本發(fā)明涉及由含有4’-GL(4’-半乳糖基乳糖：Galβ1-4Galβ1-4Glc)的低聚半乳糖來(lái)制備以高純度含有4’-GL的組合物的方法。
背景技術(shù)：
：已知4’-GL是能夠促進(jìn)腸內(nèi)的雙歧桿菌的增殖的低聚半乳糖的主要成分。另外，該4’-GL用作分析低聚半乳糖時(shí)的指標(biāo)。含有該4’-GL的低聚半乳糖在工業(yè)上以乳糖為原料并利用通過(guò)β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)化反應(yīng)而生產(chǎn)，在不進(jìn)行純化工序等的情況下，通常低聚半乳糖本身的純度很低。一直以來(lái)，作為對(duì)低聚糖進(jìn)行純化來(lái)提高純度的技術(shù)，例如報(bào)告有葡萄糖胺寡糖的純化方法，其特征在于：將在具有羥基的高分子中導(dǎo)入羧甲基后的高分子用作色譜填充劑(專利文獻(xiàn)1)；但并未報(bào)告：對(duì)低聚半乳糖進(jìn)行純化，從而提高在低聚半乳糖的成分當(dāng)中4’-GL的純度的方法，就連作為4’-GL的標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)也不是純度很高的物質(zhì)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1：日本特公平6-55766號(hào)公報(bào)技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明要解決的問(wèn)題因此，本發(fā)明的課題是提供簡(jiǎn)便且廉價(jià)地得到4’-GL的純度高、能夠用作各種分析用的標(biāo)準(zhǔn)品的組合物的方法。用于解決問(wèn)題的方案本發(fā)明人等為了解決上述課題而進(jìn)行了深入廣泛的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)組合使用了有機(jī)溶劑的梯度洗脫和結(jié)晶化，從而可以得到4’-GL的純度高的組合物，因而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明是4’-GL高純度組合物的制備方法，其特征在于包括以下的工序(A)和工序(B)。工序(A)：將含有4’-GL的低聚半乳糖供于活性炭柱層析，使用有機(jī)溶劑水溶液進(jìn)行梯度洗脫，在該梯度洗脫中，每次增加洗脫次數(shù)時(shí)，使用有機(jī)溶劑的濃度比前一次洗脫時(shí)的濃度還高的有機(jī)溶劑水溶液。工序(B)：向在工序(A)中最終洗脫而得到的級(jí)分中添加有機(jī)溶劑，對(duì)4’-GL進(jìn)行結(jié)晶化。另外，本發(fā)明是根據(jù)上述制備方法得到的4’-GL高純度組合物。發(fā)明的效果本發(fā)明的4’-GL高純度組合物的制備方法能夠通過(guò)組合使用了有機(jī)溶劑的梯度洗脫和結(jié)晶化，從而能夠以簡(jiǎn)便的方法廉價(jià)地由含有4’-GL的低聚半乳糖制備以高純度含有4’-GL的組合物。另外，根據(jù)本發(fā)明的4’-GL高純度組合物的制備方法而得到的4’-GL高純度組合物能夠作為各種分析用的標(biāo)準(zhǔn)品使用。具體實(shí)施方式本發(fā)明的4’-GL高純度組合物的制備方法(以下稱為“本發(fā)明制備方法”)的工序(A)是如下工序：將含有4’-GL的低聚半乳糖供于活性炭柱層析，使用有機(jī)溶劑水溶液進(jìn)行梯度洗脫，在該梯度洗脫中，每次增加洗脫次數(shù)時(shí)，使用有機(jī)溶劑的濃度比前一次洗脫時(shí)的濃度還高的有機(jī)溶劑水溶液。上述含有4’-GL的低聚半乳糖只要是在低聚半乳糖中含有4’-GL的物質(zhì)就沒(méi)有特別限定，例如可以舉出：利用通過(guò)β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)化反應(yīng)而生成的低聚半乳糖等。