本發(fā)明屬于抗體工程領(lǐng)域，具體涉及基于CH3結(jié)構(gòu)域的異二聚體分子、其制備方法及用途。

背景技術(shù)：

單克隆抗體藥物在近十五年內(nèi)增長迅速，成為制藥行業(yè)的成長點。自1996年起，一共有30個左右單抗藥物被批準(zhǔn)上市。其中有九個單抗藥物年銷售超過十億美元。2010年單抗藥物總銷售超過300億美元，并且年增長率超過10％。由于單克隆抗體的靶標(biāo)特異性強，因此只能抑制單一靶點。而在多種疾病中，包括腫瘤、自體免疫性疾病等，需要抑制多重信號通路來避免代償效應(yīng)。對于病毒感染疾病，由于病毒的高突變率，往往需要抑制多抗原位點來防止逃逸。另外，雙功能抗體、蛋白被用于特異激活人體免疫系統(tǒng)(Wolf,Hofmeister et al.2005)。

眾所周知，抗體的Fc區(qū)形成同二聚體，同時Fc對維持抗體和Fc融合蛋白的體內(nèi)穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用。通過改造Fc使之形成異二聚體是產(chǎn)生多功能抗體、蛋白，并且維持其體內(nèi)穩(wěn)定性的有效方法。

異二聚體的一個典型應(yīng)用的例子是雙特異抗體，雙特異抗體(Bispecific antibody,BsAbs)是含有兩個不同配體結(jié)合位點的免疫球蛋白分子。雙特異抗體至少可以對兩個不同抗原具有活性(Carter 2001)，它取代了經(jīng)典的抗體中Fab兩臂相同的形式，而是采用具有不同序列的Fab兩臂形式，因此Y型兩臂可以結(jié)合不同的抗原。雙特異抗體在癌癥治療中的應(yīng)用已經(jīng)被多篇文獻所綜述(Carter 2001；Chames and Baty 2009；Chames and Baty 2009)。BsAbs的一臂可以連接腫瘤細(xì)胞表面的相關(guān)抗原，而另外一臂則可以觸發(fā)免疫效應(yīng)細(xì)胞以進一步殺傷細(xì)胞，通過免疫系統(tǒng)來殺死腫瘤細(xì)胞。其他雙特異抗體的應(yīng)用可以查看美國專利U.S.Pat.Nos 5,731,168和7,183,076。

自然狀態(tài)下不存在雙特異性抗體，只能通過特殊方法進行制備。以往雙特異抗體的制備方法有化學(xué)交聯(lián)法，雜合F(ab')₂分子法和鼠雜交瘤法等?；瘜W(xué)交聯(lián)法生產(chǎn)的雙特異抗體的異源性，批與批之間的不穩(wěn)定性，以及抗體特異性易受某些修飾或不當(dāng)連接而改變的特性，使得該法生產(chǎn)的雙特異抗體 不適于體內(nèi)使用。以巰基交聯(lián)蛋白酶消化片段F(ab')生產(chǎn)的雙特異雜交分子，成分雖較均一，但費時費力，且產(chǎn)量很低。雜交瘤法生產(chǎn)的雙特異抗體，來源可靠，但由輕鏈、重鏈隨機配對會產(chǎn)生多種可能的抗體形式，使得雙特異抗體生產(chǎn)、純化變得非常困難。

