專利名稱：靶向tnf家族受體并拮抗tnf作用的肽、組合物、方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及TNF/TNFR的調(diào)節(jié)劑，特別是拮抗TNF和TNF/TNFR介導(dǎo)的反應(yīng)、活性或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的肽及其衍生物。本發(fā)明亦涉及拮抗TNF和調(diào)節(jié)TNF介導(dǎo)的疾病或反應(yīng)的方法，所述TNF介導(dǎo)的疾病或反應(yīng)包括炎性疾病和病癥。
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背景技術(shù)：
在關(guān)節(jié)炎的進展中，滑膜、軟骨和骨都是生長因子、細胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生增多的位點，所述生長因子、細胞因子和炎癥介質(zhì)被認為是有助于發(fā)病[1，2]。雖然骨和滑膜均在關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中具有重要作用[1，3]，但是在開發(fā)疾病改善治療中大多數(shù)的努力集中于軟骨內(nèi)的分子事件。關(guān)節(jié)炎軟骨細胞經(jīng)歷一些列的復(fù)雜變化，包括增殖、分解代謝改變和最后死亡。在不同疾病階段的這些表型改變的調(diào)節(jié)在密集研究中，并集中于調(diào)節(jié)每個這些分立的軟骨細胞反應(yīng)的生物力學(xué)和生物化學(xué)信號[2，4]。在該調(diào)節(jié)級聯(lián)中，軟骨細胞它們自身是主要主角一不只是外來生物力學(xué)和生物化學(xué)刺激的靶標，而且它們自身是促進關(guān)節(jié)軟骨的惡化的細胞因子、蛋白酶和炎癥介質(zhì)的來源[1，2]。由關(guān)節(jié)炎軟骨細胞產(chǎn)生的致病分子包括腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素-I (IL-I)、IL-6、IL-8、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、ADAMTS、一氧化氮、前列腺素和白三烯[2，4]。亦有證據(jù)關(guān)節(jié)炎軟骨細胞表現(xiàn)增加的合成代謝活性，包括生長因子的釋放增加和II型膠原、蛋白聚糖和其他細胞外基質(zhì)蛋白合成增力口，以及與軟骨祖細胞肥大表型相關(guān)基因的表達增加[5-7]。以開發(fā)特定的治療價值的拮抗劑的目的，在過去的二十年期間在風濕病學(xué)中大量的研究集中于鑒定在類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)中導(dǎo)致炎性和退化過程的細胞因子和介質(zhì)。在所有的因子中，TNF-α受到最大的關(guān)注，因為它的位置在促炎細胞因子級聯(lián)的頂點，以及在RA的發(fā)病中它的統(tǒng)治地位。許多證據(jù)支持該理論，包括(I) TNF- α在來自RA患者的發(fā)炎的滑膜和軟骨中高水平表達；(2)抗-TNF-α抑制其他包括IL-I在內(nèi)的促炎細胞因子的產(chǎn)生；和(3)TNF_a可誘發(fā)關(guān)節(jié)炎癥、通過誘導(dǎo)金屬蛋白酶引發(fā)軟骨破壞以及刺激破骨細胞生成和骨再吸收。最重要地，用于RA的抗-TNF治療通過降低炎癥、改善患者機能和活力以及減弱軟骨和骨侵蝕已經(jīng)顯示顯著的結(jié)果?，F(xiàn)在有三種通過靶向TNF配體的抗-TNF治療，依那西普(恩利(Enbrel)，一種可溶性TNFR2_lgGl融合蛋白)、英利昔單抗(類克(Remicade), —種針對TNF-α的嵌合單克隆抗體)和阿達木單抗(一種針對TNF-α的人源化單克隆抗體)，它們已在臨床上用于治療多種炎性疾病，包括類風濕性關(guān)節(jié)炎。工程蛋白/肽現(xiàn)在提供新的一波治療產(chǎn)品。實際上，設(shè)計蛋白/肽治療藥現(xiàn)在超過和勝過FDA每年批準的新小分子藥物的數(shù)量。直接靶向細胞因子用于其系統(tǒng)移除(配體腐蝕(ablation))的抗體和免疫黏附素已成為有效的治療策略(例如，依那西普、阿達木單抗和英利昔單抗)，并在一些適應(yīng)癥中，細胞因子受體(例如阿那白滯素)的選擇性靶向可實現(xiàn)高度有效臨床結(jié)果。顆粒體蛋白/上皮肽前體(GEP)，亦被稱為PC細胞衍生的生長因子(P⑶GF)、acrogranin、前顆粒體蛋白(PGRN)、前上皮肽(PEPI)或G80，首先作為生長因子從條件組織培養(yǎng)基中純化[8，9，65，66，67]。GEP是一種有80kDa的表觀分子量的593-氨基酸分泌性糖蛋白[10，14]，其起自分泌生長因子的作用。GEP包含富半胱氨酸InOtJf (CX5_6CX5CCX8CCX6CCXDX2HCCPX4CX5_6C) (SEQ ID NO 9)的七個半重復(fù)，依P-G-F-B-A-C-D-E 的次序，其中所述A-G是全長重復(fù)而P是半個模體(圖I)。共有序列的C末 端包含保守序列CCXDX2HCCP (SEQID NO :10)，并被認為具有金屬結(jié)合位點以及參與調(diào)節(jié)功能[15]。特別地，GEP經(jīng)歷蛋白水解加工，伴隨釋放稱為顆粒體蛋白(或上皮肽)的小的6-kDa重復(fù)單位，其保留生物學(xué)活性[16]:肽在細胞生長測定中是有活性的[13]，并可能與炎癥有關(guān)[17]。