具體而言，在利用通過(guò)β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)化反應(yīng)來(lái)生成含有4’-GL的低聚半乳糖時(shí)，只要使β-半乳糖苷酶、生成β-半乳糖苷酶的微生物作用于乳糖即可，優(yōu)選的是，為了提高低聚半乳糖中的三糖的比率，只要組合β-半乳糖苷酶和糖同化性的微生物并使其起作用即可。作為生成β-半乳糖苷酶的微生物，例如可以舉出：乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)等克魯維酵母(Kluyveromyces.)屬的微生物、獨(dú)特?cái)S孢酵母(SporobolomycesSingularis)等擲孢酵母(Sporobolomyces.)屬的微生物等。另外，還可以舉出：嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、乳鏈球菌(streptococcuslactis)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)、賴氏乳桿菌(Lactobacillusleichmannii)、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、兩歧雙岐桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)、長(zhǎng)雙岐桿菌(Bifidobacteriumlongum)、青春型雙歧桿菌等(Bifidobacteriumadolescentis)。這些微生物當(dāng)中優(yōu)選擲孢酵母屬的微生物，更優(yōu)選獨(dú)特?cái)S孢酵母，特別優(yōu)選為本申請(qǐng)人等報(bào)告的獨(dú)特?cái)S孢酵母ISK-##2B6。需要說(shuō)明的是，獨(dú)特?cái)S孢酵母ISK-##2B6是本申請(qǐng)人已于2002年4月10日以FERMP-18817保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(〒305-8566茨城縣筑波市東1丁目1番1中央第6(需要說(shuō)明的是，前述專利生物保藏中心是平成25年4月1日開始新名稱獨(dú)立行政法人產(chǎn)品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專利生物保藏中心，新住所遷移至〒292-0818千葉縣木更津市上總鐮足2丁目5番8120號(hào)室。))。另外，作為獨(dú)特?cái)S孢酵母，可以適宜使用上述獨(dú)特?cái)S孢酵母ISK-##2B6的親株的獨(dú)特?cái)S孢酵母JCM5356，該菌株可從理化學(xué)研究所生物資源中心(〒305-0074日本國(guó)茨城縣筑波市高野臺(tái)3-1-1)買到。這些微生物可以單獨(dú)使用1種也可以組合2種以上使用。作為上述糖同化性的微生物，例如可以舉出：通常作為面包酵母市售的釀酒酵母(SaccharomycesCerevisiae)、單孢釀酒酵母(Saccharomycesunisporus)等。這些微生物可以單獨(dú)使用1種也可以組合2種以上使用。另外，糖同化性的微生物所同化的糖沒(méi)有特別限定，為了提高低聚半乳糖中的三糖的比率而優(yōu)選為對(duì)葡萄糖進(jìn)行同化的微生物。作為使用上述微生物來(lái)生成含有4’-GL的低聚半乳糖的條件，沒(méi)有特別限定，例如可以舉出：向?qū)⑹谷樘侨芙舛玫降乃訜嶂?0℃左右的液體中添加生成β-半乳糖苷酶的微生物以及根據(jù)所需添加糖同化性的微生物，一邊攪拌一邊培養(yǎng)1天左右的條件等。生成β-半乳糖苷酶的微生物的添加量沒(méi)有特別限定，例如，只要以相對(duì)于乳糖1kg、β-半乳糖苷酶活性成為100～600U的方式添加即可。