早在20世紀(jì)90年代，Carter等人用“把手-孔洞”(knob into hole)模型改造抗體重鏈的部分氨基酸，比較成功的實現(xiàn)了雙特異抗體的制備(Ridgway,Presta et al.1996；Carter 2001)?！鞍咽?孔洞”模型最初是由Crick提出，并用來解決相鄰的α-螺旋之間的氨基酸側(cè)鏈折疊問題的(Crick 1952)。Carter等在Fc第一條重鏈的CH3區(qū)域上通過將一個側(cè)鏈小的氨基酸突變成了一個側(cè)鏈大的氨基酸從而創(chuàng)造出了一個“把手”(如T366Y)，并將第二條重鏈上的CH3上的某些氨基酸突變成了側(cè)鏈小的氨基酸創(chuàng)造出了“孔洞”(Y407T等)?！鞍咽?孔洞”模型的原理是“把手-孔洞”的相互作用支持異二聚體的形成，而“把手-把手”模型及“孔洞-孔洞”模型阻礙同二聚體的形成。他們進一步在“把手-孔洞”突變的基礎(chǔ)上引入了CH3區(qū)域內(nèi)的二硫鍵來鞏固異二聚體的結(jié)合能力。然而在他們的研究結(jié)果中，“孔洞-孔洞”模型對阻礙同二聚體的形成的能力仍然不夠。之后該研究組嘗試通過隨機突變-噬菌體展示等方法一步提高異二聚體的含量，但仍沒有解決根本問題。為了提高異二聚體的比例，還有研究通過分別制備兩種抗體，在體外通過分子間二硫鍵還原-重新配對的方式形成異二聚體，但其制備工藝明顯過于復(fù)雜。

US 2010/286374A公開了一種Fc異二聚體蛋白或多肽的制備方法，所涉及的異二聚體蛋白包括第一個包含CH3區(qū)域的多肽和第二個包含CH3區(qū)域的多肽，它們相互接觸形成促使異二聚體形成的界面，即在第一個包含CH3區(qū)域的多肽和第二個包含CH3區(qū)域的多肽的界面上包含一個或多個帶電荷的氨基酸，帶電荷的氨基酸間的靜電作用不利于同二聚體的形成但有利于異二聚體的形成，具體是將第一個或第二個包含CH3區(qū)域的多肽中帶電荷的氨基酸替換為帶相反電荷的氨基酸，利用靜電作用促進異二聚體的形成。該發(fā)明方法存在兩個缺陷，其一是該技術(shù)方案缺乏完整性，界面氨基酸之間的作用并不局限于一對氨基酸之間，界面氨基酸替換為相反電荷，特別是多個氨基酸突變的情況下，基于界面氨基酸之間復(fù)雜的作用關(guān)系，靜電作用并不總是能抑制同二聚體或有利于異二聚體的形成，雖然該專利中部分具體的替換方案的確有利于異二聚體的形成，但其技術(shù)方案中缺少對此進行評價和篩選的策略或方法，在界面氨基酸作用復(fù)雜或多點突變的情形下，為獲得有義突變，該專利對本領(lǐng)域技術(shù)人員無法予以指導(dǎo)；其二是該技術(shù)方案局限于電荷 氨基酸作相反電性的替換，實際上，界面氨基酸之間形成一個電荷作用網(wǎng)絡(luò)，任何一個氨基酸(電荷或非電荷氨基酸)電性的變化均會引起兩條多肽鏈之間靜電作用的改變，局限于將電荷氨基酸作相反電性的替換會忽略可能存在的大量的有義突變。

因此，本領(lǐng)域仍需要尋找合適的突變以進一步增強異二聚體蛋白的形成而削弱同二聚體蛋白的形成。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明通過綜合考慮界面氨基酸之間的各種相互作用，例如離子作用、疏水相互作用和空間作用等，篩選到優(yōu)選的CH3突變序列，其更傾向于形成異二聚體，而不形成同二聚體，因而大大提高了異二聚體分子的產(chǎn)量，由此完成了本發(fā)明。

本發(fā)明第一方面涉及異二聚體分子，其含有第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈和第二多肽鏈分別含有抗體重鏈恒定區(qū)CH3結(jié)構(gòu)域，分別命名為第一CH3結(jié)構(gòu)域和第二CH3結(jié)構(gòu)域，與野生型的人抗體重鏈恒定區(qū)CH3結(jié)構(gòu)域相比，所述第一CH3結(jié)構(gòu)域和第二CH3結(jié)構(gòu)域含有選自如下(1)～(3)所示位置氨基酸的突變中的一種：