GEP在快速循環(huán)上皮細胞中、在免疫系統(tǒng)的細胞中和在神經(jīng)元中大量表達[10-12，17]。高水平的GEP表達亦發(fā)現(xiàn)于一些人類癌癥中，并在多種癌癥中促進腫瘤生成，癌癥包括乳腺癌、透明細胞腎癌、侵襲性卵巢癌、成膠質(zhì)細胞瘤、脂肪細胞性畸胎瘤和多發(fā)性骨髓瘤[16，18-24]。雖然GEP主要作為分泌性生長因子起作用，但是亦發(fā)現(xiàn)它定位于細胞內(nèi)側(cè)并直接調(diào)節(jié)細胞內(nèi)活性[12，25-27]。GEP在細胞增殖調(diào)控中的作用已使用源自帶胰島素樣生長因子受體(IGF-IR)基因定向缺失的小鼠的小鼠胚胎成纖維細胞(R-細胞)充分表征。這些細胞不能夠響應(yīng)于前進通過細胞周期必需的IGF-I和其他生長因子(EGF和PDGF)增殖[28]。與此相反，GEP是唯一已知的能夠繞開IGF-IR需求的生長因子，因此促進R細胞的細胞生長[13，29]。愈來愈多的證據(jù)亦表明GEP在分化、發(fā)育和病理過程中的調(diào)節(jié)。它作為差異表達基因已經(jīng)從間皮分化[30]、大腦的性分化[31]、巨噬細胞發(fā)育[32]，和類風濕性關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎的滑膜[33]中分離得到。GEP亦顯示為創(chuàng)傷反應(yīng)和組織修復(fù)的重要介質(zhì)[21，34]。據(jù)報道GEP中的突變導(dǎo)致與染色體17相關(guān)聯(lián)的tau陰性額顳癡呆[35-38]。GEP的作用模式大部分仍未知。已報道一些GEP相關(guān)蛋白在多種過程中影響GEP作用。一個實例是分泌性白細胞蛋白酶抑制劑(SLPI)。彈性蛋白酶專門消化在顆粒體蛋白間接頭中的GEP，導(dǎo)致顆粒體蛋白肽的產(chǎn)生，表明該蛋白酶可能為重要的GEP轉(zhuǎn)化酶。SLPI通過直接與彈性蛋白酶結(jié)合或者通過將顆粒體蛋白肽與酶隔絕來阻斷該蛋白水解作用[34]。GEP可通過與人細胞周期蛋白Tl [26]和Tat-P-TEFb[25]相互作用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性。亦發(fā)現(xiàn)GEP與串珠蛋白聚糖相互作用，串珠蛋白聚糖是一種硫酸乙酰肝素蛋白聚糖；無串珠蛋白聚糖小鼠表現(xiàn)嚴重骨骼缺陷[19，39-41]。細胞因子的腫瘤壞死因子(TNF)家族在多種生物學(xué)功能中起著重要的作用，生物學(xué)功能包括炎癥、器官發(fā)生、宿主防御、自身免疫和細胞凋亡。這些有力的生物學(xué)介質(zhì)的作用通過受體-配體相互作用實現(xiàn),導(dǎo)致細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞表型改變。配體通過形成三聚體并與它們的相應(yīng)受體結(jié)合來發(fā)揮它們的功能。隨后受體寡聚化導(dǎo)致受體細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象改變，其于是使銜接蛋白的TNF受體相關(guān)因子(TRAF)家族成員能夠結(jié)合并開始信號級聯(lián)放大。TNFR2、TNFRl、TrkA、NGFR、CD 40、CD 30、0X_40、DR5、DR3、DR4 和 RANK 包括與不同的TRAF分子相互作用的一些TNF受體超家族成員(包括1-6) (Lewit-Bentley, A.，等，J. MoI. Biol. 199 :389-392 (1988)，Banner, D. ff.,等，Cel. 73 :431-445 (1993)，Karpusas,M.，等，Structure. 3 :1031-1039(1995)，Hymowitz, S. G.，等，MoI. Cell. 4 :563-571(1999)，MongkiIsapaya, J.，等，Nat. Struc. Biol. 6 :-1048-1053 (1999)，Cha, S. S.，等，J. Biol.Chem. 275 :31171-31177(2000))。兩種TNF受體(TNFR1和TNFR2)都在細胞中遍在表達并與它們的關(guān)聯(lián)配體(TNFa，一種重要的促炎細胞因子)相互作用[42-44]。人們普遍認為TNF α在病理生理學(xué)中起著非常重要功能，是強烈干擾細胞生長、分化和死亡的因子。TNF似乎不僅協(xié)調(diào)對感染和免疫損傷的急性反應(yīng)，而且似乎作為生理穩(wěn)態(tài)重建和調(diào)節(jié)所需的平衡因子起作用[45]。已發(fā)現(xiàn)TNF α影響骨骼發(fā)育在大多數(shù)已知的影響兒童縱向生長的炎性疾病中，它的水平增加[46，47]，且用TNF拮抗劑依那西普(恩利)治療難治的青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎，在兒童中顯示追趕(catch-up)生長[46，47] ；TNFa在跖骨器官培養(yǎng)物中調(diào)節(jié)生長板軟骨細胞并阻抑縱向生長[48]。