另外，糖同化性的微生物的添加量也沒(méi)有特別限定，例如，作為該微生物的干燥粉體，以相對(duì)于乳糖1kg成為0.0001～10質(zhì)量％(1×107～1×1012cfu)的方式添加即可。β-半乳糖苷酶活性的測(cè)定方法與后述的制造例相同。需要說(shuō)明的是，該低聚半乳糖的生成反應(yīng)可以通過(guò)例如加熱至85℃左右并將其維持10分鐘左右而使反應(yīng)結(jié)束。另外，反應(yīng)結(jié)束后優(yōu)選通過(guò)離心分離、過(guò)濾除去菌體。關(guān)于活性炭柱層析，在填充了活性炭的柱中負(fù)載含有4’-GL的低聚半乳糖，使用有機(jī)溶劑水溶液對(duì)其進(jìn)行梯度洗脫即可。在上述柱中填充的活性炭的種類沒(méi)有特別限定，為例如粉末、顆粒、破碎狀態(tài)的活性炭。另外，在柱中填充活性炭的方法沒(méi)有特別限定，例如將在活性炭中添加水而制成的漿料填充至柱中，進(jìn)行靜置即可。進(jìn)而，在柱中填充的活性炭的量沒(méi)有特別限定，例如為使用的柱的內(nèi)容量的1/3～1/4量。使用的柱的材質(zhì)沒(méi)有特別限定，例如可以使用玻璃制、塑料制等的柱，其直徑和高度也沒(méi)有特別限定，例如可以使用直徑為2～15cm、高度為30～100cm的柱。使用了有機(jī)溶劑的梯度洗脫通過(guò)每次增加洗脫次數(shù)時(shí)使用有機(jī)溶劑的濃度比前一次洗脫時(shí)的濃度還高的有機(jī)溶劑水溶液來(lái)進(jìn)行。具體而言，首先，將水通入活性炭柱中進(jìn)行清洗。其次，通入有機(jī)溶劑水溶液，之后通入有機(jī)溶劑的濃度比前一次洗脫時(shí)的濃度還高的有機(jī)溶劑水溶液。用濃度不同的有機(jī)溶劑水溶液進(jìn)行2次以上將該有機(jī)溶劑水溶液通入活性炭柱中的操作稱為梯度洗脫，優(yōu)選的通液次數(shù)為2次。另外，在1次洗脫(通液操作)中使用的有機(jī)溶劑水溶液的量沒(méi)有特別限定，例如是所使用的活性炭體積的2～6倍量。進(jìn)而，梯度洗脫的速度也沒(méi)有特別限定，例如為洗脫液的液面以2～6cm/分鐘移動(dòng)的速度。在上述工序(A)中使用的有機(jī)溶劑的種類沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為具有極性的有機(jī)溶劑，更優(yōu)選為碳數(shù)1～3的醇，特別優(yōu)選為甲醇。作為該有機(jī)溶劑的濃度優(yōu)選為5～40質(zhì)量％(以下簡(jiǎn)稱為“％”)、特別優(yōu)選為10～30％。具體而言，使用有機(jī)溶劑水溶液的梯度洗脫優(yōu)選為依次進(jìn)行有機(jī)溶劑的濃度為5～25％的有機(jī)溶劑水溶液、10～40％的有機(jī)溶劑水溶液的洗脫；更優(yōu)選為依次進(jìn)行有機(jī)溶劑的濃度為10～20％的有機(jī)溶劑水溶液、15～30％的有機(jī)溶劑水溶液的洗脫；特別優(yōu)選為依次進(jìn)行有機(jī)溶劑的濃度為15～20％的有機(jī)溶劑水溶液、20～30％的有機(jī)溶劑水溶液的洗脫。在上述各操作之間可以進(jìn)行過(guò)濾、離心分離、通過(guò)減壓等的濃縮、稀釋。另外，對(duì)于在該工序(A)中最終洗脫而得到的級(jí)分而言，可以保持原樣，但優(yōu)選預(yù)先進(jìn)行濃縮而使固體成分干固。通過(guò)以上說(shuō)明的工序(A)而特異性地洗脫低聚半乳糖中所含的三糖。需要說(shuō)明的是，低聚半乳糖中的三糖的比率可以通過(guò)后述的制造例中所述的方法進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明制備方法的工序(B)是向在工序(A)中最終洗脫而得到的級(jí)分中添加有機(jī)溶劑，對(duì)4’-GL進(jìn)行結(jié)晶化的工序。在上述工序(B)中使用的有機(jī)溶劑的種類沒(méi)有特別限定，優(yōu)選可與水混合的有機(jī)溶劑。