一種rgd多肽靶向的鋅摻雜的四氧化三鐵納米顆粒的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種RGD多肽靶向的鋅摻雜的四氧化三鐵納米顆粒的制備方法。該方法通過準(zhǔn)確控制鋅的摻雜量來提高Fe304 NPs的磁飽和值，并在其表面修飾腫瘤靶向肽RGD，最終得到了一種腫瘤靶向性的納米復(fù)合磁性材料。本發(fā)明屬于納米生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]氧化鐵納米顆粒(1NPs)是一種極好的磁革El向性納米材料，在制藥學(xué)方面具有廣泛的研究，比如提高藥物協(xié)同效應(yīng)在穿透血腦屏障(BBB)時的應(yīng)用等等[23]。納米技術(shù)的發(fā)展使得在磁場(外磁場或內(nèi)置磁場)的幫助下，利用超順磁納米氧化鐵(SP10N)作為藥物載體系統(tǒng)可以使藥物穿過血管系統(tǒng)定向性的到達(dá)腫瘤部位成為可能。比如，在2004年，為了檢驗磁靶向的阿霉素(Dox)到達(dá)肝癌細(xì)胞處的效果，實驗于四個病人的三期臨床已經(jīng)開始執(zhí)行[24]。除此之外，人血清白蛋白(HSA)包裹的1NPS (HINP)做為藥物Dox的載體(D-HINPs)對患有乳腺癌的小鼠進行靜脈注射，可以觀察到Dox在HINP的幫助下可以穿透細(xì)胞膜甚至可以聚積在細(xì)胞核處，比單獨的Dox具有更好的腫瘤抑制效果。除此之外，1996年，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)1NPs可以作為人類肝和脾受損時做核磁共振成像(MRI)時的造影劑[18]。目前，有一些基于1NPs的造影劑(MR)已經(jīng)或是正在應(yīng)用于臨床試驗[19]。
[0003]為了保證在藥物釋放之前藥物載體能正確到達(dá)靶位點，1NPs必須具有足夠的磁力，這對磁力的有效利用非常有必要的。其中一種增大磁飽和值的方式就是摻雜二價金屬元素，常用來摻雜的金屬離子像Zn，Co, Ni, Cu和Μη等，這些摻雜的1NPs通常被簡稱為MxFe3 X04(x=0-1)。然而Zn摻雜的1NPs在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用上最為常見，原因之一就是Zn離子的毒性遠(yuǎn)比其他幾種金屬離子要小得多。
[0004]1NPs在這些生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用要求其具有較高的磁飽和值、較小顆粒尺寸(小于100nm)和較窄的顆粒尺寸分布。不僅如此，這些應(yīng)用還需要1NPs具有特殊的表面包裹。因此這就需要包裹的表面活性劑具有無毒和優(yōu)良的生物相容性。以前的研究表明二巰基丁二酸(DMSA)是無毒的，所以DMSA可以作為的表面活性劑來提高納米顆粒的生物相容性(B1materials, 2010, 31(2): 366-74)。而且用DMSA進行雙次水交換的1NPs表面帶有羧基和巰基，這些基團能為納米顆粒繼續(xù)連接生物分子和其他反應(yīng)。DMSA包裹的鋅摻雜的四氧化三鐵納米顆粒(DMSA-Zn0.4Fe2.604 NPs)，由于具有高的磁飽和值，因此在外磁場的作用下，可以被用作調(diào)控細(xì)胞凋亡的信號途徑的磁開關(guān)(Nature materials, 2012,11(12): 1038-43.)。初步的體外細(xì)胞實驗表明DMSA-Zn0.4Fe2.604 NPs對健康細(xì)胞無毒性效應(yīng)(Angewandte Chemie, 2009, 48(7): 1234-8)。對小鼠進行灌胃給藥一個月以后，發(fā)現(xiàn)DMSA_Zna4Fe2.604 NPs也不會對小鼠產(chǎn)生明顯的毒性效應(yīng)。因此DMSA_Zna4Fe2.604 NPs可以作為納米磁性材料應(yīng)用與生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
