氨基酸側(cè)鏈或天然存在的翻譯后修飾(例如磷酸化、黃素的添加，二硫化物的還原等)也可以提供可用于在本文中列出的方法或裝置中檢測(cè)的部分。

一些實(shí)施方案可以采用核苷酸類似物，其通過聚合酶以下述速率摻入多核苷酸鏈中，所述速率可測(cè)量地與通過聚合酶將另一核苷酸摻入鏈中的速率不同。另一種有用的核苷酸類似物是以下述速率與聚合酶結(jié)合的類似物，所述速率可測(cè)量地與另一個(gè)核苷酸與聚合酶結(jié)合的速率不同。以可測(cè)量地與另一個(gè)核苷酸不同的速率引起聚合酶的構(gòu)象變化的核苷酸類似物也是有用的。可相對(duì)于具有相同watson-crick堿基配對(duì)配偶體的天然核苷酸或相對(duì)于核酸合成反應(yīng)中使用的其它核苷酸來測(cè)量核苷酸類似物的結(jié)合、摻入或聚合酶構(gòu)象變化的相對(duì)速率。對(duì)于核苷酸類似物，相對(duì)速率可以更快或更慢。

根據(jù)具體實(shí)施方案，可以構(gòu)象標(biāo)記聚合酶或其它核酸酶。核酸酶的構(gòu)象標(biāo)記提供了核酸序列分析的優(yōu)點(diǎn)。下文就標(biāo)記的聚合酶而言例示構(gòu)象標(biāo)記的分子及其制備和使用的方法。應(yīng)當(dāng)理解，可以類似地制備和使用其它核酸酶，如外切核酸酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。

聚合酶在合成核酸聚合酶的過程中經(jīng)歷構(gòu)象變化。例如，聚合酶在核苷酸結(jié)合后經(jīng)歷從開放構(gòu)象到封閉構(gòu)象的構(gòu)象變化。因此，與核酸模板和生長引物結(jié)合的聚合酶處于本領(lǐng)域中稱為“開放”構(gòu)象的構(gòu)象。與核酸模板、引物和正確堿基配對(duì)的核苷酸結(jié)合的聚合酶處于在本領(lǐng)域中稱為“封閉”構(gòu)象的構(gòu)象。在更為詳細(xì)的結(jié)構(gòu)水平上，從開放構(gòu)象到閉合構(gòu)象的轉(zhuǎn)變的特征在于聚合酶內(nèi)的相對(duì)移動(dòng)，導(dǎo)致“拇指”結(jié)構(gòu)域和“指”結(jié)構(gòu)域彼此更接近。在開放構(gòu)象中，拇指結(jié)構(gòu)域與手結(jié)構(gòu)域更遠(yuǎn)，類似于手掌的打開和閉合。在各種聚合酶中，指尖端和拇指之間的距離可以在“開放”和“封閉”構(gòu)象之間變化高達(dá)30埃。指尖端和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的其余部分之間的距離也可以改變達(dá)10埃。應(yīng)當(dāng)理解，也可以發(fā)生更大的變化，并且可以在本文中列出的方法中利用，使得可以檢測(cè)到大于10埃的變化。此外，可以檢測(cè)更小的變化，包括小于約10、8、6、4或2埃的那些變化，只要距離的變化足以使用電荷傳感器可檢測(cè)。

在具體的實(shí)施方案中，可以將附著到指結(jié)構(gòu)域的電荷標(biāo)記物附著到位置376的殘基或距phi29dna聚合酶的位置376的半徑5埃內(nèi)的殘基，并且可以將附著到拇指或其它結(jié)構(gòu)域的標(biāo)記物附著到位置535、203、510、564處的殘基或距phi29dna聚合酶的這些位置的5埃半徑內(nèi)的殘基?？梢栽诟魑恢锰帲⑶沂褂妹绹鴮＠_號(hào)2011/0312529a1；美國專利號(hào)6,908,763或wo2010/068884a2(每篇通過引用并入本文)中列出的方法附著標(biāo)記物。