作為可與水混合的有機(jī)溶劑，優(yōu)選為選自甲醇、丙酮和乙醇中的1種以上，特別優(yōu)選甲醇。該有機(jī)溶劑的添加量沒(méi)有特別限定，例如為結(jié)晶化中使用的級(jí)分的水分量(體積)的10～30倍量。添加的有機(jī)溶劑的濃度沒(méi)有特別限定，優(yōu)選使用濃度為約100％的有機(jī)溶劑。4’-GL的結(jié)晶化通過(guò)向在工序(A)中最終洗脫而得到的級(jí)分中添加有機(jī)溶劑，進(jìn)行靜置等來(lái)進(jìn)行。需要說(shuō)明的是，在進(jìn)行該結(jié)晶化時(shí)也可以在靜置前用超聲波等進(jìn)行使晶體易于析出的操作。以上說(shuō)明的工序(B)中除了三糖以外的糖(單糖、二糖和四糖等)不結(jié)晶化，僅三糖結(jié)晶化。低聚半乳糖中的三糖中存在4’-GL、Galβ1-4Galβ1-3Glc等異構(gòu)體，在工序(B)中，由于在三糖異構(gòu)體中4’-GL結(jié)晶化的比率也高，所以能夠提高三糖異構(gòu)體中的4’-GL的比率(純度)。需要說(shuō)明的是，三糖異構(gòu)體中的4’-GL的比率可以通過(guò)后述的實(shí)施例中所述的方法進(jìn)行測(cè)定。在該工序(B)之后，也可以用結(jié)晶化中使用的有機(jī)溶劑對(duì)結(jié)晶化后的4’-GL高純度組合物進(jìn)行清洗、干燥等。由上述本發(fā)明制備方法得到的組合物是以高純度含有4’-GL的組合物，作為組合物中所含的三糖異構(gòu)體中的4’-GL的含量，優(yōu)選含有90％以上、優(yōu)選含有94％以上、更優(yōu)選含有95％以上。由本發(fā)明制備方法得到的4’-GL高純度組合物的固體成分為95％以上，結(jié)晶化工序中除了三糖異構(gòu)體以外的糖(單糖、二糖和四糖等)不結(jié)晶化。因此，該組合物中的固體成分全部為三糖異構(gòu)體，所以組合物中的4’-GL的含量可以通過(guò)“組合物的固體成分×三糖異構(gòu)體中的4’-GL的比率”而求出。另外，該組合物是以4’-GL作為組合物中的含量含有88％以上的物質(zhì)、優(yōu)選為含有90％以上、更優(yōu)選為含有92％以上、進(jìn)而優(yōu)選為含有95％以上的物質(zhì)。由此得到的4’-GL高純度組合物例如能夠作為各種分析用的標(biāo)準(zhǔn)品使用，除此之外還能夠用作飲食品、藥品等的原料。實(shí)施例以下列舉制造例、實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不限定于這些實(shí)施例。制造例1糖液的制備：用80℃的熱水2.7kg溶解乳糖2kg，之后冷卻至40℃，在恒溫槽中保持該溫度。向其添加獨(dú)特?cái)S孢酵母YIT10047(ISK-##2B6)(FERMP-18817)的菌體液(β-半乳糖苷酶活性：4000U/kg)157g和釀酒酵母(OrientalYeastCo.,Ltd.制造：RegularYeast)63g(6.3×1011cfu)，一邊攪拌一邊保持在40℃、22小時(shí)進(jìn)行了反應(yīng)。反應(yīng)停止通過(guò)升溫至85℃后將該溫度保持10分鐘來(lái)進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行離心分離(12000×g、30分鐘)，除去用于反應(yīng)的菌體而得到糖液。對(duì)于得到的糖液(制造品)而言，利用下述條件的尺寸排阻HPLC進(jìn)行分析，基于面積百分比進(jìn)行糖鏈長(zhǎng)度不同的組成解析。其結(jié)果示于表1。＜獨(dú)特?cái)S孢酵母的菌體液的β-半乳糖苷酶活性測(cè)定方法＞獨(dú)特?cái)S孢酵母YIT10047(ISK-##2B6)(FERMP-18817)的菌體液的β-半乳糖苷酶活性(U)通過(guò)與國(guó)際公開第2012/141244號(hào)公報(bào)所述的測(cè)定方法相同的方法進(jìn)行測(cè)定。