關(guān)節(jié)炎是一種退行性關(guān)節(jié)疾病，主要在老年群體中發(fā)生，在美國其目前影響超過46，000，000人。通常臨床癥狀是疼痛和強直，尤其是長時間活動后。在工業(yè)化社會里，關(guān)節(jié)炎是身體殘疾的首要原因，增加衛(wèi)生保健使用，并損害生活的質(zhì)量。在未來十年隨著人口增加和老齡化，關(guān)節(jié)炎病癥的影響預(yù)期上升。盡管關(guān)節(jié)炎疾病的盛行，但是它們精確的病因?qū)W、發(fā)病學(xué)和進展仍然超出我們的理解。積累的證據(jù)證明炎性細胞因子和生長因子在關(guān)節(jié)炎的病理過程中的重要性。關(guān)節(jié)連接中關(guān)節(jié)軟骨和骨的細胞外基質(zhì)的破壞被認為是通過過多的細胞因子活性以及炎性細胞因子和它們的生理拮抗劑間的不平衡介導(dǎo)。調(diào)節(jié)軟骨細胞和關(guān)節(jié)炎的生長因子和拮抗細胞因子的作用的抑制劑的分離因此從病理生理學(xué)和治療學(xué)兩者的角度看均極為重要。我們之前已鑒定顆粒體蛋白/上皮肽前體(GEP)為一種新的軟骨形成生長因子，其在軟骨形成中起著重要的作用(Xu，K等(2007) J Biol Chem 282(15)11347-1 1355 ；W0 2008/094687 A2)。在本領(lǐng)域仍需要更好和更徹底理解炎性疾病和病癥的過程，并由此干預(yù)炎性疾病和病癥，特別是TNF家族成員介導(dǎo)的過程和病癥。因此，本發(fā)明的目的是延伸我們對生長因子和細胞因子控制軟骨發(fā)育和關(guān)節(jié)炎的分子機制的理解，及其用于開發(fā)用于各種TNF相關(guān)疾病(包括炎性關(guān)節(jié)炎)的新的抗-TNF/TNFR治療干預(yù)的介質(zhì)。本文引用的參考文獻不應(yīng)理解為承認它們是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。發(fā)明概述考慮到GEP的生物學(xué)性質(zhì)，假設(shè)GEP可通過“經(jīng)典”細胞膜受體作用，如其他已知生長因子一樣。到目前為止，尚未鑒定功能受體。本文所述的我們的功能基因篩查導(dǎo)致作為新的GEP結(jié)合受體的TNF受體的分離。我們的研究證明GEP (顆粒體蛋白/上皮肽前體)是第一個直接靶向TNF受體(TNFR)的生長因子。因此GEP及其衍生肽代表新的通過作用于細胞因子受體的抗-TNF/TNFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷劑。本文所述的研究證明GEP是新的TNF/TNFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑。本發(fā)明顯示1)GEP以劑量依賴方式與TNF受體直接結(jié)合；2)通過中和抗體或重組細胞外結(jié)構(gòu)域阻斷TNF受體廢除了 GEP在細胞增殖的刺激中的功能；3)GEP有力激活Erkl/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并適度激活A(yù)kt途徑；4) GEP激活已知是TGFii亞家族的下游分子的基因，包括BMP2 ;另外，GEP介導(dǎo)的這些基因表達的誘導(dǎo)依賴于TNF受體；5)GEP是關(guān)節(jié)炎反應(yīng)基因并且在關(guān)節(jié)炎患者中它的水平是顯著升高的；6)GEP作為TNF α的拮抗劑，顯著減少由TNF α誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡；和7);重要地，GEP比恩利和類克表現(xiàn)出更好(至少一樣好)地抑制TNF刺激的炎癥，恩利和類克已在臨床上用于治療多種炎性疾病和病癥，包括類風濕性關(guān)節(jié)炎。這些發(fā)現(xiàn)揭示GEP是通過直接靶向TNF受體的TNF/TNFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的新的天然存在的拮抗劑。本發(fā)明提供GEP和GEP肽(特別包括表示為atsttrin的肽)，其作為TNF/TNFR活性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑，尤其抑制或阻斷TNF介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或反應(yīng)，特別地作為TNF/TNFR的拮抗劑。本發(fā)明提供這樣的肽，其拮抗TNF家族成員受體(尤其TNFR)，并阻斷、抑制、降低或預(yù)防TNF家族成員信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括TNF/TNFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本發(fā)明提供這樣的肽，其拮抗TNF家族成員受體(尤其RANK)，并阻斷、抑制、降低或預(yù)防TNF家族成員信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括RANK/RANKL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一個具體實施方案中，本發(fā)明涉及本文公開的GEP肽和atsttrin家族的所有成員，其能夠調(diào)節(jié)、尤其拮抗TNF家族/受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和反應(yīng)，尤其TNF/TNFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和反應(yīng)。