可以使用構(gòu)象標(biāo)記物檢測(cè)聚合酶的構(gòu)象變化(例如從開放構(gòu)象到封閉構(gòu)象)?？梢允褂萌魏螛?biāo)記物，其產(chǎn)生響應(yīng)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)、形狀或排列的變化，如在聚合酶的開放和封閉構(gòu)象之間發(fā)生的變化的電荷信號(hào)。

可以將電荷標(biāo)記物附著到聚合酶，例如，通過共價(jià)連接?；蛘?另外，可以將探針附著到接近聚合酶的另一分子，使得聚合酶中的構(gòu)象變化引起來自探針的信號(hào)的變化。例如，可以將聚合酶附著到電荷傳感器，并且電荷傳感器可以具有探針，所述探針能夠以下述方式與聚合物相互作用，使得來自探針的信號(hào)響應(yīng)聚合酶的構(gòu)象變化而改變。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可以如下將電荷標(biāo)記物以位點(diǎn)特異性方式附著于聚合酶：在聚合酶中的期望位置處引入半胱氨酸殘基，然后用具有與半胱氨酸的硫基團(tuán)特異性起反應(yīng)的部分的標(biāo)記物修飾聚合酶，示例性的反應(yīng)活性部分是反應(yīng)性馬來酰亞胺部分。也可以通過分割內(nèi)含肽(splitinteins)將標(biāo)記物引入聚合酶或其它核酸酶，如記載于yangetal.j.am.chem.soc.,131:11644–11645(2009)，其通過引用并入本文。也可以通過遺傳編碼的非天然氨基酸將標(biāo)記物引入核酸酶。一個(gè)實(shí)例記載于fleissneretal.proc.nat’l.acad.sci.usa106:21637-42(2009)，其通過引用并入本文。

在一些實(shí)施方案中，可以將一個(gè)或多個(gè)系鏈在聚合酶上的下述位置處附著到聚合酶，其中將構(gòu)象變化傳輸?shù)揭才c系鏈附著的電荷傳感器。例如，構(gòu)象變化可以引起由一個(gè)或多個(gè)傳導(dǎo)系鏈傳輸?shù)诫姾蓚鞲衅鞯臄_動(dòng)。在一些情況下，可以經(jīng)由兩個(gè)或更多個(gè)系鏈將單一聚合酶附著到電荷傳感器。在此配置中，聚合酶構(gòu)象的變化可以改變兩個(gè)或更多個(gè)系鏈的相對(duì)位置，這又可以產(chǎn)生可以由電荷傳感器檢測(cè)的場擾動(dòng)。可以使用已知的誘變方法、化學(xué)修飾或兩者將一個(gè)或多個(gè)系鏈以位點(diǎn)選擇性地附著到聚合酶。例如，可以在工程化聚合酶中作為位點(diǎn)特異性突變引入一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸，從而允許硫反應(yīng)性系鏈附著于半胱氨酸。示例性附著點(diǎn)包括本文中和美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2011/0312529a1(其通過引用并入本文)中列出的用于附著構(gòu)象標(biāo)記物的。

在本文中列出和在其它情況下在本領(lǐng)域中已知的構(gòu)象變化外，聚合酶在將核苷酸添加至新生鏈的過程中經(jīng)歷幾個(gè)轉(zhuǎn)變。可以彼此區(qū)分轉(zhuǎn)變，例如通過動(dòng)力學(xué)表征。可區(qū)別的轉(zhuǎn)變包括例如美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2011/0312529a1中列出的那些轉(zhuǎn)變。可以通過電荷傳感器檢測(cè)當(dāng)將核苷酸添加至核酸時(shí)聚合酶經(jīng)歷的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)變，例如使用任選構(gòu)象標(biāo)記的聚合酶。對(duì)由與聚合酶附著的電荷傳感器檢測(cè)的信號(hào)的基于時(shí)間的測(cè)量或動(dòng)力學(xué)測(cè)量可用于區(qū)分一個(gè)轉(zhuǎn)變與另一個(gè)。

