專利名稱：特異性靶向人類胚胎干細胞的肽段與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種特異性靶向人類胚胎干細胞的肽段。
背景技術(shù)：
胚胎干細胞(embryonic stem cell, ES)是研究胚胎早期發(fā)生、細胞增埴與分化及基因表達調(diào)控等發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)研究的良好細胞模型系統(tǒng)，是細胞治療和組織工程的理想來源(Wobus AM, Boheler KR. Embryonic stem cells:prospects for development albiology and cell therapy. Physiol Rev.2005,85:635-678 ；Vats A，Bielby RC, TolleyNS，Nerem R，Polak JM. Stem cells. Lancet. 2005，366:592-602.)，并可用于藥物篩選(Pouton CW, Haynes JM. Embryonic stem cells as a source of models for drugdiscovery. Nat Rev Drug Discov. 2007，6:605-616)。近年來一直是生物學(xué)研究的熱點。ES細胞的高度自我更新能力和分化全能性是它區(qū)別于其它細胞的重要特征。目前對0ct4、Nanog、Sox2等胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的大量研究掲示這些ES細胞特異性標(biāo)志分子對維持ES細胞的自我更新和分化的全能性發(fā)揮著重要的作用(Nichols J, Zevnik B，Anastassiadis K， et a_L Formation of piuripotent stem cells m the mammalianembryo depends on the POU transcription factor 0ct4. Cell. 1998，95(3) :379-391 ;Avilion AA，Nicolis SK,Pevny LH, et al. Multipotent cell lineages in early mousedevelopment depend on S0X2 function. Genes Dev. 2003，17 (I) : 126-140)。ES 細胞膜表面蛋白質(zhì)則主要包括信號通路受體、黏附分子、轉(zhuǎn)運蛋白和蛋白水解酶類(Nunomura K etal. Cell surface Labeling and Mass Spectrometry Revea丄 Diversity of Cell surfaceMarkers and Signaling Molecules Expressed in Undifferentiated Mouse EmbryonicStem Cells. Mol Cell Proteomics. 2005，4:1968-1976. )，LIF、TGFb、BMP、FGF-PI3K 信號通路對ES細胞的自我更新起到重要作用(Rebecca Stewart，Miodrag Stojkovic andMajImda Lako. Mechanisms οι self-renewal in human emoryonic stem cells. Eur jCancer. 2006，42:1257-1272)。這些研究斗表明ES細胞表面特異性標(biāo)志分子可通過介導(dǎo)外源信號來調(diào)節(jié)ES細胞的増殖和分化行為。由于目前發(fā)現(xiàn)的ES細胞標(biāo)志分子數(shù)量有限，而且與其他的成體干細胞或腫瘤細胞有共同的表達，因此更多更特異的ES細胞標(biāo)志分子仍有待發(fā)現(xiàn)。釆用有效的手段發(fā)現(xiàn)特異性的、新的細胞表面標(biāo)志物對于研究干細胞保持自我更新和分化的信號通路、實現(xiàn)細胞増殖、定向誘導(dǎo)分化具有重要意義，并將有助于ES細胞的鑒定、分離純化、質(zhì)量控制，加快ES的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用。目前國際上對ES細胞表面特異性標(biāo)志分子的研究現(xiàn)主要釆用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進打(Adewumi，0·，et al. Characterization οι numan embryonic stem cell lines bythe International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 2007. 25(7):803-816 ；Dai,B. and T. P. Rasmussen. Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stemcells from differentiated cells. Stem Cells,2007. 25(10) :2567-2574 ；Shin, S.，etal. Whole genome analysis of human neural stem cells derived from embryonicstem cells and stem and progenitor cells isolated from fetal tissue. StemCells. 2007. 25(5) :1298-1306 ；3.Wang, D. and L. Gao. Proteomic analysis of neuraldifferentiation of mouse embryonic stem cells.Proteomics. 2005. 5(17):4414-4426.)。由于ES細胞膜表面標(biāo)志分子豐度低，其細胞免疫原性差，難于采用傳統(tǒng)的單克隆抗體技術(shù)來獲得特異抗體。蛋白組學(xué)采用ニ維電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)雖可高通量篩選ES細胞標(biāo)志分子，但其結(jié)果還需要進ー步驗證，其方法本身也較為費時費カ和價格昂貴。2007年國際干細胞研究所對全球17個實驗室的59株人ES細胞的基因表達研究表明這些細胞株之間存在31 弁(Aaewumi, 0. , et al. Cnaracterization of human embryonic stem ceil linesby the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 2007. 25(7):803-816)，很多研究均表明ES細胞具有群體異質(zhì)性，不同的培養(yǎng)條件會有不同的特異性標(biāo)志分子的異質(zhì)表達，加之ES細胞膜蛋白的提取相對困難，豐度低及疏水性使得不易用質(zhì)譜分析這些蛋白；這些因素使得目前發(fā)現(xiàn)的ES細胞表面標(biāo)志分子數(shù)量及其功能研究較為有限。噬菌體展示技術(shù)是ー項簡單、成熟的，能夠?qū)⑺栊再|(zhì)的多肽從具有大量變異體的集落中提取出來的高效篩選技術(shù)。自從Smith首次闡述該方法以來(Smith, Ir. P. Filamentous fusion phage:novel expression vectors tnat display clonedantigens on the virion surface. Science. 1985. 228 (4705) : 1315-1317.)，嗷菌體展示技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為了ー種發(fā)現(xiàn)新特性多肽以及改變已有多肽性質(zhì)的強大工具(15.Barry, M. A.，W. J. Dower, and S. A. Johnston. Toward cell-targeting gene therapyvectors:selection of cell-binding peptides from random peptide-presenting phagelibraries. Nature Medicine. 1996. 2(3) :299-305 ；16. Paschke，M. Phage display systemsand their applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 2006. 70(1):2-11 ；17. Petty, N. K.，et al. Biotechnological exploitation of bacteriophage research. Trends in Biotechnology. 2007. 25(1) :7-15. )□傳統(tǒng)的篩選方法多釆用純化抗原或重組抗原進行固相篩選，而篩選未知分子卻是許多研究工作所需要的，因此近年來使用噬菌體展示技術(shù)直接對細胞進行篩選發(fā)展非常迅速。釆用細胞篩選不需要預(yù)先知道細胞表面相關(guān)分子信息，直接用細胞進行篩選可保留其膜表面分子的原初信息，并更為真實地模擬配體和受體間的結(jié)合狀態(tài)。但由于細胞膜表面成分及其復(fù)雜，而所需要篩選的膜表面抗原往往又豐度低、免疫原性差，容易導(dǎo)致噬菌體的非特異結(jié)合，使得用細胞進行篩選難度較大。近年來發(fā)展的扣除篩選法，即用陰性細胞先行進行篩選，以去除非特異結(jié)合的噬菌體，再用陽性細胞進行多輪富集篩選即可較好地解決這類問題。