本發(fā)明涉及蛋白多肽領(lǐng)域，具體涉及一類脂肪組織靶向多肽及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肥胖癥作為一種常見的慢性內(nèi)分泌代謝疾病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已成為全球性的公共健康難題。當(dāng)人體進(jìn)食的熱量多于消耗量時(shí)便以脂肪形式存于體內(nèi)，超過正常體重的20％即為肥胖。肥胖可發(fā)生于任何年齡，但以40歲以后者為多，女性發(fā)生率偏高。肥胖分為兩大類型：一是單純性肥胖，病人以肥胖為主要表現(xiàn)，不伴明顯的神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)功能的改變，卻伴有代謝調(diào)節(jié)障礙，這類肥胖最為多見。二是繼發(fā)性肥胖，常繼發(fā)腦炎、腦膜炎、腦部損害、垂體疾病、腎上腺皮質(zhì)機(jī)能亢進(jìn)、甲狀腺機(jī)能低下、胰島素分泌過多等。
多年來，肥胖癥的行為和藥物干預(yù)一直未被廣泛接受。直至20世紀(jì)60年代開始了肥胖癥行為治療，使通過改變不良的飲食和運(yùn)動(dòng)習(xí)慣來減輕體重成為可能。研究表明，現(xiàn)有藥物治療可使體重減輕并能維持3～6個(gè)月。雖然研究病例有限，但卻提出了一個(gè)與以往截然不同的概念，即肥胖癥應(yīng)與其他慢性疾病一樣，通過長期的藥物治療來改善。盡管芬氟拉明等藥物由于嚴(yán)重的心血管不良反應(yīng)致使其最終撤出市場，但大量事實(shí)證明肥胖癥有必要視作一種慢性疾病進(jìn)行長期的藥物治療。
理想的減肥藥物應(yīng)能減少能量攝取，增加能量消耗，并改善肥胖相關(guān)的心血管疾病危險(xiǎn)因子。迄今為止，肥胖藥物按作用機(jī)制主要可分為三類：抑制食欲的藥物，影響營養(yǎng)吸收的藥物，增加能量消耗的藥物。抑制食欲的藥物有以下幾類，作用于去甲腎上腺素的藥物直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，刺激去甲腎上腺素(NE)的釋放或阻斷其再攝取，導(dǎo)致神經(jīng)末梢NE耗竭，進(jìn)而抑制食欲，減少攝食，降低體重。此類藥物如安非拉酮。5-羥色胺(5-HT)受體激動(dòng)劑通 過促進(jìn)5-HT的釋放和(或)抑制其再攝取而達(dá)到減肥的目的。短期研究顯示，此類藥物有部分減輕體重的作用，療效與作用與去甲腎上腺素類似，如：芬氟拉明、右芬氟拉明、氟西汀和舍曲林等。西布曲明為神經(jīng)遞質(zhì)再攝取抑制劑類藥物的代表，該藥物通過NE和5-HT的再攝取，減少攝食，降低體重；不同于芬氟拉明和右芬氟拉明的是，西布曲明不誘導(dǎo)5-HT的釋放，因而被認(rèn)為與心血管疾病的發(fā)生無關(guān)。目前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的減少營養(yǎng)物吸收的藥物只有奧利司他，該藥物可特異性地抑制胃腸道胰脂肪酶，抑制膳食中脂肪(甘油三酯)水解為可吸收的游離脂肪酸和甘油單脂，減少飲食中脂肪的吸收達(dá)30％，從而減輕體重，該藥只通過外周組織發(fā)揮作用，全身吸收量甚微(﹤1％)。該藥是第一個(gè)被認(rèn)可的非食欲抑制性抗肥胖藥物，其藥理作用呈劑量依賴性，推薦劑量為一日3次，每次120mg。嚴(yán)格來說，目前臨床上尚無增加能量消耗類的減肥藥物，不過西布曲明除抑制食欲和增加飽腹感外，也有研究發(fā)現(xiàn)它能提高基礎(chǔ)代謝率及促進(jìn)產(chǎn)熱效應(yīng)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所解決的現(xiàn)有技術(shù)的問題在于：目前臨床應(yīng)用的減肥藥物，確實(shí)有助于減輕體重和減少體重反彈，但缺乏長期的安全性及療效評估，長期服用易導(dǎo)致神經(jīng)、心血管等系統(tǒng)疾病。本發(fā)明人通過研究肥胖癥發(fā)生的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了全新的藥物干預(yù)靶點(diǎn)，從而找到了發(fā)明所述的脂肪組織靶向多肽。
具體而言，本發(fā)明提供了一種脂肪組織靶向多肽，所述的脂肪組織靶向多肽包括細(xì)胞靶向多肽肽段、細(xì)胞凋亡多肽肽段以及連接細(xì)胞靶向多肽肽段和細(xì)胞凋亡多肽肽段的橋鏈。
優(yōu)選的，其中細(xì)胞靶向多肽肽段選自以下序列中的一種：SEQ1，SEQ2，SEQ3，SEQ4，SEQ5，SEQ6，SEQ7，SEQ8，SEQ9，SEQ10，SEQ11，SEQ12，SEQ13，SEQ14，SEQ15，SEQ16，SEQ17，SEQ18，SEQ19，SEQ20，SEQ21，SEQ22，SEQ23，SEQ24，SEQ25，SEQ26，SEQ27，SEQ28，SEQ29，SEQ30；
其中所述的細(xì)胞靶向多肽肽段中的氨基酸獨(dú)立地為甘氨酸和D型或者L型氨基酸，優(yōu)選為甘氨酸和L型氨基酸。
優(yōu)選的，所述的細(xì)胞靶向多肽肽段中的氨基酸為天然或非天然氨基酸，所 述的天然氨基酸優(yōu)選為經(jīng)保護(hù)基團(tuán)修飾的天然氨基酸；所述的保護(hù)基團(tuán)優(yōu)選為叔丁氧羰基、氧叔丁基、三苯甲基、2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基、烯丙基、(N-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧環(huán)亞己基-1)乙基)中的一種或幾種。
優(yōu)選的，所述的細(xì)胞凋亡多肽肽段選自細(xì)胞凋亡因子或下列所述的肽鏈片段中的一種：SEQ31，SEQ32；
其中所述肽鏈片段中的氨基酸獨(dú)立地為D型或者L型氨基酸；優(yōu)選為氨基酸全部為D型氨基酸或者L型氨基酸；進(jìn)一步優(yōu)選為氨基酸全部為D型氨基酸。
優(yōu)選的，所述的細(xì)胞凋亡多肽肽段選自細(xì)胞凋亡因子或肽鏈片段SEQ33；
其中所述肽鏈片段中的氨基酸獨(dú)立地為甘氨酸和D型或者L型氨基酸；優(yōu)選為甘氨酸和D型氨基酸。
優(yōu)選的，所述的肽鏈片段中的氨基酸為天然或非天然氨基酸；所述的天然氨基酸優(yōu)選為經(jīng)保護(hù)基團(tuán)修飾的天然氨基酸；所述的保護(hù)基團(tuán)優(yōu)選為叔丁氧羰基、氧叔丁基、三苯甲基、2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?、烯丙基、(N-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧環(huán)亞己基-1)乙基)中的一種或幾種。
優(yōu)選的，所述的細(xì)胞凋亡因子選自以下中的一種：白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-5、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-11、白細(xì)胞介素-12、白細(xì)胞介素-18、干擾素-γ，干擾素-α、干擾素-β、腫瘤壞死因子-α、巨噬細(xì)胞集落刺激因子。
優(yōu)選的，所述的橋鏈為2～10個(gè)的天然或非天然氨基酸片段。
優(yōu)選的，所述的橋鏈為2～6個(gè)氨基酸組成的片段，更優(yōu)選為2個(gè)氨基酸片段。
更優(yōu)選的，所述的橋鏈為包含甘氨酸或丙氨酸。
優(yōu)選的，所述的脂肪組織靶向多肽為鏈狀或者是環(huán)狀脂肪組織靶向多肽；所述的環(huán)狀脂肪組織靶向多肽優(yōu)選為分子內(nèi)成環(huán)的方式。
優(yōu)選的，所述的成環(huán)方式為化學(xué)鍵，選自C-N、C-O、C＝N、C-C、C＝C、C-S、S-S、CO-NH、CO-S鍵中的一種或幾種以上。
更優(yōu)選的，所述的成環(huán)方式為S-S、CO-NH或CO-S鍵。
優(yōu)選的，所述的脂肪組織靶向多肽采用聚乙二醇修飾，所述的脂肪組織靶 向多肽的C端、N端或側(cè)鏈的任一位置與聚乙二醇進(jìn)行結(jié)合。