肽家族包括片段或部分，包括GEP序列和半單位的混合部分，尤其包括一個或多個顆粒體蛋白單位和一個或多個GEP的接頭單位。在一個方面，肽包含兩個以上的顆粒體蛋白單位的半單位和一個或多個GEP的接頭單位。在本發(fā)明一個具體方面，GEP肽包含肽atsttrin,其包含顆粒體蛋白單位A、C和F的半單位與接頭單位P3、P4和P5組合的組合。在一個具體方面，GEP肽包含顆粒體蛋白單位的半單位和接頭單位的組合，其中至少一個半單位是1/2F，接頭單位尤其為至少兩個接頭單位。在另一個具體方面，atsttrin具有圖24所示的氨基酸序列，并且包含顆粒體蛋白單位和接頭單位1/2F-P3-P4-1/2A-P5- ! /_C，其包含如SEQ ID NO 2中所示。本發(fā)明自然預(yù)期用于制備本發(fā)明的GEP肽和/或atsttrin的一些方法，包括如本文舉例說明的方法和/或使用已知的重組技術(shù)，并且本發(fā)明因此旨在在其范圍內(nèi)涵蓋這種合成制備。本文公開的拮抗劑氨基酸序列的測定有助于通過任何各種合成方法或任何已知技術(shù)再生產(chǎn)，并且因此本發(fā)明延伸到用于通過重組DNA技術(shù)在宿主系統(tǒng)中表達的表達載體和所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化宿主,其中所述表達載體包含編碼本發(fā)明的肽的核酸。本發(fā)明亦涉及重組DNA分子、重組核酸或克隆基因或者其簡并變體(優(yōu)選核酸分子，特別是重組DNA分子或克隆基因)，其編碼示于圖24的一種或多種GEP肽或其變體的氨基酸。在一個具體實施方案中，重組DNA分子、重組核酸或其簡并變體(優(yōu)選核酸分子)編碼能夠拮抗TNF/TNFR的GEP肽，其包含圖I和圖23的GEP序列中所示的一個或多個顆粒體蛋白單位和一個或多個GEP的接頭單位。在另一個具體實施方案中，重組DNA分子、重組核酸或其簡并變體(優(yōu)選核酸分子)編碼如圖24所示的能夠拮抗TNF/TNFR的GEP肽atsttrin，其包含顆粒體蛋白單位和接頭單位1/2F-P3-P4-1/2A-P5- ! /2C(SEQ ID NO:2)。本發(fā)明的目的是提供用于治療方法的藥物組合物，其包含或者基于GEP肽和/或atsttrin。藥物組合物包含一種或多種具有TNF拮抗活性的GEP肽和/或atsttrin的組合。藥物組合物包含一種或多種具有TNF拮抗活性的GEP肽和/或atsttrin以及一種或多種炎癥介質(zhì)的組合。炎癥介質(zhì)包括和可選自非留體抗炎劑(NSAID)、類固醇、糖皮質(zhì)激素、其他TNF拮抗劑(例如依那西普、阿達木單抗和英利昔單抗)和細胞因子受體拮抗劑(例、如阿那白滯素)。藥物組合物包含一種或多種具有TNF拮抗活性的GEP肽和/或atsttrin以及一種或多種炎癥介質(zhì)、免疫調(diào)節(jié)(immunododulatory)劑、或抗癌劑的組合。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及特定治療方法，其基于GEP、GEP肽和/或atsttrin或者其活性片段的TNF/TNFR拮抗活性，或者基于確定為具有相同活性的物質(zhì)或其他藥物。因此，本發(fā)明提供預(yù)防和/或治療以下疾病的方法由TNF/TNFR活性介導(dǎo)的疾病和/或由TNF家族配體/受體活性促進或誘導(dǎo)的疾病和/或由炎癥表征的疾病。本發(fā)明提供治療、減輕或預(yù)防TNF介導(dǎo)的疾病和炎性病癥或免 疫病癥的方法，所述疾病或病癥包括類風濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、牛皮癬、炎性腸病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、葡萄膜炎、炎性肺病、慢性阻塞性肺病。在一個方面，本發(fā)明提供用于治療、減輕或預(yù)防由GEP、TNF、GEP/TNFR和/或TNF/TNFR介導(dǎo)的腫瘤或癌癥的方法。因此，預(yù)期以下腫瘤、癌性病癥或癌前病癥可能對本發(fā)明的TNF/GEP拮抗劑肽敏感其中腫瘤或者癌細胞/癌前細胞的生長和/或增殖依賴于或由GEP、TNF、GEP/TNFR和/或TNF/TNFR活性或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進。本發(fā)明還預(yù)期GEP肽(特別包括atsttrin)抑制或阻斷GEP介導(dǎo)的癌癥或細胞增殖的用途和應(yīng)用。更具體而言，治療方法提供用于治療、預(yù)防或減輕由TNF/TNFR活性介導(dǎo)的疾病和/或由TNF家族配體/受體活性促進或誘導(dǎo)的疾病和/或由炎癥表征的疾病的方法，所述方法是通過給予包含有效量的基于GEP、GEP肽和/或atsttrin或者其亞基的TNF拮抗劑的藥物組合物，或者例如本發(fā)明另一個方面制備和使用的通過藥物篩查測定開發(fā)的其他等效藥物。在一個具體方面，可給予GEP、GEP肽和/或atsttrin來治療、減輕或預(yù)防TNF/TNFR介導(dǎo)的疾病或病癥或者炎性疾病或病癥。在另一個方面，GEP、GEP肽和/或atsttrin或其亞基可用于調(diào)節(jié)、預(yù)防、治療或減輕免疫損傷的方法，免疫損傷包括變態(tài)反應(yīng)、自身免疫疾病和其他這樣的免疫病癥，尤其是其中涉及或牽連TNF/TNFR的免疫損傷。因此，在自身免疫、變態(tài)反應(yīng)或其他這樣的免疫病癥中的免疫和/或炎性反應(yīng)可由GEP、GEP肽和/或atsttrin或其亞基調(diào)節(jié)。