在噬菌體展示技術(shù)用于篩選干細胞表面特異性標(biāo)志分子方面，已經(jīng)有報道將噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用到對單ー的成體干細胞進行篩選，獲得了許多特異性的，功能性的多肽(Nowakowski, u S.，et al. A specmc heptapeptide from a phage display peptidelibrary homes to bone marrow and binds to primitive hematopoietic stem cells.Stem Cells.2004.22 (6):1030-1038 ； 19.Letchford, J.，et al. Isolation of C15: Anovel antibody generated against mesenchymal stem cell-enriched adult humanmarrow. Journal of Immunological Methods. 2006. 308(1—2):124—137 ;20. Morita，Y.，etal.Selection and properties for the recognition of P19 embryonic carcinoma stemcells. Biotechnology Progress. 2006. 22(4) : 974-978)，但將嗷菌體庫篩選技術(shù)應(yīng)用到人類胚胎干細胞以及胚胎干細胞分化的研究中尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種特異性靶向人類胚胎干細胞的肽段。本發(fā)明所提供的特異性靶向人類胚胎干細胞的肽段，其氨基酸殘基序列為序列表中序列I所示的氨基酸殘基序列。上述特異性靶向人類胚胎干細胞的肽段的編碼核苷酸片段。所述編碼核苷酸片段的序列為序列表中序列2所示的核苷酸序列。本發(fā)明通過對噬菌體庫的篩選，獲得攜帶特異性靶向胚胎干細胞的肽段的噬菌體，實驗證明，該肽段可以與胚胎干細胞特異性結(jié)合，本發(fā)明的肽段或其編碼基因以及特異性靶向人類胚胎干細胞的量子點與噬菌體的復(fù)合物可以用于制備人類胚胎干細胞的識別， 標(biāo)記，和分選和藥物祀向的產(chǎn)品。


圖I為特異性靶向人類胚胎干細胞的氨基酸肽段的篩選流程2為人類胚胎干細胞的培養(yǎng)及AP (堿性磷酸酶)鑒定圖3為本發(fā)明肽段的特異性結(jié)合ELISA檢測結(jié)果。圖4為本發(fā)明肽段的特異性結(jié)合免疫熒光檢測檢測結(jié)果。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的試驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實施例I、特異性靶向人類胚胎干細胞的氨基酸序列的篩選特異性靶向人類胚胎干細胞的氨基酸肽段的篩選流程圖如圖I所示，為了除去非特異性的多肽，本實驗采用了減數(shù)雜交篩選法，即用自由分化的人類胚胎干細胞作為負篩材料，除去那些非特異性的噬菌體多肽，然后再用未分化的胚胎干細胞作為正篩材料，得到能與其特異性結(jié)合的多肽。具體步驟如下所述I、細胞的培養(yǎng)和準(zhǔn)備正向篩選細胞懸浮液的制備人類胚胎干細胞系X-Ol公眾可以以合法的方式從中國科學(xué)院干細胞庫(Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences)申請獲得)培養(yǎng)于P3輻照處理過的小鼠成纖維細胞(PMEFsCF-1)(上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司，貨號0303-200)上。培養(yǎng)用培養(yǎng)基為含體積百分含量為79%DMEM(Hycl0ne，Logan,新西蘭)，體積百分含量為 1%非必需氨基酸(nonessential amino acid, Gibco BRL, USA美國)，ImM L-谷氨酰胺(Gibco BRL,美國)，4ng/L bFGF (Invitrogen,廣州)，0. ImM b-mercaptoethanol (Amresco, Solon, Ohio美國)，和體積百分含量為20%血清替代物(KSR) (Gibco BRL，美國)，培養(yǎng)時間為14天(復(fù)蘇后第一代)，傳代后培養(yǎng)8天。在使用噬菌體展示肽庫篩選之前，胚胎干細胞用0. 5mg/ml的胰蛋白酶迅速消化，用磷酸緩沖液(PBS，pH7. 4)洗兩次，然后懸浮于封閉液中(含終質(zhì)量百分含量為3%FBS于pH7. 4的PBS中)，得到的細胞懸浮液用于做正向篩選。AP (喊性憐酸酶)檢測米用 Alkaline Phosphatase Detection Kit (milipore, German德國)。AP (堿性磷酸酶)檢測的結(jié)果如圖2所示，兩個孔均為胚胎干細胞克隆，紅色的顯示結(jié)果表明胚胎干細胞AP結(jié)果為陽性，干細胞生長狀況正常，圖2中，ES為復(fù)蘇后第7天的胚胎干細胞，平鋪細胞為滋養(yǎng)層CF-I細胞，聚團克隆為胚胎干細胞，由形態(tài)學(xué)可以看出，胚胎干細胞克隆緊湊生長，有清晰的邊緣，生長情況正常。