＜HPLC條件＞裝置：島津prominenceUFLC柱：SUGARKS-802(8.0φ×300mm)(昭和電工株式會(huì)社制造)柱溫度：80℃進(jìn)樣量：10μL流動(dòng)相：純化水分析時(shí)間：30分鐘流速：0.5mL/分鐘檢測(cè)：示差折光率[表1]*1：YakultPharmaceuticalInd.Co.,Ltd.制造的低聚半乳糖。使獨(dú)特?cái)S孢酵母的菌體液和源自乳酸克魯維酵母的β-半乳糖苷酶作用于乳糖而制造。根據(jù)以上的結(jié)果，可知的是：與使獨(dú)特?cái)S孢酵母和源自乳酸克魯維酵母的β-半乳糖苷酶作用而得到的市售品的低聚半乳糖相比，獨(dú)特?cái)S孢酵母與糖同化性的釀酒酵母組合時(shí)的三糖的含量還高。實(shí)施例1洗脫條件的研究(1)：使用蒸發(fā)器對(duì)制造例1中制備的糖液進(jìn)行濃縮，得到Bx為72.3的濃縮糖液。分取該濃縮糖液的1.3g，以成為25mL的方式用純化水進(jìn)行稀釋。準(zhǔn)備按常規(guī)方法填充了活性炭(和光純藥工業(yè)株式會(huì)社制造、色譜用)25mL的開管柱色譜(柱的直徑：2cm、高度：30cm)，負(fù)載了稀釋糖液。對(duì)于負(fù)載了該稀釋糖液的柱如下述表2所述，用純化水清洗柱之后，用單次洗脫或梯度洗脫進(jìn)行糖類的洗脫。需要說(shuō)明的是，在各洗脫中使用的溶劑為100mL。清洗、洗脫所需時(shí)間為每個(gè)梯度10分鐘左右。另外，清洗、洗脫用純化水且洗脫液的液面以5cm/分鐘下降的速度來(lái)進(jìn)行。對(duì)表2的單次洗脫的第一次洗脫中得到的洗脫液和梯度洗脫1的第二次洗脫中得到的洗脫液進(jìn)行回收，用蒸發(fā)器進(jìn)行了減壓下濃縮。將得到的洗脫液調(diào)節(jié)至適宜的濃度并通過(guò)0.45μm的過(guò)濾器，利用與制造例1條件相同的尺寸排阻HPLC來(lái)分析濾液，基于面積百分比進(jìn)行各洗脫液的糖鏈長(zhǎng)不同的組成解析?；谇笆鎏擎滈L(zhǎng)度不同的組成解析的結(jié)果求出全部糖中的三糖的比率。其結(jié)果示于表2。[表2]清洗第一次洗脫第二次洗脫全部糖中的三糖的比率單次洗脫純化水20％甲醇水溶液無(wú)70.59％梯度洗脫1純化水15％甲醇水溶液20％甲醇水溶液95.72％基于以上的結(jié)果，可知的是通過(guò)梯度洗脫特異性地洗脫三糖。實(shí)施例2洗脫條件的研究(2)：在實(shí)施例1的梯度洗脫1中，如以下的表3所述變更甲醇水溶液的濃度，除此以外相同地進(jìn)行糖類的洗脫。另外，與實(shí)施例1相同地求出全部糖中的三糖的比率。其結(jié)果一同示于表3。[表3]清洗第一次洗脫第二次洗脫全部糖中的三糖的比率梯度洗脫2純化水5％甲醇水溶液10％甲醇水溶液83.07％梯度洗脫3純化水10％甲醇水溶液15％甲醇水溶液94.06％梯度洗脫1純化水15％甲醇水溶液20％甲醇水溶液95.72％梯度洗脫4純化水20％甲醇水溶液30％甲醇水溶液95.47％梯度洗脫5純化水25％甲醇水溶液40％甲醇水溶液86.24％根據(jù)以上的結(jié)果，可知的是：第一次洗脫的甲醇水溶液的甲醇濃度為5～25％、第二次洗脫的甲醇水溶液的甲醇濃度為10～40％的情況下，第二次洗脫的洗脫液中的三糖的比率為80％以上。特別是，可知的是：第一次洗脫的甲醇水溶液的甲醇濃度為10～20％、第二次洗脫的甲醇水溶液的甲醇濃度為15～30％的情況下，第二次洗脫的洗脫液中的三糖的比率為90％以上。進(jìn)而，可知的是：第一次洗脫的甲醇水溶液的甲醇濃度為15～20％、第二次洗脫的甲醇水溶液的甲醇濃度為20～30％的情況下，第二次洗脫的洗脫液中的三糖的比率高達(dá)95％以上。實(shí)施例3結(jié)晶化條件的研究(1)：用蒸發(fā)器對(duì)與制造例1相同地方式制備的糖液進(jìn)行減壓下濃縮，得到Bx為72.3的濃縮糖液。