在一個這樣的方面，自身免疫疾病(例如狼瘡和多發(fā)性硬化)可由GEP、GEP肽和/或atsttrin或其亞基調(diào)節(jié)、減輕或治療。特別地，本發(fā)明的GEP、GEP肽、atsttrin肽(包括如本文所述的和本文圖23和24提供的)，它們的抗體、激動劑、模擬物或其活性片段，在以下情況下可制備成用于給藥的藥物制劑其中抗-TNF或TNF/TNFR家族拮抗劑活性和/或治療是適當?shù)?，例如為了治療或減輕TNF或TNF/TNFR介導(dǎo)的病癥或炎癥。GEP、GEP肽和atstrrin肽包括在SEQ ID NO :1和8中所示的例示性GEP和在SEQ ID NO 2和3-7中所示的GEP肽或atsttrin肽，以及其變體或亞基。本文GEP肽和/或atsttrin的特異性使其可更好地處理目前抗-TNF和/或抗炎治療的后效，并且由此使其可作為通用的抗-TNF和/或抗-TNF家族劑廣泛應(yīng)用。本發(fā)明包括用于篩查潛在藥物或化合物的測定系統(tǒng)，所述藥物或化合物通過模擬GEP肽的活性而有效調(diào)節(jié)靶哺乳動物細胞的TNF/TNFR活性。該方面包括用于篩查以與GEP和atstrrin肽相似的方式有效調(diào)節(jié)TNF/TNFR活性的另外的活性GEP片段、顆粒體蛋白/接頭單位組合、衍生物、變體和氨基酸修飾。在一個實例中，將測試藥物或化合物給予含有TNF α以激活TNF/TNFR活性的細胞樣品，以通過與對照比較來確定測試藥物或化合物對TNF α活性的影響，包括其中對照是GEP肽、atsttrin的情況。
在測定中，可制備對照量的GEP、GEP肽、atsttrin、TNFa、TNFR或其抗體等，并用酶、特異性結(jié)合伙伴和/或放射性元件標記，并可接著引入到細胞樣品中。在標記的材料或其結(jié)合伙伴)具有與樣品內(nèi)的位點反應(yīng)的機會后，可通過已知的技術(shù)檢測所得質(zhì)量，這可隨連接的標記性質(zhì)而不同。在使用放射性標記例如同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、9°Y、125l、131I和186Re的情況中，可利用已知當前可用的計算方法。在標記是酶的情況中，可通過任何本領(lǐng)域已知的當前使用的比色技術(shù)、分光光度技術(shù)、熒光分光光度技術(shù)、電流分析技術(shù)或氣體定量分析技術(shù)完成檢測?；仡檯⒄找韵玛U述性附圖進行的下文描述，其他目的和優(yōu)點對本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見。附圖簡沭圖I描述GEP生長因子的結(jié)構(gòu)。對于單位共有序列，C代表半胱氨酸、D代表天冬氨酸、P代表脯氨酸、T代表蘇氨酸、G代表甘氨酸、H代表組氨酸；圓點代表任何氨基酸。
圖2 (A)酵母中GEP與TNFR的結(jié)合。將所示每對質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到酵母株MAV203中。在SD-leu7trp" /his7ura/ /3AT+平板上篩選酵母轉(zhuǎn)化體,并測試β-半乳糖苷酶活性。使用已知相互作用的c-Jun和c-Fos作為陽性對照,而使用不存在相互作用的Rb和核纖層蛋白作為陰性對照。(B)軟骨細胞中GEP與TNFR2締合。將制備自人軟骨細胞的細胞提取物與對照IgG、抗-TNFR2抗體一起孵育，然后與蛋白A瓊脂糖一起孵育。通過用抗-GEP抗體的免疫印跡來檢測免疫沉淀的蛋白復(fù)合物和細胞提取物(泳道1，陽性對照)。圖3描述TNFRl細胞外結(jié)構(gòu)域(TNFR1ECD)和TNFR2細胞外結(jié)構(gòu)域(TNFR2ECD)與包被在微量滴定板上的重組GEP的固相結(jié)合。圖4(A)用于繪制其片段與GEP結(jié)合的TNFR2構(gòu)建體的示意圖。⑶β _半乳糖苷酶測定。圖5描述MTT測定。在不存在(CTR)或存在50ng/ml GEP (GEP)或者GEP加Iug/ml 抗-TNFRl (GEP+TNFR1 ab)、抗 TNFR2 (GEP+TNFR2 ab)或 lug/ml 的抗 _IGFIR(GEP+TGF1Rab，用作對照)的條件下培養(yǎng)人軟骨細胞，并使用MTT測定分析細胞增殖。圖6. GEP在人C28I2軟骨細胞中激活A(yù)kt和Erkl/2途徑。注意存在膠片的長時間(5分鐘，左圖)和短時間(30秒，右圖)的曝光。圖7描述對于在50ng/ml GEP存在下培養(yǎng)的原代野生型(B6)、TNFRl-/-和TNFR2-/-MLE 細胞，使用實時 PCR 得到的基因 Gadd45b、JunB, KLF2、Smad7、Sox4 和 Tcf8 不同時間點的表達概況分析。圖8描述用于舉例說明包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和靶基因表達在內(nèi)的細胞內(nèi)事件的模型。圖9(左)用于繪制其片段與TNFR結(jié)合的GEP構(gòu)建體的示意圖。(右)β -半乳糖苷酶測定。

圖10 (左)GEP構(gòu)建體的示意圖。(右)β -半乳糖苷酶測定。圖11 (左)GEP構(gòu)建體的示意圖。(右)半乳糖苷酶測定。圖12 (左)用于繪制其片段與TNFR結(jié)合的GEP構(gòu)建體的示意圖。(右)β _半乳糖苷酶測定。圖13(左)用于繪制其片段與TNFR結(jié)合的GEP構(gòu)建體的示意圖。(右)β _半乳糖苷酶測定。