[0005]為了增加DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs對目標(biāo)區(qū)域具有靶向性的準(zhǔn)確度，還可以讓DMSA-Zn。.4Fe2.604 NP s在外磁場的作用下可以結(jié)合一些蛋白質(zhì)、藥物、抗體、酶或是核苷酸，從而到達(dá)指定的組織器官或是腫瘤區(qū)。環(huán)狀的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(cRGD)，通過結(jié)合細(xì)胞上過表達(dá)的整合素avb3，可以有效調(diào)控靶向到達(dá)微血管系統(tǒng)的腫瘤(如惡性膠質(zhì)瘤)和癌細(xì)胞。很多R⑶靶向的磁性納米材料在成像(B1materials，2009，30，6912 - 6919)(B1materials Science，2015，3, 721)、熱療(Journal of B1materials Applicat1ns，2014，28(7) 1051 - 1059)、藥物載體運輸(B1materials, 2011, 32，4151-4160)等領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。但是為了增加磁性納米材料的靶向性、生物相容性，因此，制備以DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs為介質(zhì)，增加RGD為靶向抗體的新型造影劑或藥物載體系統(tǒng)，具有較高的研究意義和應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種以DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs為介質(zhì)，同時連接靶向分子的磁性納米材料的制備方法。該方法利用簡單經(jīng)濟的水熱合成法得到高磁飽和值、粒徑均一(約llnm)、單分性的Zna4Fe2.604 NPs，再進行兩次水交換得到生物相容性好的、物理化學(xué)性能穩(wěn)定的DMSA包裹的Z%4Fe2.604 NPs。最后通過連接c (RGDyK)從而得到雙重靶向性的磁性納米材料。所得的產(chǎn)物能滿足臨床應(yīng)用的需求。
[0007]為實現(xiàn)這樣的目的，在本發(fā)明的技術(shù)方案中，以一定比例的無機鐵鹽和無機鋅鹽為原料，在有機酸作為表面活性劑。同時以堿、醇類和水作為溶劑，在一定溫度時反應(yīng)若干個小時，即可制高磁飽和值、高結(jié)晶度的、顆粒均一的Zna4Fe2.604 NPs。進一步地，以DMSA作為表面活性劑進行兩次水交換，即可得到穩(wěn)定的水溶性納米顆粒。最后，以1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)_碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)為偶聯(lián)劑，將不同含量的c (RGDyK)與DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs進行連接，即可得到具有高靶向性的磁性納米材料。
[0008]—種RGD多肽靶向的鋅摻雜的四氧化三鐵納米顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
(1)DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs 的制備:
首先把FeS04.(NH4)2S04.6Η20和ZnS04溶解在20ml的水里，使得前體達(dá)到1.73X10 3mol Fe2+ and 2.67X 10 4 mol Zn2+ 的目的；其次，把 10ml 油酸、10ml 水和 lg NaOH 混合，在常溫下磁力攪拌直到得到均勻的溶液；再者，把前體Fe2+和Zn2+倒進該均勻溶液中，攪拌幾分鐘以后，混合溶液變成深棕色；最后把該溶液轉(zhuǎn)移進50ml反應(yīng)釜中，密封，230度加熱15個小時；反應(yīng)結(jié)束以后，冷卻至室溫，產(chǎn)品沉積在釜底，用環(huán)己烷溶解取出納米顆粒；再把乙醇加入容有納米顆粒的環(huán)己烷中，沉淀出納米顆粒，最后納米顆粒再用乙醇反復(fù)洗數(shù)次；顆粒表面的有機表面活性劑用二巰基丁二酸(DMSA)在60°C水浴機械攪拌12小時，重復(fù)兩次交換，得到DMSA包裹的鋅摻雜的超順磁四氧化三鐵納米顆粒，該納米顆粒能夠徹底溶解在水相中；
(2)c (RGDyK) -DMSA- Zn0.4Fe2.604 NPs 的制備:
取EDC和NHS溶解在PBS緩沖液中(PH=7.4，0.05M)中，并用0.2M的鹽酸調(diào)解PH。把上述溶解加入到一定量的DMSA-Zna4Fe2.604 NPs中，并超聲10分鐘，室溫下反應(yīng)；將混合物用PBS緩沖液(PH=7.4，0.01M)磁分離洗滌3次以除去多余的EDC和NHS，將活化后的DMSA-Zn0.4Fe2.604 NPs重新分散在PBS緩沖液中；把(:(RGDyK)溶解在PBS緩沖液中，并加入到以上活化后的DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs溶液中，室溫反應(yīng)；混合物用PBS緩沖液(PH=7.4，
0.01M)磁分離洗滌3次以除去多余的游離抗體，最后重懸于PBS(0.01M，pH 7.4)中，4°C保存。
[0009]所述的Zn摻雜的Fe304 NPs的量為0.4。
[0010]所述的ZnQ.4Fe2.604 NPs表面活性劑為進行兩次交換的DMSA。
[0011]所述的鹽酸調(diào)解PH為4-6。
[0012]所述的DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs的活化時間為2-24小時所述的c (RGDyK)與DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs的反應(yīng)時間為3-24小時。
[0013]所述的DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs 與 c (RGDyK)的質(zhì)量比值為 2-120。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
(1)本發(fā)明以高磁飽和值的DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs介質(zhì)，通過偶聯(lián)的方法將靶向分子連接到其表面，從而得到腫瘤靶向性的納米復(fù)合磁性材料。所用原料生物安全性高，經(jīng)濟簡單。
[0015](2)本發(fā)明制備的磁性納米材料具有良好的物理化學(xué)穩(wěn)定性、靶向性和磁共振成像性能。
[0016](3)本發(fā)明中的制備方法工藝簡單，可操作性強，能進一步滿足生產(chǎn)和應(yīng)用。
【附圖說明】
[0017]圖1為實施例各所制備的納米顆粒的Zeta電勢圖。其中，隨著加入的RGD量的增加，Zeta電勢逐漸降低，這主要是因為連接上的RGD的天冬氨酸的負(fù)電荷所致。
[0018]圖2為實施例1所制備的納米顆粒的透射電子顯微鏡圖。其中左圖是DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs，右圖是 RGD-DMSA_ZnQ.4Fe2.604 NPs。
【具體實施方式】
[0019]以下通過具體的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步描述。以下的實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不限制本發(fā)明的范圍。
[0020]實施例1:
1.DMSA-Zn。.4Fe2.604 NPs 的制備
首先把FeS04.(NH4)2S04.6Η20和ZnS04溶解在20ml的水里，使得前體達(dá)到1.73X10 3mol Fe2+ and 2.67X 10 4 mol Zn2+ 的目的。其次，把 10ml 油酸、10ml 水和 lg NaOH混合，在常溫下磁力攪拌直到得到均勻的溶液。再者，把前體Fe2+和Zn2+倒進該均勻溶液中，攪拌幾分鐘以后，混合溶液變成深棕色。最后把該溶液轉(zhuǎn)移進50ml反應(yīng)釜中，密封，230度加熱15個小時。反應(yīng)結(jié)束以后，冷卻至室溫。產(chǎn)品沉積在釜底，用環(huán)己烷溶解取出納米顆粒。再把乙醇加入容有納米顆粒的環(huán)己烷中，沉淀出納米顆粒，最后納米顆粒再用乙醇反復(fù)洗數(shù)次。顆粒表面的有機表面活性劑用DMSA進行雙交換，使得納米顆粒徹底溶解在水相中。
[0021]2.c (RGDyK)-DMSA- Zna4Fe2.604 NPs 的制備取EDC和NHS溶解在PBS緩沖液中(PH=7.4，0.05M)中，并用0.2M的鹽酸調(diào)解P