分取該濃縮糖液22.1g，以成為400mL的方式用純化水進(jìn)行稀釋。準(zhǔn)備按常規(guī)方法填充了活性炭(和光純藥工業(yè)株式會(huì)社制造、色譜用)400mL后的開管柱色譜(柱的直徑：6cm、高度：40cm)，負(fù)載稀釋糖液。對(duì)于負(fù)載了該稀釋糖液的柱用純化水清洗之后，依次用15％甲醇水溶液、20％甲醇水溶液與實(shí)施例1的梯度洗脫1相同地進(jìn)行了糖類的洗脫。需要說(shuō)明的是，在各洗脫中使用的溶劑為1600mL。進(jìn)而，用蒸發(fā)器對(duì)該洗脫中得到的洗脫液進(jìn)行減壓下濃縮，之后在干燥器內(nèi)使其減壓干固，得到濃縮物2.3g(固體成分2.3g)。將上述濃縮物溶解于2.5mL的純化水中。一邊攪拌一邊向該溶液中以甲醇的最終濃度為95.2％(v/v)的方式每次少量地添加甲醇50mL，對(duì)其施加超聲波，促進(jìn)晶體的形成，之后在室溫下靜置一夜。用帶過(guò)濾器的漏斗過(guò)濾生成的晶體，用甲醇清洗晶體，之后在干燥器內(nèi)使其干燥。為了確認(rèn)由結(jié)晶化所帶來(lái)的三糖異構(gòu)體中的4’-GL濃度的變化，通過(guò)以下的方法對(duì)含有4’-GL的三糖的異構(gòu)體進(jìn)行定量，求出了三糖異構(gòu)體中的4’-GL的比率。另外，還求出了除了4’-GL以外的三糖的異構(gòu)體的比率。需要說(shuō)明的是，結(jié)晶化前的濃縮物的三糖異構(gòu)體中的4’-GL的比率與除了4’-GL以外的三糖的異構(gòu)體的比率通過(guò)相同的方法求得。其結(jié)果示于表4。＜4’-GL的定量法＞將約5mg試樣放入螺旋蓋試管中，用蒸發(fā)器進(jìn)行減壓下濃縮，濃縮后在干燥器內(nèi)使其減壓干固。添加相對(duì)于干固后的試樣約50當(dāng)量的含有2-氨基吡啶的200μL醋酸溶液，90℃、1小時(shí)使其加熱反應(yīng)。在反應(yīng)液中添加制成195mg/mL(醋酸)后的二甲胺硼烷試劑250μL，80℃還原50分鐘，得到PA化衍生物。將PA化衍生物移至50mLFalcon管(Falcontube)中，用純化水稀釋至約25mL。向該稀釋液中添加1M氫氧化鈉水溶液，將pH調(diào)節(jié)至弱酸性～中性。使用MICRO-ACILYZER-S1(旭化成株式會(huì)社制造)進(jìn)行透析處理。條件是將透析膜設(shè)為AC-120-10(株式會(huì)社Astom制造)、將電極液設(shè)為0.5％硝酸鈉水溶液以及將結(jié)束設(shè)定為0A。用蒸發(fā)器對(duì)本處理液進(jìn)行減壓下濃縮，之后用干燥器進(jìn)行減壓干固。將樣品溶解于純化水中，將通過(guò)0.45μm過(guò)濾器后的濾液利用HPLC進(jìn)行分析。為了觀察PA化試劑的殘?jiān)?，基于從分析開始至22分鐘以后所檢測(cè)出的峰面積的百分率求出了三糖異構(gòu)體中的4’-GL的比率。另外，還求出了除了4’-GL以外的三糖異構(gòu)體的比率。4’-GL的峰出現(xiàn)在從分析開始起26.8分鐘后，Galβ1-4Galβ1-3Glc的峰出現(xiàn)在從分析開始起41.2分鐘后。＜HPLC條件＞裝置：島津prominenceUFLC柱：PEGASILODSSP300(4.6mmφ×250mm)(SenshuScientificco.，ltd.制造)柱溫度：25℃進(jìn)樣量：10μL流動(dòng)相：0.2M檸檬酸鈉緩沖液(pH5.7)分析時(shí)間：70分鐘流速：0.5mL/分鐘檢測(cè)：UV(310nm)[表4]三糖的異構(gòu)體結(jié)晶化前結(jié)晶化后Galβ1-4Galβ1-4Glc(4’-GL)90.0％95.8％Galβ1-4Galβ1-3Glc6.8％1.7％其它3.2％2.5％根據(jù)以上的結(jié)果，可知的是：通過(guò)使用了甲醇的結(jié)晶化能夠提高三糖異構(gòu)體中的4’-GL的純度。