更優(yōu)選的，所述的脂肪組織靶向多肽的橋鏈與聚乙二醇進(jìn)行結(jié)合。
優(yōu)選的，所述聚乙二醇選自PEG10，PEG100，PEG200，PEG300，PEG400，PEG500，PEG600，PEG700，PEG800，PEG900，PEG1000，PEG1100，PEG1200，PEG1300，PEG1400，PEG1500，PEG1600，PEG1700，PEG1800，PEG2000，PEG3000，PEG4000，PEG10000，PEG20000，PEG40000中的一種或幾種以上。
優(yōu)選的，所述聚乙二醇選自PEG10，PEG100，PEG200，PEG300，PEG400，PEG500中的一種或幾種以上。
更優(yōu)選的，所述聚乙二醇選自PEG10，PEG100，PEG200中的一種或幾種以上。
本發(fā)明同時(shí)提供了一種脂肪組織靶向多肽的制備方法，包括如下步驟：
(1)采用固相合成法，依照脂肪組織靶向多肽的連接次序在偶聯(lián)劑的作用下，依次進(jìn)行氨基酸的偶聯(lián)，合成具有N端保護(hù)的鏈狀脂肪組織靶向多肽；
(2)裂解去除N端保護(hù)的基團(tuán)，得到鏈狀的脂肪組織靶向多肽。
優(yōu)選的，所述偶聯(lián)劑包括縮合劑和反應(yīng)溶劑，所述縮合劑選自以下幾種組合中的一種：(1)N，N′-二異丙基碳化二亞胺和1-羥基苯并三唑，
(2)六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羥基苯并三唑和N，N′-二異丙基乙胺，
(3)2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N，N′-二異丙基乙胺，
(4)六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羥基苯并三唑和N-甲基嗎啡啉，
(5)2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N-甲基嗎啡啉；
所述反應(yīng)溶劑選自N，N′-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亞砜中的一種或幾種以上。
優(yōu)選的，所述的制備方法還包括將步驟(2)得到的鏈狀脂肪組織靶向多肽進(jìn)行環(huán)化過程，得到環(huán)狀脂肪組織靶向多肽；所述的環(huán)化過程包括液相環(huán)化 和固相環(huán)化。
優(yōu)選的，所述的液相環(huán)化包括如下步驟：
(1)鏈狀脂肪組織靶向多肽在溶劑中進(jìn)行溶解，
(2)調(diào)節(jié)溶液成堿性后加入氧化劑進(jìn)行環(huán)化，
(3)調(diào)節(jié)溶液成酸性后得到環(huán)狀脂肪組織靶向多肽；
所述的固相環(huán)化為將鏈狀脂肪組織靶向多肽加入氧化劑得到環(huán)狀脂肪組織靶向多肽。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包含治療有效量的游離形式或可藥用鹽形式的以上任一項(xiàng)所述的脂肪組織靶向多肽作為活性成分，以及一種或多種藥用載體物質(zhì)和/或稀釋劑。
本發(fā)明還提供了以上任一項(xiàng)所述的脂肪組織靶向多肽或以上所述的藥物組合物在制備治療和/或預(yù)防減肥或其他與減肥相關(guān)疾病藥物方面的用途。
同時(shí)，本發(fā)明也提供了以上任一項(xiàng)所述的脂肪組織靶向多肽或以上所述的藥物組合物在治療和/或預(yù)防減肥或其他與減肥相關(guān)疾病方面的用途。
本發(fā)明所取得的有益效果為：本發(fā)明獲得了一種全新的靶向多肽藥物。該化合物結(jié)構(gòu)為將特異性細(xì)胞靶向多肽和細(xì)胞凋亡多肽通過橋鏈鏈接，其能夠抑制目標(biāo)物在脂肪血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)和引起內(nèi)臟脂肪組織的消融，該物質(zhì)能促使新陳代謝正?；驮趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)中快速逆轉(zhuǎn)肥胖，并能破壞受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)化線粒體膜，其包括的D型氨基酸是提供了在血漿中肽酶酶解的抗性。此類化合物可以特異性的使脂肪細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到降脂減肥的療效。并且由于其分子本身包含的靶向作用機(jī)理，可以避免發(fā)生現(xiàn)有減肥藥物的常見不良反應(yīng)，相比現(xiàn)有減肥藥物具有更直接的療效和更少的副作用。
具體實(shí)施方式
如上所述，本發(fā)明的目的在于提供一種脂肪組織靶向多肽，所述的脂肪組織靶向多肽包括細(xì)胞靶向多肽肽段、細(xì)胞凋亡多肽肽段以及連接細(xì)胞靶向多肽肽段和細(xì)胞凋亡多肽肽段的橋鏈。
本發(fā)明主要涉及一類合成的脂肪組織靶向多肽，其特點(diǎn)為細(xì)胞靶向多肽和細(xì)胞凋亡多肽通過橋鏈鏈接而成。并對不同的細(xì)胞靶向多肽、橋鏈和細(xì)胞凋亡 多肽進(jìn)行了篩選。該脂肪組織靶向多肽藥物具有顯著的療效，并具有較低的生理毒性。本發(fā)明提供的脂肪組織靶向多肽，其臨床用量范圍為每天3-15mg/kg。
同時(shí)發(fā)明人通過化學(xué)合成法增加了脂肪組織靶向多肽的穩(wěn)定性，如：將合成好的脂肪組織靶向多肽形成分子內(nèi)二硫環(huán)從而增加了穩(wěn)定性，并通過改變氨基酸序列使得獲得的靶向多肽更加不容易被水解，且此多肽改良了腎臟的清除率。
脂肪組織靶向多肽由連續(xù)的氨基酸組成，可以選擇性的作用在一般的人體器官、組織或細(xì)胞上且特別是脂肪組織或細(xì)胞上。脂肪組織靶向多肽對脂肪組織細(xì)胞具有識(shí)別作用，可以選擇性的作用到脂肪組織細(xì)胞上。選擇性定位可以使脂肪組織靶向多肽在目標(biāo)組織或細(xì)胞上得以富集兩倍或以上。此合成的脂肪組織靶向多肽具有降低生理毒性的特性，其中生理毒性包括腎臟毒性。
其中，本發(fā)明中的細(xì)胞靶向多肽可以特異性的作用在一般的人體器官、組織或細(xì)胞上且特別是脂肪組織或細(xì)胞上，將合成的脂肪組織靶向多肽特異性定位在脂肪組織或者脂肪細(xì)胞處；細(xì)胞凋亡多肽可以特異性的作用于脂肪組織處的細(xì)胞，使其凋亡，得到減肥瘦身的目的。
本發(fā)明所述的脂肪組織靶向多肽可以通過采用聚乙二醇(PEG)的方式進(jìn)行修飾，聚乙二醇可以以單一或者多組的方式與肽鏈的C端、N端或側(cè)鏈的任一位置進(jìn)行結(jié)合，修飾后的多肽化合物可以延長其在生物體內(nèi)的半衰期。
同時(shí)本發(fā)明所述的靶向脂肪組織多肽肽鏈可進(jìn)行分子內(nèi)成環(huán)，從而延長其在體內(nèi)的半衰期，成環(huán)方式可以為二硫鍵或者酰胺鍵。其中二硫鍵采用氧化劑使半胱氨酸側(cè)鏈巰基進(jìn)行分子內(nèi)成環(huán)，氧化劑優(yōu)選為雙氧水、碘及空氣等。酰胺鍵采用偶聯(lián)劑縮合氨基酸側(cè)鏈的羧基和氨基制備可得。
本發(fā)明還提供了脂肪組織靶向多肽的制備方法，但不局限于下列方法：
本發(fā)明的路線以CRGGRAKDC-GG-D(KLAKLAKKLAKLAK)為例進(jìn)行描述。采用固相合成法，以王樹脂或者2-氯三苯甲基氯樹脂(2-CTC樹脂)為起始樹脂，按照所述的脂肪組織靶向多肽主鏈肽序依次偶聯(lián)具有N端Fmoc保護(hù)且側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸；最后肽樹脂裂解，環(huán)化，純化，凍干后得到目標(biāo)化合物。
為此本發(fā)明提供兩種脂肪組織靶向多肽的合成方法，其步驟如下：
方法一：
(1)在活化劑系統(tǒng)的存在下，由樹脂固相載體和Fmoc-D-Lys(Boc)-OH偶聯(lián)得到Fmoc-D-Lys(Boc)-樹脂；
(2)通過固相合成法，按照脂肪組織靶向多肽主鏈肽序依次偶聯(lián)具有N端Fmoc保護(hù)且側(cè)鏈保護(hù)的氨基酸；