(1)第一CH3結(jié)構(gòu)域的Y349和T366發(fā)生突變，且第二CH3結(jié)構(gòu)域的D356、T366、L368和Y407發(fā)生突變，并且所述第一CH3結(jié)構(gòu)域和/或第二CH3結(jié)構(gòu)域還在選自F405、K409、K360、Q347和L368中的1～3個氨基酸位置具有的突變，優(yōu)選地，所述第一CH3結(jié)構(gòu)域和/或第二CH3結(jié)構(gòu)域還具有選自下列的突變中的一種，

1a)第二CH3結(jié)構(gòu)域的F405發(fā)生突變；

1b)第一CH3結(jié)構(gòu)域的F405發(fā)生突變；

1c)第一CH3結(jié)構(gòu)域的K409發(fā)生突變，且第二CH3結(jié)構(gòu)域的F405發(fā)生突變；

1d)第一CH3結(jié)構(gòu)域的F405、K360和Q347發(fā)生突變，且第二CH3結(jié)構(gòu)域的Q347發(fā)生突變；

1e)第一CH3結(jié)構(gòu)域的F405和Q347發(fā)生突變，且第二CH3結(jié)構(gòu)域的K360和Q347發(fā)生突變；

1f)第一CH3結(jié)構(gòu)域的K409、K360和Q347發(fā)生突變，且第二CH3結(jié)構(gòu)域的F405和Q347發(fā)生突變；

1g)第一CH3結(jié)構(gòu)域的K409和Q347發(fā)生突變，且第二CH3結(jié)構(gòu)域 的F405、K360和Q347發(fā)生突變；和

1h)第一CH3結(jié)構(gòu)域的K409和L368發(fā)生突變，且第二CH3結(jié)構(gòu)域的F405發(fā)生突變；

(2)第一CH3結(jié)構(gòu)域的T366和K409發(fā)生突變，且第二CH3結(jié)構(gòu)域的T366、L368、Y407和F405發(fā)生突變，并且任選地所述第一CH3結(jié)構(gòu)域和/或第二CH3結(jié)構(gòu)域還在選自K392、D399、Y349、S354和E357中的1～2個氨基酸的位置具有突變，優(yōu)選地，所述第一CH3結(jié)構(gòu)域和/或第二CH3結(jié)構(gòu)域還任選地具有選自下列的突變中的一種，

2a)第一CH3結(jié)構(gòu)域的K392發(fā)生突變，且第二CH3結(jié)構(gòu)域的D399發(fā)生突變；

2b)第一CH3結(jié)構(gòu)域的Y349發(fā)生突變，且第二CH3結(jié)構(gòu)域的E357發(fā)生突變；和

2c)第一CH3結(jié)構(gòu)域的Y349和S354發(fā)生突變，且第二CH3結(jié)構(gòu)域的E357發(fā)生突變；以及

(3)第一CH3結(jié)構(gòu)域的T366和F405發(fā)生突變，且第二CH3結(jié)構(gòu)域的T366、L368、Y407和K409發(fā)生突變，并且任選地所述第一CH3結(jié)構(gòu)域和/或第二CH3結(jié)構(gòu)域還在選自K392、D399、Y349、S354和E357中的1～2個氨基酸的位置具有突變，優(yōu)選地，所述第一CH3結(jié)構(gòu)域和/或第二CH3結(jié)構(gòu)域任選地還具有選自下列的突變中的一種，