在具體實(shí)施方案中，附著到電荷傳感器的聚合酶的基于時(shí)間的測(cè)量或動(dòng)力學(xué)測(cè)量可用于區(qū)分添加到核酸的核苷酸種類。例如，基于時(shí)間的測(cè)量或動(dòng)力學(xué)測(cè)量可以用于區(qū)分與聚合酶結(jié)合以形成美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2011/0312529a1中列出的一種或多種復(fù)合物的核苷酸種類?；蛘?另外，電荷傳感附著的聚合酶的基于時(shí)間的測(cè)量或動(dòng)力學(xué)測(cè)量可用于區(qū)分正確watson-crick堿基配對(duì)的核苷酸與同模板核酸不正確堿基配對(duì)的核苷酸的結(jié)合/或摻入。

可以通過在與實(shí)時(shí)檢測(cè)偶聯(lián)的電荷傳感器處使用試劑的非?？焖俚幕旌蟻泶龠M(jìn)使用核苷酸的基于時(shí)間的辨別或動(dòng)力學(xué)辨別的方法。根據(jù)可用的停止流動(dòng)儀器，可以在亞毫秒時(shí)間表上發(fā)生混合?？梢允褂每焖倭黧w學(xué)、主動(dòng)或被動(dòng)混合以及反應(yīng)的適當(dāng)約束(confinement)(例如混合物褶皺(mixblousing))以克服由擴(kuò)散所致的限制來實(shí)現(xiàn)試劑的快速混合。停止流動(dòng)遞送是特別有用的。停止流動(dòng)遞送使用快速的流體流動(dòng)，隨后突然停止流動(dòng)來將流體遞送到檢測(cè)位點(diǎn)。遞送的流體通常從檢測(cè)位點(diǎn)置換相等體積的流體。流體可以與固相分析物，如附著到電荷傳感器的聚合酶混合。停止流體流體遞送的死時(shí)間(deadtime)可以例如小于2毫秒(msec)。因此，死時(shí)間可以不長于2msec、1.5msec、1msec、0.8msec、0.6msec、0.5msec或0.4msec。對(duì)于有用的停止流動(dòng)和快速混合流體系統(tǒng)，參見例如chance,b.j.frank.inst.,229,613(1940)，和美國專利申請(qǐng)公開號(hào)us2013/0165328a1，每篇通過引用并入本文。

可以使用電荷傳感器附著的聚合酶的基于時(shí)間的測(cè)量或動(dòng)力學(xué)測(cè)量的順序測(cè)定由聚合酶用于合成互補(bǔ)鏈的模板核酸的序列。應(yīng)當(dāng)理解，模板鏈的序列可以從摻入正在延伸的鏈中的核苷酸序列推斷。因此，一條鏈的序列的測(cè)定應(yīng)理解為包括測(cè)定其互補(bǔ)鏈的序列。

多種核苷酸種類中的任一種可用于本文中列出的方法或組合物。例如，可以使用天然存在的核苷酸，如atp、utp、ctp、gtp、adp、udp、cdp、gdp、amp、ump、cmp、gmp、datp、dttp、dctp、dgtp、dadp、dtdp、dcdp、dgdp、damp、dtmp、dcmp、和dgmp。通常，通過dna聚合酶將dntp核苷酸摻入dna鏈中，并且通過rna聚合酶將ntp核苷酸摻入rna鏈中。在具體的實(shí)施方案中，可以通過dna聚合酶將ntp核苷酸或其類似物摻入dna中，例如在下述情況中，其中ntp或其類似物能夠通過dna聚合酶摻入dna，且其中使用ntp或其類似物的dna聚合酶轉(zhuǎn)變的速率或時(shí)間持續(xù)可以與使用另一核苷酸的dna聚合酶轉(zhuǎn)變的速率或時(shí)間持續(xù)區(qū)分開。或者，可以通過rna聚合酶將dntp核苷酸或其類似物摻入rna中，例如，在下述情況中，其中dntp或其類似物能夠通過rna聚合酶摻入rna中，并且其中使用dntp或其類似物的rna聚合酶轉(zhuǎn)變的速率或時(shí)間持續(xù)可以與使用另一核苷酸的rna聚合酶轉(zhuǎn)變的速率或時(shí)間持續(xù)區(qū)分開。另外，可以通過逆轉(zhuǎn)錄酶將dntp核苷酸或其類似物從rna模板摻入dna中，例如，在下述情況中，其中dntp或其類似物能夠通過逆轉(zhuǎn)錄酶從rna模板摻入到dna中，并且其中使用dntp或其類似物的逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)變的速率或時(shí)間持續(xù)可以與使用另一核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)變的速率或時(shí)間持續(xù)區(qū)分開。速率或時(shí)間持續(xù)的相對(duì)差異可以是速率的相對(duì)增加、持續(xù)時(shí)間的相對(duì)增加、速率的相對(duì)減少或持續(xù)時(shí)間的相對(duì)減少。