圖14(左)用于繪制其片段與TNFR結(jié)合的GEP構(gòu)建體的示意圖。(右)β _半乳糖苷酶測定。圖15(左)用于繪制其片段與TNFR結(jié)合的GEP構(gòu)建體的示意圖。(右)β _半乳糖苷酶測定。圖16 (A)Atsttrin以劑量依賴方式抑制由TNF引發(fā)的呼吸爆發(fā)；(B) Atsttrin、類克和恩利對TNF引發(fā)的呼吸爆發(fā)的作用。結(jié)果為一式三份培養(yǎng)物中由1.5父104細胞/孔產(chǎn)生的nmol H202的平均值。圖17描述TUNEL染色測定。使大鼠軟骨肉瘤(RCS)細胞和人C28I2軟骨細胞血清饑餓24小時，以除去外源生長因子和細胞因子的影響。之后，用O. 02% BSA(CTR)、50ng/ml的GEP (GEP)、10ng/ml的TNF- α或GEP加TNF- α刺激細胞36小時。通過使用TUNEL測定試劑盒測量細胞凋亡。 圖18顯示GEP抑制TNFa誘導(dǎo)的金屬蛋白酶。在不存在或存在任一種補充所示不同量的GEP的5ng/ml的TNF α的條件下，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)人軟骨外植塊I天并進行實時PCR。單位是任意的并且在每組中最左邊的條表示相對水平為I。圖19用于解釋Atsttrin、恩利和類克的抗炎機制的建議模型。Atsttrin通過直接與TNF受體結(jié)合阻斷TNF/TNFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而恩利和類克通過靶向TNF配體干擾信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。圖20顯示Atsttrin中和GEP刺激的癌細胞的細胞生長(MTT測定)。在不存在(CTR)或存在GEP(200ng/l)且有或沒有所示不同量的Atsttrin的條件下，培養(yǎng)RCS軟骨肉瘤(左圖)和Saos-2骨肉瘤(右圖)，并使用MTT測定分析細胞增殖。圖21描述來自氣囊急性炎癥模型的小鼠的無細胞溢泌物中IL-6和IL-13水平。描述對照(CTR)和給予類克(10yg/g), GEPdOy g/g)和Atsttrin (10 μ g/g)的動物的IL-6 和 IL-13 水平。圖22描述通過TRAP染色評價的RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞發(fā)生。在RANKL單獨或者與不同量的GEP或atsttrin存在下孵育Raw 264. 7巨噬細胞4天。圖23提供593個氨基酸的人GEP (SEQ ID NO I)的氨基酸序列。圖24描述atsttrin肽的序列(SEQ ID NO :2)，和多種其他測試肽的序列(分別是 SEQ ID NO :3-7)。圖25A和25B描述小鼠GEP的(A)結(jié)構(gòu)和(B)氨基酸序列(SEQ ID NO 8)。在(B)中，顆粒體蛋白單位GrnA、GrnC、GrnD和GrnE有下劃線并在每個單位中指出。圖26顯示GEP除TNFR外還與RANK和FAS締合，而Atsttrin特異結(jié)合TNFR (酵母雙雜交測定)。將所示各對質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到酵母株MAV203中。在SD-Iei^trpi /hisVura73AT+平板上篩選酵母轉(zhuǎn)化體，并測試β _半乳糖苷酶活性。使用無相互作用的Rb和核纖層蛋白作為陰性對照(Neg.CTR)。圖27 提供 GEP (PGRN)和 TNF α 與 TNFRl (Rl)和 TNFR2 (R2)的結(jié)合的 FastStep 動力學(xué)測定。圖28A、28B和28C提供(A)重組Atsttrin的表征。與谷胱;甘妝瓊脂糖樹脂綴合的GST-Atsttrin和通過Xa因子釋放的Atsttrin通過SDS-PAGE分離，并用考馬斯亮藍R-250對蛋白質(zhì)染色。(B)和(C)提供Atsttrin和TNFa與TNFRl (Rl)和TNFR2 (R2)結(jié)合的FastStep 動力學(xué)測定。
圖29 描述使用 GEP、Atsttrin 和 GEP+Atsttrin 針對 p-AKT、p-ERK 和微管蛋白對照進行的PathScan 多重蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。GEP激活A(yù)kt和Erkl/2途徑二者,但Atsttrin不是。在聯(lián)合研究中，Atsttrin阻斷GEP介導(dǎo)的致癌p_AKT和p-ERK途徑的激活。圖30A 和 30B 描述用 PBS (η = 10)、Atsttrin (η = 10)或恩利(η = 10)治療的CIA小鼠中關(guān)節(jié)炎的嚴重性(A)(通過臨床評分)和發(fā)病率(B)。圖31提供用PBS、Atsttrin或恩利治療的正常小鼠和CIA小鼠的前爪(頂部)和后爪(底部)的照片。圖32A和32B描述⑷用所示H&E或Safranin-O染色的PBS治療動物和Atsttrin治療動物的各踝關(guān)節(jié)的切片。在H&E圖中，箭頭分別指示組織破壞和細胞浸潤。在Sarfanin-O圖中，箭頭指示基質(zhì)染色失敗。(B)顯示PBS治療動物和Atsttrin治療動物的踝關(guān)節(jié)的MicroCT圖。