另外，得到的晶體的95％以上為固體成分，結(jié)晶化工序中除了三糖異構(gòu)體以外的糖未結(jié)晶化。因此，該晶體中的固體成分全部為三糖異構(gòu)體，所以組合物中的4’-GL的比率為(95％×95.8％＝)91％以上。實(shí)施例4結(jié)晶化條件的研究(2)：用蒸發(fā)器對(duì)與制造例1相同地方式制備的糖液進(jìn)行減壓下濃縮，得到Bx為72.3的濃縮糖液。分取該濃縮糖液120g，以成為2000mL的方式用純化水進(jìn)行稀釋。準(zhǔn)備按常規(guī)方法填充了活性炭(和光純藥工業(yè)株式會(huì)社制造、色譜用)2000mL后的開管柱色譜(柱的直徑：9cm、高度：80cm)，負(fù)載稀釋糖液。對(duì)于負(fù)載了該稀釋糖液的柱用純化水清洗之后，依次用15％甲醇水溶液、20％甲醇水溶液與實(shí)施例1的梯度洗脫1相同地進(jìn)行糖類的洗脫。需要說(shuō)明的是，在各洗脫中使用的溶劑為8000mL。進(jìn)而，用蒸發(fā)器對(duì)該洗脫中得到的洗脫液進(jìn)行減壓下濃縮，之后在干燥器內(nèi)使其減壓干固，得到濃縮物12.5g(固體成分12.5g)。將上述濃縮物溶解于12.5mL的純化水中，并分成每個(gè)2.5mL。一邊攪拌一邊以最終濃度為95.2％(v/v)的方式向其中每次少量地添加作為可與水混合的溶劑的丙酮或乙醇各50mL。之后，對(duì)其施加超聲波，促進(jìn)晶體的形成，在室溫下靜置一夜。用帶過(guò)濾器的漏斗過(guò)濾生成的晶體，分別用結(jié)晶化時(shí)使用的有機(jī)溶劑對(duì)晶體進(jìn)行清洗，之后在干燥器內(nèi)使其干燥。為了確認(rèn)由結(jié)晶化所帶來(lái)的三糖異構(gòu)體中的4’-GL濃度的變化，與實(shí)施例3相同地對(duì)含有4’-GL的三糖的異構(gòu)體進(jìn)行定量，求出三糖異構(gòu)體中的4’-GL的比率。其結(jié)果示于表5。另外，實(shí)施例3中所示的、使用甲醇進(jìn)行結(jié)晶化時(shí)的三糖異構(gòu)體中的4’-GL的比率也再次示于表5。[表5]根據(jù)以上的結(jié)果，可知的是：若使用丙酮、乙醇，則與甲醇相同地通過(guò)結(jié)晶化使三糖異構(gòu)體中的4’-GL的純度提高。然而，結(jié)晶化后的三糖異構(gòu)體中的4’-GL的比率在使用了甲醇的情況下最高。使用了丙酮、乙醇的情況也是得到的晶體的95％以上為固體成分，結(jié)晶化工序中除了三糖異構(gòu)體以外的糖未結(jié)晶化。因此，該晶體中的固體成分全部為三糖異構(gòu)體，所以組合物中的4’-GL的比率為(95％×94.4％＝)89.6％以上。實(shí)施例5用其它菌株的研究代替獨(dú)特?cái)S孢酵母YIT10047(ISK-##2B6)的菌體液，使用β-半乳糖苷酶活性與制造例1中使用的獨(dú)特?cái)S孢酵母YIT10047的菌體液同等的量的獨(dú)特?cái)S孢酵母JCM5356的菌體液，除此以外與制造例1相同地制備糖液，用與實(shí)施例1的梯度洗脫1相同的條件進(jìn)行梯度洗脫，在與實(shí)施例3相同的條件下對(duì)4’-GL進(jìn)行結(jié)晶化。其結(jié)果，能夠得到三糖中的4’-GL的比率為95％以上的晶體。另外，得到的晶體的95％以上為固體成分，結(jié)晶化工序中除了三糖異構(gòu)體以外的糖未結(jié)晶化。因此，該晶體中的固體成分全部為三糖異構(gòu)體，所以組合物中的4’-GL的比率為(95％×95％＝)90.3％以上。產(chǎn)業(yè)上的可利用性若使用本發(fā)明的4’-GL高純度組合物的制備方法，則能夠通過(guò)簡(jiǎn)便的方法得到4’-GL高純度組合物。另外，用該制備方法得到的4’-GL高純度組合物除了能夠作為各種分析用的標(biāo)準(zhǔn)品使用之外，還能夠用作飲食品、藥品等的原料。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3