非天然核苷酸類似物也是有用的。特別有用的非天然核苷酸類似物包括但不限于產(chǎn)生聚合酶移位的可檢測(cè)地不同的速率或時(shí)間持續(xù)的那些非天然核苷酸類似物，其可與在另一核苷酸的情況下聚合酶移位的速率或時(shí)間持續(xù)區(qū)分開。例如，非天然核苷酸類似物可有用地產(chǎn)生聚合酶移位的可檢測(cè)地不同的速率或時(shí)間持續(xù)，其可與在另一核苷酸(如天然存在的核苷酸)的情況下聚合酶的相同移位的速率或時(shí)間持續(xù)區(qū)分開。可以使用的示例性核苷酸類似物包括但不限于dntpαs；ntpαs；具有hwangetal,.nucl.acidsres.34:2037-2045(2006)(通過引用并入本文)中鑒定為ics、3mn、7ai、ben、dm5、tm、2br、3br、4br、2cn、3cn、4cn、2fb、3fb、mm1、mm2和mm3的非天然核堿基的核苷酸；或具有其它非天然核堿基的核苷酸，如那些記載于patroetal.biochem.48:180-189(2009)的(通過引用并入本文)，其包括2-氨基-1-脫氮嘌呤、1-脫氮嘌呤、2-吡啶、次黃嘌呤、嘌呤、6-cl-嘌呤、2-氨基-da、2-氨基嘌呤或6-cl-2-氨基-嘌呤或具有非天然核堿基的核苷酸，如那些記載于kruegeretal.chembiol.16:242-8(2009)的(通過引用并入本文)，其包括異-g、異-c、5sics、mmo2、ds、pa、fi、fb、dz、dnb、胸腺嘧啶等排物、5-ni、dp、唑羧酰胺(azole-carboxamide)、xa、im-no、im-on、j、a*、t*。

具有5’修飾的非天然核苷酸類似物是特別有用的。非天然核苷酸類似物通常具有三磷酸酯，但可以具有更多或更少的磷酸酯。在具體實(shí)施方案中，將非天然核苷酸的α磷酸酯，β磷酸酯或γ磷酸酯中的一種或多種共價(jià)附著到除氧以外的部分。附著到磷酸酯或以其它方式存在于5’位置的部分可以提供負(fù)電荷、正電荷、金屬螯合活性或空間體積。示例性部分包括但不限于l-對(duì)映異構(gòu)體形式或r-對(duì)映異構(gòu)體形式的氨基酸，如組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸或脯氨酸；氨基基團(tuán)；螯合金屬，如鎂或錳；甲基基團(tuán)；鹵素，如溴、氯或碘；硫醇基團(tuán)；吸電子基團(tuán)；給電子基團(tuán)；芳香胺；或脂肪族胺。這些和其它部分在它們提供與聚合酶或其它核酸酶的相互作用的實(shí)施方案中可以是有利的，所述相互作用不同于酶具有的與缺少所述部分的核苷酸的相互作用。因此，可以利用在相應(yīng)核苷酸種類上的部分的存在和缺乏以在測(cè)序方法中區(qū)分核苷酸種類，例如，基于作用于核苷酸種類的核酸酶中構(gòu)象信號(hào)變化的速率、時(shí)間持續(xù)和/或強(qiáng)度。