圖33提供在PBS治療動物和Atsttrin治療動物中的TRAP染色圖。在PBS治療動物中TRAP+破骨細胞示為紅染色，但在Atsttrin治療動物中幾乎不能檢測到。為了視覺鮮明示出不同的放大倍數(shù)。圖34描述與對照PBS (陰性對照)和恩利(陽性對照)相比，Atsttrin對促炎細胞因子IL-I β和IL-6以及抗炎細胞因子IL-10和IL-13的影響。*、林和林*分別表示P< O. 05、P < O. 01 和 P < O. 001。圖35提供在膠原免疫以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎后25天開始，在用PBS、恩利或Atsttrin治療的CIA動物中的臨床評分數(shù)據(jù)。圖36描述GEP和Atsttrin對TNF誘導(dǎo)的亞硝酸鹽產(chǎn)生的影響。向RAW264. 7細胞中加入TNF α并伴隨加入所示O. 3nM、I. 5ηΜ或7. 5ηΜ的GEP,Atstrrin或恩利，并測量μ M亞硝酸鹽。圖37 在 TNF- a、TNF- α 和 GEP 或者 TNF- α 和 Atsttrin 存在下，通過 RAW264. 7細胞的免疫熒光評價TNF誘導(dǎo)的NF- K B的核積累。與核DAPI染色相比，對于NF- κ B ρ65是對細胞染色，合并(merge)兩種染色。在GEP或Atsttrin存在下，NF-κ B染色保持胞質(zhì)的。圖38顯示在僅TNF- α或者聯(lián)合增加濃度的GEP或Atsttrin存在下TNF激活的NFKB報道基因的倍數(shù)誘導(dǎo)。GEP和Atsttrin抑制TNF- α介導(dǎo)的NFKB報道基因的激活。迸述根據(jù)本發(fā)明，可使用本領(lǐng)域技術(shù)中的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這樣的技術(shù)在文獻中有充分描述。參見例如Sambrook等"Molecular Cloning A Laboratory Manual " (1989) ； " Current Protocols in Molecular Biology "第I-III 卷[Ausubel, R.M.,主編(1994)] ； " Cell Biology A Laboratory Handbook "第 I-III 卷[J.E.Celis,主編(1994))] ； " Current Protocols in Immunology "第 I-III 卷[Coligan, J. E.,主編(1994)] ； " Oligonucleotide Synthesis " (MJ.Gait 主編 1984) ； " Nucleic Acid Hybridization " [B. D. Hames 和 S. J. Higgins 主編(1985)] ； " Transcription And Translation " [B. D. Hames 和 S. J. Higgins,主編(1984)] ； " Animal Cell Culture" [R. I. Freshney,主編(1986) ] ； " Immobilized CellsAnd Enzymes" [IRL Press, (1986)] ；B.Perbal, " A Practical Guide To MolecularCloning" (1984)。因此，如果本文出現(xiàn)，下列術(shù)語應(yīng)具有下文所示定義。術(shù)語“Atsttrin”、“通過靶向TNF受體的TNF/TNFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑”、“atsttrin肽”、“TNF拮抗劑肽”和未具體列出的任何變體在本文中可互換使用，并如貫穿本申請和權(quán)利要求所用，指包括單個或多個蛋白的肽，特別是源自或是GEP的片段的那些，并延伸至這些蛋白質(zhì)其具有本文所述且在圖24中示出且還在圖15中圖示的氨基酸序列數(shù)據(jù)，和具有本文描述和示出并在權(quán)利要求書中提供的活性和能力特征。本文中包括和提供活性GEP肽，其具有作為TNF/TNFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)拮抗劑的活性并能夠結(jié)合一種或多種TNF受體，例如TNFa。人GEP的全長序列在圖23中提供。小鼠GEP的全長序列在圖25中提供。因此，本文涵蓋源自GEP序列或包含GEP序列并具有TNF和/或TNF家族拮抗劑活性的TNF拮抗劑肽。這些atsttrin肽包括和涵蓋肽的片段、變體和衍生物。因此，同樣預(yù)期顯示基本上等價活性的蛋白及其修飾物。這些修飾可為有意的，例如，例如通過定點誘變獲得的修飾，或可為偶然的，例如在是復(fù)合物或其指定亞基的生產(chǎn)者的宿主中通過突變獲得的修飾。另外 預(yù)期與人atsttrin及活性GEP肽序列相應(yīng)的小鼠或其他物種或直向同源物GEP序列。同樣，術(shù)語“Atsttrin”、“通過靶向TNF受體的TNF/TNFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗劑”、“atsttrin肽”、“TNF拮抗劑肽”旨在在其范圍內(nèi)包括本文具體敘述的蛋白以及所有基本上同源的類似物和等位變體。本文所述的氨基酸殘基優(yōu)選為“L”異構(gòu)形式。然而，“D”異構(gòu)形式的殘基可置換為任何L-氨基酸殘基，只要所需的結(jié)合免疫球蛋白的功能性質(zhì)由多肽保留。NH2指位于多肽氨基端的游離氨基。COOH指位于多肽羧基端的游離羧基。與J. Biol. Chem.，243 :3552-59(1969)標準多肽命名法一致，氨基酸殘基的縮寫示于下列對應(yīng)表中對應(yīng)表
權(quán)利要求