(3)裂解，液相環(huán)化，純化，凍干，得到脂肪組織靶向多肽。
其中，步驟(1)中所述樹脂固體載體可以采用2-CTC樹脂，所述活化劑系統(tǒng)選自DIEA、TMP或NMM，所述Fmoc-D-Lys(Boc)-樹脂為0.10～0.50mmol/g取代度的Fmoc-D-Lys(Boc)-CTC樹脂，也可以直接通過購買得到。
其中，步驟(1)中所述樹脂固體載體也可以采用王樹脂，所述活化劑系統(tǒng)由DIC、HOBt和DMAP組成，所述Fmoc-D-Lys(Boc)-樹脂為0.10～0.50mmol/g取代度的Fmoc-D-Lys(Boc)-王樹脂，也可以直接通過購買得到。
其中，步驟(2)所述的固相合成方法，
1)采用由體積比為1:4的哌啶和DMF組成的去保護(hù)液脫除Fmoc-D-Lys(Boc)-樹脂上的Fmoc保護(hù)基，得到H-D-Lys(Boc)-樹脂；
2)在偶聯(lián)劑系統(tǒng)的存在下，H-D-Lys(Boc)-樹脂和Fmoc保護(hù)且側(cè)鏈保護(hù)的D型丙氨酸偶聯(lián)得到Fmoc-D-Ala-D-Lys(Boc)-樹脂；
3)重復(fù)步驟1)、2)，按照脂肪組織靶向多肽主鏈肽序依次進(jìn)行氨基酸的偶聯(lián)，偶聯(lián)氨基酸順序?yàn)椋?/p>
Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH；
所述偶聯(lián)劑系統(tǒng)包括縮合劑和反應(yīng)溶劑，所述縮合劑選自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA、HATU/DIEA、PyBOP/HOBt/NMM或HATU/NMM；所述 反應(yīng)溶劑選自DMF、DCM、NMP、DMSO或它們之間的任意組合；優(yōu)選為DCM和DMF的組合。
其中，步驟(3)所述的液相環(huán)化方法，其步驟為：(1)鏈狀肽在合適的溶劑中進(jìn)行溶解，(2)調(diào)節(jié)溶液成堿性加入氧化劑進(jìn)行環(huán)化，(3)調(diào)節(jié)溶液成酸性淬滅反應(yīng)，得到環(huán)肽粗肽。
方法二：
方法二與方法一的不同之處在于，方法二中步驟(3)采用的是固相環(huán)化、裂解、純化、凍干的方式，得到脂肪組織靶向多肽。
其中，方法二中的固相環(huán)化的方法為：(1)在肽樹脂中加入氧化劑反應(yīng)得環(huán)狀多肽肽樹脂，(2)洗滌獲得的環(huán)狀多肽肽樹脂。
本發(fā)明的脂肪組織靶向多肽可用于治療肥胖癥或肥胖引起的相關(guān)疾病，具體地說，預(yù)計(jì)脂肪組織靶向多肽對于制備療效更顯著副作用更低的治療肥胖癥或肥胖引起的相關(guān)疾病的藥物將是有用的。
其中本發(fā)明提到的多肽序列如下：
SEQ1：Cys Arg Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys，
SEQ2：Cys Homo-Arg Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys，
SEQ3：Cys Lys Gly Gly Homo-Arg Ala Lys Asp Cys，
SEQ4：Cys Lys Gly Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys，
SEQ5：Cys Asp Gly Gly Gly Arg Ala Lys Lys Cys，
SEQ6：Cys Glu Gly Gly Gly Arg Ala Lys Lys Cys，
SEQ7：Cys Arg Gly Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys，
SEQ8：Cys Homo-Arg Gly Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys，
SEQ9：Cys Arg Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Lys Asp Cys，
SEQ10：Cys Lys Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Lys Asp Cys，
SEQ11：Cys Lys Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Lys Glu Cys，
SEQ12：Cys Homo-Arg Gly Gly Gly Arg Ala Arg Asp Cys，
SEQ13：Cys Arg Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Arg Asp Cys，
SEQ14：Cys Lys Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Arg Asp Cys，
SEQ15：Cys Lys Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Arg Glu Cys，
SEQ16：Arg Gly Gly Arg Ala Lys Asp，
SEQ17：Homo-Arg Gly Gly Arg Ala Lys Asp，
SEQ18：Lys Gly Gly Homo-Arg Ala Lys Asp，
SEQ19：Lys Gly Gly Gly Arg Ala Lys Asp，
SEQ20：Asp Gly Gly Gly Arg Ala Lys Lys，
SEQ21：Glu Gly Gly Gly Arg Ala Lys Lys，
SEQ22：Arg Gly Gly Gly Arg Ala Lys Asp，
SEQ23：Homo-Arg Gly Gly Gly Arg Ala Lys Asp，
SEQ24：Arg Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Lys Asp，
SEQ25：Lys Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Lys Asp，
SEQ26：Lys Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Lys Glu，
SEQ27：Homo-Arg Gly Gly Gly Arg Ala Arg Asp，
SEQ28：Arg Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Arg Asp，
SEQ29：Lys Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Arg Asp，
SEQ30：Lys Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Arg Glu；
SEQ31：Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys，
SEQ32：Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Arg Leu Ala Lys Leu Ala Lys，
SEQ33：Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Gly Arg Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys。
其中，多肽序列SEQ1一直到SEQ33中出現(xiàn)的Homo-Arg為高精氨酸。