dES為分化后的人類胚胎干細胞，細胞為鋪散狀態(tài)，失去清晰邊緣。負向篩選細胞懸浮液的制備負向篩選使用自有分化的胚胎干細胞X-Ol和P3輻照處理過的小鼠成纖維細胞PMEFsCF-1。這兩種細胞懸浮液的制備方法如下所述自有分化的胚胎干細胞將上述培養(yǎng)胚胎干細胞X-Ol形成克隆的核心挑除，留存周圍胚胎干細胞，用胎牛血清培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分為由體積百分含量為10%胎牛血清 (Gibco BRL，美國)和體積百分含量為90%DMEM(Hyclone，Logan，新西蘭)組成的培養(yǎng)基)，連續(xù)培養(yǎng)20天直至細胞失去胚胎干細胞特征，用于做負向篩選的分化后胚胎干細胞，將分化后胚胎干細胞也用O. 5mg/ml的胰蛋白酶迅速消化并懸浮于封閉液中。小鼠成纖維細胞(PMEFsCF-Ι)用用胎牛血清培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分為由體積百分含量為10%胎牛血清(Gibco BRL，美國)和體積百分含量為90%DMEM(Hyclone，Logan，新西蘭)組成的培養(yǎng)基)培養(yǎng)后，用0. 5mg/ml的胰蛋白酶迅速消化并懸浮于封閉液中。2、噬菌體肽庫篩選本實施例所用的噬菌體庫是Ph. D. -12噬菌體展示肽庫試劑盒中的Ph. D. -12噬菌體展示肽庫，該試劑盒購自NEW ENGLAND BI0-LABS,美國，該試劑盒中Ph. D.-12噬菌體展示肽庫使用的噬菌體載體為M13單鏈?zhǔn)删w，肽庫表達的隨機肽均在噬菌體次要包膜蛋白PlII的N端。M13噬菌體是絲狀噬菌體，是ー種溫和型噬菌體，不裂解宿主菌，成熟的噬菌體可分泌到培養(yǎng)基中，通過離心收集培養(yǎng)上清，再向其中加入沉淀劑即可將上清中大量噬菌體粒子沉淀下來，從而富集得到含外源基因產(chǎn)物的重組噬菌體。采用負篩/正篩的方法來進行篩選，具體包括下述步驟I)負篩接近I. 56 X IO11的噬菌體(Ph. D. -12噬菌體肽庫，NEW ENGLANDBI0-LABS,美國)被加入到Iml的懸浮的上述用作負向篩選的分化人類胚胎干細胞懸浮液中，在室溫中輕微晃動I小吋，3000rpm離心3分鐘。上清液中含有沒有結(jié)合分化細胞的噬菌體，將上清液轉(zhuǎn)入小鼠成纖維細胞(上述P3輻照處理過的小鼠成纖維細胞PMEFsCF-Ι)懸浮液中，室溫輕微晃動I小吋，3000rpm離心3分鐘，收集上清液。2)正篩將步驟I)獲得的上清轉(zhuǎn)入步驟I制備的人類胚胎干細胞系X-Ol懸浮液中，室溫輕微晃動I. 5小時，棄上清，所獲細胞與噬菌體的混合物用洗脫液I (含終質(zhì)量百分濃度為3%的BSA和終質(zhì)量百分濃度為0. 1%的Tween-20的pH7. 4的PBS)洗5次。接下來用I. 6ml洗脫液2 (含0. IM glycine-HCl，終質(zhì)量百分濃度為0. 1%的BSA，pH 2. 2的溶液)洗脫與細胞結(jié)合的噬菌體，然后加入0. 3ml中和液(pH 9. I, IM Tris-HCl溶液)，目標(biāo)噬菌體即在液體中。3)將上述所獲噬菌體于宿主細菌大腸桿菌ER2738 (Ph. D. -12噬菌體展示肽庫試劑盒中提供)中擴增后并進行滴定計數(shù)。通過2輪與上述步驟I)和步驟2)同樣的篩選，計算每ー輪的噬菌體得率。
噬菌體得率(Phage yield rate)=篩選后噬菌體量/加入噬菌體量表I.兩輪篩選后噬菌體的得率
權(quán)利要求
1.ー種特異性靶向人類胚胎干細胞的肽段，其氨基酸殘基序列為序列表中序列I所示的氨基酸殘基序列。
2.權(quán)利要求I所述特異性靶向人類胚胎干細胞的肽段的編碼核苷酸片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼序列，其特征在于所述編碼核苷酸片段的序列為序列表中序列2所示的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求I所述的肽段或其編碼基因在制備用于人類胚胎干細胞的識別和/或標(biāo)記和/或分選和/或藥物靶向的產(chǎn)品中的應(yīng)用。全文摘要
本發(fā)明公開了一種特異性靶向人類胚胎干細胞的肽段。該肽段，其氨基酸殘基序列為序列表中序列1所示的氨基酸殘基序列。本發(fā)明的特異性靶向人類胚胎干細胞的肽段可用于制備人類胚胎干細胞的識別和/或標(biāo)記和/或分選和/或靶向的產(chǎn)品。
文檔編號G01N33/68GK102731618SQ20121018588
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月7日
發(fā)明者趙文秀, 金磊, 馬嵐 申請人:清華大學(xué)深圳研究生院