反應(yīng)組合物或方法可以包括一種或多種核苷酸物質(zhì)。例如，用于序列分析的反應(yīng)組合物或方法可以包括能夠與正在合成的核酸模板中的四個(gè)相應(yīng)核苷酸物質(zhì)形成watson-crick堿基對(duì)的四種不同核苷酸物質(zhì)。具體實(shí)施方案可以包括至少兩種不同的核苷酸種類、至少三種不同的核苷酸種類、至少四種不同的核苷酸種類或更多。至少兩個(gè)核苷酸物質(zhì)可以是非天然核苷酸類似物，至少三個(gè)核苷酸物質(zhì)可以是非天然核苷酸類似物，或至少四個(gè)核苷酸物質(zhì)可以是非天然核苷酸類似物。因此，反應(yīng)組合物或方法可以包括天然核苷酸和非天然核苷酸類似物的混合物?；蛘?，反應(yīng)組合物可缺少天然核苷酸，取而代之僅具有非天然核苷酸類似物?？梢栽趦H通過聚合酶或其它核酸酶將非天然核苷酸類似物摻入生長的核酸中的條件下實(shí)施反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)組合物或方法可以包括在核酸模板中與不超過一個(gè)核苷酸物種堿基配對(duì)的核苷酸物質(zhì)。例如，可以下述條件下實(shí)施方法，其中在單獨(dú)的序貫反應(yīng)中使不同的核苷酸物質(zhì)與聚合酶和核酸接觸。具體地，可以在第一反應(yīng)中添加與a堿基配對(duì)的核苷酸種類，可以在第二反應(yīng)中添加與c堿基配對(duì)的核苷酸種類，可以在第三反應(yīng)中添加與t堿基配對(duì)的核苷酸種類，并且可以在第四反應(yīng)中添加與g堿基配對(duì)的核苷酸物質(zhì)。反應(yīng)稱為第一，第二，第三和第四僅僅是為了說明反應(yīng)是分開的，但這不一定限制可以在本文中列出的方法中添加的種類的順序。相反，與a，c，t或g堿基配對(duì)的核苷酸種類可以以對(duì)于方法的具體實(shí)施方案而言期望或適合的任何順序添加。通常在測(cè)序方法中，序貫添加與給定模板核酸中的四種不同核苷酸物質(zhì)堿基配對(duì)的核苷酸物質(zhì)以完成測(cè)序方法的循環(huán)。然而，應(yīng)當(dāng)理解，在一些實(shí)施方案中可以使用少于四個(gè)核苷酸添加。此外，應(yīng)當(dāng)理解，可以使用與多于一種但不超過2、3或4種核苷酸種類堿基配對(duì)的核苷酸混合物。類似地，可以使用與多于兩種但不多于3或4種核苷酸種類堿基配對(duì)的核苷酸的混合物，或者可以使用與多于三種但不超過4種核苷酸種類堿基配對(duì)的核苷酸的混合物。

多重方法也是可能的。例如，在本公開的方法中使用的固體支持物可以包括附著到聚合酶的多個(gè)電荷傳感器，可以在下述條件下使聚合酶與模板核酸和至少四種不同核苷酸類型接觸，其中聚合酶催化序貫添加核苷酸類型以形成核酸模板的核酸互補(bǔ)物；可以使用電荷傳感器檢測(cè)來自聚合酶的信號(hào)的一系列變化；并且可以為模板核酸測(cè)定核苷酸的序列。存在于固體支持物上的多個(gè)聚合酶可以包括至少兩種不同類型的聚合酶。當(dāng)將相同類型的核苷酸摻入新生核酸鏈時(shí)，不同類型的聚合酶可任選地產(chǎn)生可由電荷傳感器檢測(cè)的可相互區(qū)分的信號(hào)。區(qū)分這些可相互區(qū)分的信號(hào)可以用作測(cè)定多個(gè)核酸的序列的基礎(chǔ)。

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雖然已經(jīng)參照上面提供的實(shí)施例描述了本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明的情況下可以進(jìn)行各種修改。因此，本發(fā)明僅由權(quán)利要求書限制。