具體而言，在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，細(xì)胞靶向多肽肽段為SEQ1：Cys Arg Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys，其采用單字母表示為CRGGRAKDC；細(xì)胞凋亡多肽肽段為SEQ31：Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys，其采用單字母表示為：KLAKLAKKLAKLAK，細(xì)胞凋亡多肽肽段中的氨基酸為D型氨基酸；橋鏈為甘氨酸或丙氨酸。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，細(xì)胞靶向多肽肽段為SEQ2：Cys Homo-Arg Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys，其采用單字母表示為：C Homo-RGGRAKDC；細(xì)胞凋亡多肽肽段為SEQ31：Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys，其采用單字母表示為：KLAKLAKKLAKLAK， 細(xì)胞凋亡多肽肽段中的氨基酸為D型氨基酸；橋鏈為甘氨酸或丙氨酸。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，細(xì)胞靶向多肽肽段為SEQ30：Lys Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Arg Glu，其采用單字母表示為KGGG Homo-RARE；細(xì)胞凋亡多肽肽段為SEQ31：Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys，其采用單字母表示為：KLAKLAKKLAKLAK，細(xì)胞凋亡多肽肽段中的氨基酸為D型氨基酸；橋鏈為甘氨酸或丙氨酸。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，細(xì)胞靶向多肽肽段為SEQ1：Cys Arg Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys，其采用單字母表示為：CRGGRAKDC；細(xì)胞凋亡多肽肽段為SEQ32：Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Arg Leu Ala Lys Leu Ala Lys，其采用單字母表示為：KLAKLAKRLAKLAK，細(xì)胞凋亡多肽肽段中的氨基酸為D型氨基酸；橋鏈為甘氨酸或丙氨酸。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，細(xì)胞靶向多肽肽段為SEQ2：Cys Homo-Arg Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys，其采用單字母表示為：C Homo-RGGRAKDC；細(xì)胞凋亡多肽肽段為SEQ32：Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Arg Leu Ala Lys Leu Ala Lys，其采用單字母表示為：KLAKLAKRLAKLAK；橋鏈為甘氨酸或丙氨酸。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，細(xì)胞靶向多肽肽段為SEQ30：Lys Gly Gly Gly Homo-Arg Ala Arg Glu，其采用單字母表示為：KGGG Homo-RARE；細(xì)胞凋亡多肽肽段為SEQ32：Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Arg Leu Ala Lys Leu Ala Lys，其采用單字母表示為：KLAKLAKRLAKLAK，細(xì)胞凋亡多肽肽段中的氨基酸為D型氨基酸；橋鏈為甘氨酸或丙氨酸。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，細(xì)胞靶向多肽肽段為SEQ1：Cys Arg Gly Gly Arg Ala Lys Asp Cys，其采用單字母表示為：CRGGRAKDC；細(xì)胞凋亡多肽肽段為SEQ31：Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys，其采用單字母表示為KLAKLAKKLAKLAK，細(xì)胞凋亡多肽肽段中的氨基酸為D型氨基酸；橋鏈為聚乙二醇修飾的甘氨酸或丙氨酸。
需要說明的是，本發(fā)明中脂肪組織靶向多肽中的氨基酸除甘氨酸以外，其他氨基酸若涉及到D構(gòu)型或L構(gòu)型時(shí)，均可以為D型或者L型氨基酸，以下實(shí)施例中用到的氨基酸在不表明構(gòu)型時(shí)，默認(rèn)為L型氨基酸，在涉及到D型 氨基酸時(shí)，均會(huì)特別說明為D型氨基酸或者在左下角標(biāo)注D來表示。
下面通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)的說明。但是這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明范圍的限制。
本發(fā)明中一些常用的縮寫具有以下含義；
Fmoc：芴甲氧羰基
Fmoc-AA：芴甲氧羰基保護(hù)的氨基酸
DIC：N，N′-二異丙基碳化二亞胺
DCC：N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺
PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HOBt：1-羥基苯并三唑
tBu：叔丁基
OtBu:氧叔丁基
Trt：三苯甲基
Boc：叔丁氧羰基
Dde：(N-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧環(huán)亞己基-1)乙基)
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?/p>
Cys：半胱氨酸
Pro：脯氨酸
Leu：亮氨酸
Gly：甘氨酸
Arg：精氨酸
Ala：丙氨酸
Asp：天冬氨酸
Glu：谷氨酸
Lys：賴氨酸
DMF：N，N′-二甲基甲酰胺
MeOH：甲醇
DCM：二氯甲烷
NMP：N-甲基吡咯烷酮
DMSO：二甲基亞砜
TFA：三氟醋酸
Piperidine：六氫吡啶
DMAP：4-二甲氨基吡啶
DIEA：N，N′-二異丙基乙胺
TMP：2,4,6-三甲基吡啶。
其中，實(shí)施例中所用的試劑和儀器的廠商型號(hào)如下：
Fmoc-D-Lys(Boc)-王樹脂，購自吉爾生化(上海)有限公司；
保護(hù)氨基酸，購自吉爾生化(上海)有限公司；
DMF(N，N′-二甲基甲酰胺)，購自浙江江山化工股份有限公司；
哌啶，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；
DCM(二氯甲烷)，購自浙江衢化氟化學(xué)有限公司；
DIC(N，N′-二異丙基碳化二亞胺)，購自淄博天堂山化工有限公司；
TFA(三氟醋酸)，購自浙江化工院科技有限公司；
苯甲硫醚，購自舒萊維化工科技(杭州)有限公司；
苯甲醚，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；
HOBt(1-羥基苯并三唑)，購自上海瀚鴻化工科技有限公司；
C18柱，C8柱，購自Daisogel；
四(三苯基膦)鈀(Pd(PPh3)4)，購自安耐吉化學(xué)；
電子天平，JY10001，上海精密科學(xué)儀器有限公司。
(一)脂肪組織靶向多肽的合成
實(shí)施例一
實(shí)施例一首先制備合成了鏈狀的SEQ34：CRGGRAKDC-GG-KLAKLAKKLAKLAK脂肪組織靶向多肽，其中的第12位到第25位的氨基酸均為D型氨基酸。然后通過環(huán)化過程將其中第1位的Cys的側(cè)鏈和第9位的Cys的側(cè)鏈成一個(gè)二硫鍵的環(huán)。其制備過程如下：
1)稱取0.1mmol取代度為0.45mmol/g的Fmoc-D-Lys(Boc)-王樹脂，加入 固相反應(yīng)柱中，用DMF洗滌1次，用DMF溶脹Fmoc-D-Lys(Boc)-王樹脂30分鐘后，用DMF：哌啶體積比為4:1的混合溶液脫去Fmoc保護(hù)，得到H-D-Lys(Boc)-王樹脂，并用DMF洗滌6次。