1.一種分離肽，所述肽包含一個或多個顆粒體蛋白單位和一個或多個顆粒體蛋白/上皮肽前體(GEP)的接頭單位，并能夠拮抗TNF家族成員信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述肽包括其變體。
2.權(quán)利要求I的分離肽，所述肽包含圖23的人GEP的一個或多個顆粒體蛋白單位和一個或多個接頭單位，并能夠拮抗TNF和TNF/TNFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
3.權(quán)利要求I的分離肽，所述肽至少包含圖23和/或圖24所示GEP的1/2F、ViK和.1/2C顆粒體蛋白單位以及圖23和/或圖24所示GEP的接頭單位P3、P4和P5。
4.權(quán)利要求I的分離肽，所述肽包含圖24所示的1/2F-P3-P4-1/2A-P5-! /2C(SEQ IDNO 2)。
5.權(quán)利要求I的分離肽，其中所述肽或變體能夠與TNFRl和/或TNFR2結(jié)合。
6.一種組合物，所述組合物包含一種或多種權(quán)利要求I的肽以及一種或多種抗炎劑或化合物、抗癌劑或化合物和免疫調(diào)節(jié)劑。
7.權(quán)利要求6的組合物,所述組合物是治療組合物或藥物組合物,任選還包含藥學(xué)上可接受的載體、溶媒或稀釋劑。
8.—種藥物組合物，所述組合物包含權(quán)利要求I的肽和藥學(xué)上可接受的載體、溶媒或稀釋劑。
9.一種分離核酸,所述核酸能夠編碼權(quán)利要求1-5中任一項的肽。
10.一種載體，所述載體包含權(quán)利要求9的核酸和用于表述所述核酸的工具。
11.權(quán)利要求10的載體，其中所述核酸與使所述核酸能夠在細胞中表達的信號有效連接。
12.—種調(diào)節(jié)、阻斷或者抑制哺乳動物細胞或受試者中TNF或TNF/TNFR活性或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，所述方法包括將包含GEP、GEP肽或atsttrin的組合物給予所述細胞或受試者。
13.—種調(diào)節(jié)、阻斷或者抑制哺乳動物細胞或受試者中TNF活性或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，所述方法包括將權(quán)利要求8的組合物給予所述細胞或受試者。
14.一種預(yù)防、減輕和/或治療受試者中由TNF/TNFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的疾病或病癥的方法，所述方法包括將包含GEP、GEP肽或atsttrin的組合物給予所述受試者。
15.一種預(yù)防、減輕和/或治療受試者中由TNF/TNFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的疾病或病癥的方法，所述方法包括將權(quán)利要求8的組合物給予所述受試者。
16.權(quán)利要求14或15的方法，其中所述疾病或病癥是炎性疾病或病癥、免疫疾病或病癥或者癌癥。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述炎性疾病或病癥選自類風濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、牛皮癬、炎性腸病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、葡萄膜炎、炎性肺病和慢性阻塞性肺病。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述免疫疾病或病癥選自變態(tài)反應(yīng)和自身免疫疾病。
19.一種用于篩選有效拮抗或抑制TNF/TNFR活性的潛在藥物或化合物的測定系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括將潛在藥物或化合物給予含TNF以激活TNF/TNFR活性的細胞樣品，并通過與對照比較來確定潛在藥物或化合物對TNF活性的影響，其中所述對照是TNF的拮抗劑。
20.權(quán)利要求18的測定系統(tǒng)，其中所述TNF是TNFa，所述對照是權(quán)利要求I的肽。
21.權(quán)利要求18的測定系統(tǒng)，其中所述TNF是TNFa，所述對照是asttrin。
全文摘要
本發(fā)明提供TNF的調(diào)節(jié)劑，尤其肽及其衍生物，尤其GEP肽，其拮抗TNF和TNF介導(dǎo)的反應(yīng)、活性或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本發(fā)明提供拮抗TNF和調(diào)節(jié)TNF介導(dǎo)的疾病或反應(yīng)的方法，其中所述TNF介導(dǎo)的疾病或反應(yīng)包括炎性疾病和病癥。本發(fā)明提供GEP肽的組合物，包括與其他炎癥介質(zhì)組合的組合物。本發(fā)明提供治療、減輕或預(yù)防TNF介導(dǎo)的疾病和炎性病癥的方法，其中所述TNF介導(dǎo)的疾病和炎性病癥包括類風濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、牛皮癬、炎性腸病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、葡萄膜炎、炎性肺病、慢性阻塞性肺病。
文檔編號C07H21/00GK102724993SQ201080028432
公開日2012年10月10日 申請日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月17日
發(fā)明者C·劉 申請人:紐約大學(xué)