2)稱取Fmoc-D-Ala-OH0.5mmol、HOBt0.5mmol加入體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μl DIC(0.5mmol)活化后，加入上述裝有樹脂的反應(yīng)柱中，室溫下反應(yīng)2小時(shí)后，以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點(diǎn)；如果樹脂無色透明，則表示反應(yīng)完全；樹脂顯色，則表示反應(yīng)不完全，需要再反應(yīng)1小時(shí)；從而制備得到Fmoc-D-Ala-D-Lys(Boc)-王樹脂。此判斷標(biāo)準(zhǔn)適用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點(diǎn)。
3)重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，依次完成Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH的偶聯(lián)。偶聯(lián)完畢，將肽樹脂用DMF洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，抽干得到0.751g粗肽樹脂。
4)裂解：為了去除樹脂和肽鏈氨基酸側(cè)鏈的保護(hù)基團(tuán)，稱取0.751g全保護(hù)的肽樹脂，加入到25mL的三口圓底燒瓶中，按TFA：苯甲硫醚：苯甲醚＝95：3：2的體積比配置裂解液10mL，將裂解液加入上述樹脂中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，過濾，用少量TFA洗滌裂解后的樹脂3次，合并濾液，濃縮，將濃縮后的液體加入到冰乙醚中沉淀1小時(shí)，離心，無水乙醚離心洗滌6次，真空干燥，得到粗肽257.2mg。
5)液相環(huán)化：將粗肽用250ml水溶解后，用氨水調(diào)節(jié)PH至8后，加入雙氧水50μl，反應(yīng)2h后，用醋酸調(diào)節(jié)PH至6。
6)純化，凍干：通過C18柱2次純化、轉(zhuǎn)鹽、冷凍干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物(20.7mg，8.02％)，用MALDI-TOF分析產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為2582.5123(理論量為2582)。
實(shí)施例二
實(shí)施例二首先制備合成了鏈狀的SEQ35：CHomo-RGGRAKDC-GG-KLAKLAKKLAKLAK脂肪組織靶向多肽，其中的第12位到第25位氨基酸均為D型氨基酸；然后通過環(huán)化，將其中第1位的Cys的側(cè)鏈和第9位的Cys的側(cè)鏈成一個(gè)二硫鍵的環(huán)，其制備過程如下：
1)稱取0.1mmol取代度為0.45mmol/g的Fmoc-D-Lys(Boc)-王樹脂，加入固相反應(yīng)柱中，用DMF洗滌1次，用DMF溶脹Fmoc-D-Lys(Boc)-王樹脂30分鐘后，用DMF：哌啶體積比為4:1的混合溶液脫去Fmoc保護(hù)，然后用DMF洗滌6次，制備得到H-D-Lys(Boc)-王樹脂。
2)稱取Fmoc-D-Ala-OH0.5mmol、HOBt0.5mmol加入體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μl DIC(0.5mmol)活化后，加入上述裝有樹脂的反應(yīng)柱中，室溫下反應(yīng)2小時(shí)后，以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點(diǎn)，如果樹脂無色透明，則表示反應(yīng)完全；樹脂顯色，則表示反應(yīng)不完全，需要再反應(yīng)1小時(shí)，此判斷標(biāo)準(zhǔn)適用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點(diǎn)，從而制備得到Fmoc-D-Ala-D-Lys(Boc)-王樹脂。
3)重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，依次完成Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-HomoArg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH的偶聯(lián)。偶聯(lián)完畢，將肽樹脂用DMF洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，抽干得到0.782g粗肽樹脂。
4)裂解：稱取0.782g全保護(hù)的肽樹脂，加入到25mL的三口圓底燒瓶中，按TFA：苯甲硫醚：苯甲醚＝95：3：2的體積比配置裂解液10mL，將裂解液加入上述樹脂中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，過濾，用少量TFA洗滌裂解后的樹脂3次，合并濾液，濃縮，將濃縮后的液體加入到冰乙醚中沉淀1小時(shí)，離心，無 水乙醚離心洗滌6次，真空干燥，得到粗肽261.7mg。
5)液相環(huán)化：將粗肽用250ml水溶解后，用氨水調(diào)節(jié)PH至8后，加入雙氧水50μl，反應(yīng)2h后，用醋酸調(diào)節(jié)PH至6。
6)純化，凍干：而后通過C8柱2次純化、轉(zhuǎn)鹽、冷凍干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物(22.7mg，8.73％)，用MALDI-TOF分析產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為2598.5088(理論量為2598)。
實(shí)施例三
實(shí)施例三首先制備得到了鏈狀的SEQ36：KGGG Homo-RARE-GG-KLAKLAKKLAKLAK脂肪組織靶向多肽，其中的第11位到第24位氨基酸均為D型氨基酸；然后通過環(huán)化，將其中第1位的側(cè)鏈的Lys和第8位的Glu的側(cè)鏈成一個(gè)酰胺鍵的環(huán)，其制備過程如下：
1)稱取0.1mmol取代度為0.45mmol/g的Fmoc-D-Lys(Boc)-王樹脂，加入固相反應(yīng)柱中，用DMF洗滌1次，用DMF溶脹Fmoc-D-Lys(Boc)-王樹脂30分鐘后，用DMF：哌啶體積比為4:1的混合溶液脫去Fmoc保護(hù)，然后用DMF洗滌6次，制備得到H-D-Lys(Boc)-王樹脂。
2)稱取Fmoc-D-Ala-OH 0.5mmol、0.068g HOBt 0.5mmol加入體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μl DIC(0.5mmol)活化后，加入上述裝有樹脂的反應(yīng)柱中，室溫下反應(yīng)2小時(shí)后，以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點(diǎn)，如果樹脂無色透明，則表示反應(yīng)完全；樹脂顯色，則表示反應(yīng)不完全，需要再反應(yīng)1小時(shí)，此判斷標(biāo)準(zhǔn)適用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點(diǎn)。從而制備得到Fmoc-D-Ala-D-Lys(Boc)-王樹脂。
3)重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，依次完成Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OAll)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-HomoArg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH的偶聯(lián)。
4)固相環(huán)化：偶聯(lián)完畢，采用5倍量Pd(PPh3)4脫去Glu上的烯丙基并采用3％水合肼DMF溶液10ml脫去Lys上的Dde，并采用10倍量的PyBop和15倍量的DIEA反應(yīng)過夜。環(huán)化完成后，將肽樹脂用DMF洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，抽干得到0.725g粗肽樹脂。
5)裂解：稱取0.725g全保護(hù)的肽樹脂，加入到25mL的三口圓底燒瓶中，按TFA：苯甲硫醚：苯甲醚＝95：3：2的體積比配置裂解液10mL，將裂解液加入上述樹脂中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，過濾，用少量TFA洗滌裂解后的樹脂3次，合并濾液，濃縮，將濃縮后的液體加入到冰乙醚中沉淀1小時(shí)，離心，無水乙醚離心洗滌6次，真空干燥，得到粗肽236.5mg。
6)純化，凍干：將粗肽用250ml水溶解后。而后通過C18柱2次純化、轉(zhuǎn)鹽、冷凍干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物(22.6mg，9.24％)，用MALDI-TOF分析產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為2445.3248(理論量為2445)。
實(shí)施例四
實(shí)施例四制備得到了鏈狀的SEQ37：CRGGRAKDC-GG-KLAKLAKRLAKLAK脂肪組織靶向多肽，其中的第12位到第25位氨基酸均為D型氨基酸；然后通過環(huán)化，將其中第1位的Cys的側(cè)鏈和第9位的Cys的側(cè)鏈成一個(gè)二硫鍵的環(huán)，其制備過程如下：
1)稱取0.1mmol取代度為0.45mmol/g的Fmoc-D-Lys(Boc)-王樹脂，加入固相反應(yīng)柱中，用DMF洗滌1次，用DMF溶脹Fmoc-D-Lys(Boc)-王樹脂30分鐘后，用DMF：哌啶體積比為4:1的混合溶液脫去Fmoc保護(hù)，然后用DMF洗滌6次，從而制備得到H-D-Lys(Boc)-王樹脂。
2)稱取Fmoc-D-Ala-OH 0.5mmol、HOBt 0.5mmol加入體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μl DIC(0.5mmol)活化后，加入上述裝有樹脂的反應(yīng)柱中，室溫下反應(yīng)2小時(shí)后，以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點(diǎn)，如果樹脂無色透明，則表示反應(yīng)完全；樹脂顯色，則表示反應(yīng)不完全，需要再反應(yīng)1小時(shí)，此判斷標(biāo)準(zhǔn)適用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點(diǎn)。從而制備得到Fmoc-D-Ala-D-Lys(Boc)-王樹脂。
3)重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，依次完成Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH的偶聯(lián)。偶聯(lián)完畢，將肽樹脂用DMF洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，抽干得到0.762g粗肽樹脂。
4)裂解：稱取0.762g全保護(hù)的肽樹脂，加入到25mL的三口圓底燒瓶中，按TFA：苯甲硫醚：苯甲醚＝95：3：2的體積比配置裂解液10mL，將裂解液加入上述樹脂中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，過濾，用少量TFA洗滌裂解后的樹脂3次，合并濾液，濃縮，將濃縮后的液體加入到冰乙醚中沉淀1小時(shí)，離心，無水乙醚離心洗滌6次，真空干燥，得到粗肽267.4mg。
5)液相環(huán)化：將粗肽用250ml水溶解后，用氨水調(diào)節(jié)PH至8后，加入雙氧水50μl，反應(yīng)2h后，用醋酸調(diào)節(jié)PH至6。
6)純化，凍干：通過C18柱2次純化、轉(zhuǎn)鹽、冷凍干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物(24.2mg，9.27％)，用MALDI-TOF分析產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為2610.5373(理論量為2610)。
實(shí)施例五：
實(shí)施例五首先制備得到了鏈狀的SEQ38：C Homo-RGGRAKDC-GG-KLAKLAKRLAKLAK脂肪組織靶向多肽，其中的第12位到第25位氨基酸均為D型氨基酸；然后通過環(huán)化，將其中第1位的Cys的側(cè)鏈和第9位的Cys的側(cè)鏈成一個(gè)二硫鍵的環(huán)，其制備過程如下：
1)稱取0.1mmol取代度為0.45mmol/g的Fmoc-D-Lys(Boc)-王樹脂，加入固相反應(yīng)柱中，用DMF洗滌1次，用DMF溶脹Fmoc-D-Lys(Boc)-王樹脂30分鐘后，用DMF：哌啶體積比為4:1的混合溶液脫去Fmoc保護(hù)，然后用DMF洗滌6次，從而制備得到H-D-Lys(Boc)-王樹脂。
2)稱取Fmoc-D-Ala-OH 0.5mmol、0.068g HOBt 0.5mmol加入體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μl DIC(0.5mmol)活化后，加入上述裝有樹脂的反應(yīng)柱中，室溫下反應(yīng)2小時(shí)后，以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點(diǎn)，如果樹脂無色透明，則表示反應(yīng)完全；樹脂顯色，則表示反應(yīng)不完全，需要再反應(yīng)1小時(shí)，此判斷標(biāo)準(zhǔn)適用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點(diǎn)，從而制備得到Fmoc-D-Ala-D-Lys(Boc)-王樹脂。
3)重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，依次完成Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-HomoArg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH的偶聯(lián)。偶聯(lián)完畢，將肽樹脂用DMF洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，抽干得到0.805g粗肽樹脂。
4)裂解：稱取0.805g全保護(hù)的肽樹脂，加入到25mL的三口圓底燒瓶中，按TFA:苯甲硫醚:苯甲醚＝95:3:2的體積比配置裂解液10mL，將裂解液加入上述樹脂中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，過濾，用少量TFA洗滌裂解后的樹脂3次，合并濾液，濃縮，將濃縮后的液體加入到冰乙醚中沉淀1小時(shí)，離心，無水乙醚離心洗滌6次，真空干燥，得到粗肽284.2mg。
5)液相環(huán)化：將粗肽用250ml水溶解后，用氨水調(diào)節(jié)PH至8后，加入雙氧水50μl，反應(yīng)2h后，用醋酸調(diào)節(jié)PH至6。
6)純化，凍干：通過C18柱2次純化、轉(zhuǎn)鹽、冷凍干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物(23.6mg，8.73％)，用MALDI-TOF分析產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為2626.4573(理論量為2626)。
實(shí)施例六
實(shí)施例六制備得到了鏈狀的SEQ39：KGGG Homo-R ARE-GG-KLAKLAKRLAKLAK脂肪組織靶向多肽，其中的第11位到第24位 氨基酸均為D型氨基酸；然后通過環(huán)化，將其中第1位的Lys的側(cè)鏈和第8位的Glu的側(cè)鏈的成一個(gè)酰胺鍵的環(huán)，其制備過程如下：
1)稱取0.1mmol取代度為0.45mmol/g的Fmoc-D-Lys(Boc)-王樹脂，加入固相反應(yīng)柱中，用DMF洗滌1次，用DMF溶脹Fmoc-D-Lys(Boc)-王樹脂30分鐘后，用DMF:哌啶體積比為4:1的混合溶液脫去Fmoc保護(hù)，然后用DMF洗滌6次，從而制備得到H-D-Lys(Boc)-王樹脂。
2)稱取Fmoc-D-Ala-OH 0.5mmol、0.068g HOBt 0.5mmol加入體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μl DIC(0.5mmol)活化后，加入上述裝有樹脂的反應(yīng)柱中，室溫下反應(yīng)2小時(shí)后，以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點(diǎn)，如果樹脂無色透明，則表示反應(yīng)完全；樹脂顯色，則表示反應(yīng)不完全，需要再反應(yīng)1小時(shí)，此判斷標(biāo)準(zhǔn)適用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點(diǎn)。從而制備得到Fmoc-D-Ala-D-Lys(Boc)-王樹脂。
3)重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，依次完成Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OAll)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-HomoArg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Dde)-OH的偶聯(lián)。
4)固相環(huán)化：偶聯(lián)完畢，采用5倍量Pd(PPh3)4脫去Glu上的烯丙基并采用3％水合肼DMF溶液10ml脫去Lys上的Dde，并采用10倍量的PyBop和15倍量的DIEA反應(yīng)過夜。環(huán)化完成后，將肽樹脂用DMF洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，抽干得到0.736g粗肽樹脂。
5)裂解：稱取0.736g全保護(hù)的肽樹脂，加入到25mL的三口圓底燒瓶中，按TFA：苯甲硫醚：苯甲醚＝95：3：2的體積比配置裂解液10mL，將裂解液加入上述樹脂中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，過濾，用少量TFA洗滌裂解后的樹脂3次，合并濾液，濃縮，將濃縮后的液體加入到冰乙醚中沉淀1小時(shí)，離心，無水乙醚離心洗滌6次，真空干燥，得到粗肽230.9mg。
6)純化，凍干：將粗肽用250ml水溶解后，而后通過C18柱2次純化、轉(zhuǎn)鹽、冷凍干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物(21.0mg，9.24％)，用MALDI-TOF分析產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為2473.3188(理論量為2473)。
實(shí)施例七
實(shí)施例七首先制備得到了SEQ40：CRGGRAKDC-G-(PEG)10-CH2CH2-G-KLAKLAKKLAKLAK脂肪組織靶向多肽，其中的第12位到第25位氨基酸均為D型氨基酸；然后通過環(huán)化，將其中第1位的Cys的側(cè)鏈和第9位的Cys的側(cè)鏈成一個(gè)二硫鍵的環(huán)，其制備過程如下：
1)稱取0.1mmol取代度為0.45mmol/g的Fmoc-D-Lys(Boc)-王樹脂，加入固相反應(yīng)柱中，用DMF洗滌1次，用DMF溶脹Fmoc-D-Lys(Boc)-王樹脂30分鐘后，用DMF：哌啶體積比為4:1的混合溶液脫去Fmoc保護(hù)，然后用DMF洗滌6次，從而制備得到H-D-Lys(Boc)-王樹脂。
2)稱取Fmoc-D-Ala-OH 0.5mmol、HOBt 0.5mmol加入體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μl DIC(0.5mmol)活化后，加入上述裝有樹脂的反應(yīng)柱中，室溫下反應(yīng)2小時(shí)后，以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點(diǎn)，如果樹脂無色透明，則表示反應(yīng)完全；樹脂顯色，則表示反應(yīng)不完全，需要再反應(yīng)1小時(shí)，此判斷標(biāo)準(zhǔn)適用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應(yīng)終點(diǎn)。從而制備得到Fmoc-D-Ala-D-Lys(Boc)-王樹脂。
3)重復(fù)上述脫除Fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，依次完成Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-NH-PEG10-CH2CH2COOH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH的偶聯(lián)。偶聯(lián)完畢，將肽樹脂用DMF洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，抽干得到0.837g粗肽樹脂。
4)裂解：稱取0.837g全保護(hù)的肽樹脂，加入到25mL的三口圓底燒瓶中，按TFA：苯甲硫醚：苯甲醚＝95：3：2的體積比配置裂解液10mL，將裂解液加入上述樹脂中，室溫反應(yīng)2小時(shí)，過濾，用少量TFA洗滌裂解后的樹脂3次，合并濾液，濃縮，將濃縮后的液體加入到冰乙醚中沉淀1小時(shí)，離心，無水乙醚離心洗滌6次，真空干燥，得到粗肽305.2mg。
5)液相環(huán)化：將粗肽用250ml水溶解后，用氨水調(diào)節(jié)PH至8后，加入雙氧水50μl，反應(yīng)2h后，用醋酸調(diào)節(jié)PH至6。
6)純化、凍干：通過C18柱2次純化、轉(zhuǎn)鹽、冷凍干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物(19.7mg，6.37％)，用MALDI-TOF分析產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3093.5676(理論量為3093)。
(二)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
選取C57BL/6小鼠通過飼喂高脂飲食建造肥胖模型，觀察脂肪組織靶向多肽對肥胖癥小鼠的治療效果，篩選出最佳治療效果的脂肪組織靶向多肽和給藥劑量，給其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供參考依據(jù)。
2.試驗(yàn)系統(tǒng)及選擇的理由
選用C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，是因?yàn)樵搰X類動(dòng)物背景資料豐富，是國內(nèi)外最常采用的嚙齒類實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，且有利于與同類試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。
3.檢疫與馴化
C57BL/6小鼠，購自山東弘立醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究有限公司。實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物送達(dá)本公司后由檢疫人員核對簽收，并由檢疫人員負(fù)責(zé)適應(yīng)性飼養(yǎng)3d，每天對動(dòng)物的行為動(dòng)作、刺激反應(yīng)、肌肉緊張力、呼吸、二便、外生繁系統(tǒng)、皮膚粘膜及眼等進(jìn)行觀察。
4.試驗(yàn)動(dòng)物的識(shí)別方法
檢疫期采用尾部劃線法標(biāo)記，正式試驗(yàn)采用苦味酸涂抹法標(biāo)記動(dòng)物編號(hào)，并在籠具上標(biāo)明實(shí)驗(yàn)編號(hào)、動(dòng)物組別及給藥劑量。
5.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理
5.1環(huán)境條件
[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(魯)20110012]
飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級動(dòng)物室；
溫度設(shè)定：20～25℃；
濕度設(shè)定：40～70％；
換氣次數(shù)：10～15次/h；
照明時(shí)間：12h(早8：00點(diǎn)到晚8：00開燈)；
5.2飼養(yǎng)條件
籠具：小鼠飼養(yǎng)盒，蘇州市通安醫(yī)學(xué)設(shè)備廠生產(chǎn)，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2003-2006；
放置動(dòng)物數(shù)：5只/盒；
籠具交換：2次/周；
糞便處理方法：隨墊料一起更換，2次/周；
清掃及消毒方法：檢疫期間隔日用布蘸取消毒液擦拭籠架及地面。實(shí)驗(yàn)期間，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后清掃地面及工作臺(tái)，并用布蘸取消毒液擦拭(消毒液：1％新潔爾滅、1％84消毒液、0.2％過氧乙酸，每周更換一次)。
6.試驗(yàn)動(dòng)物飼料
名稱：高脂肪食料TD97366(25.4％脂肪，21.79％蛋白質(zhì)，38.41％碳化合物)
有效期：常溫下3個(gè)月
生產(chǎn)單位：Harlan Teklad
保存條件：儲(chǔ)存于專用的飼料間，低溫、干燥和衛(wèi)生
飼料檢測：每批飼料均有生產(chǎn)商提供的質(zhì)量合格證明
給料方法：自由攝食
7.試驗(yàn)動(dòng)物飲用水
種類：反滲透水
給水方法：通過飲水瓶設(shè)置的飲水嘴自由攝取
水質(zhì)檢測：每年檢測一次，檢測依據(jù)參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB5749-2006。
8.供試品及溶媒的配制
供試品為實(shí)施例一到實(shí)施例五制備得到的脂肪組織靶向多肽，溶媒為滅菌 注射用水。
其配置方法為：在超凈工作臺(tái)中，用電子天平稱取不同編號(hào)的脂肪組織靶向多肽，將其置于一滅菌容器中，并加入無菌注射用水溶解，使其終濃度為1g/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。
實(shí)施例五靶向多肽儲(chǔ)存液用PBS稀釋為不同劑量。
其中，相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)標(biāo)簽上標(biāo)有實(shí)驗(yàn)編號(hào)、供試品編號(hào)、配制濃度、配制人、復(fù)核人以及配制時(shí)間。
9.實(shí)驗(yàn)方法
9.1小鼠試驗(yàn)前喂養(yǎng)
C57BL/6雄性小鼠在抗肥胖試驗(yàn)前用高脂肪食料TD97366(25.4％脂肪，21.79％蛋白質(zhì)，38.41％碳化合物，購于Harlan Teklad)喂養(yǎng)，使其在試驗(yàn)前平均體重達(dá)到50g。
9.2給藥劑量與分組
9.2.1脂肪組織靶向多肽樣品篩選
將成模小鼠隨機(jī)分為六組，每組10只小鼠，具體給藥劑量與分組見表1。
表1脂肪組織靶向多肽對肥胖小鼠模型給藥劑量與分組
其中，給藥途徑采用頸背部皮下注射的方式，其給藥途徑與臨床藥物的給藥途徑保持一致。給藥時(shí)間為每天上午的9：30～10：30之間。
9.2.2給藥劑量篩選
選取最好的減重靶向多肽(實(shí)施例五制備得到的脂肪組織靶向多肽)，將成模小鼠按給予不同的給藥途徑和不同的給藥劑量，隨機(jī)分為不同的實(shí)驗(yàn)組，每組10只小鼠，具體給藥劑量與分組見表2。
表2實(shí)施例五脂肪組織靶向多肽對肥胖小鼠模型給藥劑量與分組
其中，給藥途徑部分IP代表腹腔注射，IM代表肌肉注射，給藥時(shí)間為每天上午的9：30～10：30之間。
10.各種指標(biāo)的檢測和數(shù)據(jù)處理
分別于給藥前以及給藥后不同的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，測量小鼠的體重。對實(shí)驗(yàn)小鼠每天給藥一次，同時(shí)每三天一個(gè)間隔進(jìn)行體重測定。同時(shí)采用EXCEL2013和SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入和統(tǒng)計(jì)分析；小鼠體重采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD或S)表示。
實(shí)驗(yàn)過程中并未發(fā)現(xiàn)影響實(shí)驗(yàn)研究可靠性和造成研究工作偏離實(shí)驗(yàn)方案的異常情況。
11.結(jié)果
11.1多肽樣品篩選
對小鼠給予實(shí)施例一到實(shí)施例五的脂肪組織靶向多肽，分別于不同的時(shí)間測定小鼠的體重變化，其中實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。
表3多肽樣品篩選小鼠體重下降值(g)
從表3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，小鼠給予不同實(shí)施例制備得到的脂肪組織靶向多肽供試品，實(shí)施例一到實(shí)施例五的小鼠體重都出現(xiàn)了明顯的下降，在給藥后第15天之后，除了實(shí)施例二的小鼠體重下降1.62g，其他小鼠體重普遍下降3～5g，表明實(shí)施例一到實(shí)施例五的靶向多肽具有明顯的治療效果，可以降低小鼠的體重，緩解小鼠肥胖癥狀。而且小鼠體重的變化隨時(shí)間逐步下降，表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性。
11.2給藥劑量篩選
選取實(shí)施例五的靶向多肽供試品，然后用無菌水稀釋成不同的濃度，分別采用不同的給藥途徑，包括腹腔注射(IP)和肌肉注射(IM)，然后于不同的時(shí)間測定小鼠給藥前和給藥后的體重變化，其中小鼠給藥后相較于給藥前體重減少值見表4。
表4實(shí)施例五脂肪組織靶向多肽給藥小鼠體重下降值(g)
從表4可以看出，無論腹腔注射還是肌肉注射脂肪組織靶向多肽，小鼠體重均隨著給藥濃度的增加，表現(xiàn)出明顯的體重下降；而且體重下降值均表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性。尤其是在給藥劑量為10mg/kg和15mg/kg時(shí)，小鼠表現(xiàn)出非常明顯的減重效果。
12.結(jié)論
從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，小鼠給予實(shí)施例一到實(shí)施例五制備得到的脂肪組織靶向多肽供試品，小鼠體重都出現(xiàn)了明顯的下降，表明實(shí)施例一到實(shí)施例五的靶向多肽具有明顯的治療效果，可以降低小鼠的體重，緩解小鼠肥胖癥狀。而且小鼠體重的變化隨時(shí)間逐步下降，表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性。樣品篩選結(jié)果表明實(shí)施例五的靶向多肽表現(xiàn)出最好的抗肥胖治療效果。同時(shí)劑量篩選結(jié)果 顯示實(shí)施例五的靶向多肽在給藥劑量為10mg/kg和15mg/kg時(shí)減重效果明顯，可以用于緩解小鼠肥胖，降低小鼠體重，而且有劑量效應(yīng)。
最后說明的是，以上實(shí)施例僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，并不用于限制本發(fā)明，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的修改、等同替換和改進(jìn)等，均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。