3a)第一CH3結(jié)構(gòu)域的D399發(fā)生突變，且第二CH3結(jié)構(gòu)域的K392發(fā)生突變；

3b)第一CH3結(jié)構(gòu)域的Y349發(fā)生突變，且第二CH3結(jié)構(gòu)域的E357發(fā)生突變；和

3c)第一CH3結(jié)構(gòu)域的Y349和S354D發(fā)生突變，且第二CH3結(jié)構(gòu)域的E357發(fā)生突變；

以上所述的氨基酸的位置根據(jù)抗體Fc的KABAT編號的EU索引確定。

在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述的第一CH3結(jié)構(gòu)域和第二CH3結(jié)構(gòu)域含有上述第(2)項或第(3)項突變，并且不含有突變Y349C和D356C。

在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述的各突變各自獨立地選自非帶電氨基酸突變?yōu)閹щ姲被?、帶電氨基酸突變?yōu)榉菐щ姲被岷蛶щ姾砂被嵬蛔優(yōu)閹喾措姾傻陌被帷?/p>

在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述的突變選自以下突變中的一個 或數(shù)個：

Y349C、Y349D、D356C、T366W、T366S、L368A、L368E、L368G、F405K、Y407V、Y407A、K409E、K409A、K360E、Q347E、Q347R、K392D、D399S、E357A和S354D。

在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述的第一CH3結(jié)構(gòu)域和第二CH3結(jié)構(gòu)域含有選自以下一組的突變：

1)第一CH3結(jié)構(gòu)域：Y349C+T366W，第二CH3結(jié)構(gòu)域：D356C+T366S+L368A+Y407V+F405K；

2)第一CH3結(jié)構(gòu)域：Y349C+T366W+F405K，第二CH3結(jié)構(gòu)域：D356C+T366S+L368A+Y407V；

3)第一CH3結(jié)構(gòu)域：Y349C+T366W+K409E，第二CH3結(jié)構(gòu)域：D356C+T366S+L368A+Y407V+F405K；

4)第一CH3結(jié)構(gòu)域：Y349C+T366W+K409A，第二CH3結(jié)構(gòu)域：D356C+T366S+L368A+Y407V+F405K；

5)第一CH3結(jié)構(gòu)域：Y349C+T366W+F405K+K360E+Q347E，第二CH3結(jié)構(gòu)域：D356C+T366S+L368A+Y407V+Q347R；

6)第一CH3結(jié)構(gòu)域：Y349C+T366W+F405K+Q347R，第二CH3結(jié)構(gòu)域：D356C+T366S+L368A+Y407V+K360E+Q347E；

7)第一CH3結(jié)構(gòu)域：Y349C+T366W+K409A+K360E+Q347E，第二CH3結(jié)構(gòu)域：D356C+T366S+L368A+Y407V+F405K+Q347R；

8)第一CH3結(jié)構(gòu)域：Y349C+T366W+K409A+Q347R，第二CH3結(jié)構(gòu)域：D356C+T366S+L368A+Y407V+F405K+K360E+Q347E；

9)第一CH3結(jié)構(gòu)域：Y349C+T366W+K409A+L368E，第二CH3結(jié)構(gòu)域：D356C+T366S+L368A+Y407V+F405K；

10)第一CH3結(jié)構(gòu)域：T366W+K409A+K392D，第二CH3結(jié)構(gòu)域：T366S+L368A+Y407V+D399S+F405K；

11)第一CH3結(jié)構(gòu)域：T366W+K409A，第二CH3結(jié)構(gòu)域：T366S+L368G+Y407A+F405K；

12)第一CH3結(jié)構(gòu)域：T366W+K409A+Y349D，第二CH3結(jié)構(gòu)域：T366S+L368A+Y407V+F405K+E357A；

13)第一CH3結(jié)構(gòu)域：T366W+K409A+Y349D+S345D，第二CH3結(jié)構(gòu)域：T366S+L368A+Y407V+F405K+E357A；

14)第一CH3結(jié)構(gòu)域：T366W+F405K，第二CH3結(jié)構(gòu)域： T366S+L368A+Y407V+K409A；

15)第一CH3結(jié)構(gòu)域：T366W+F405K+D399S，第二CH3結(jié)構(gòu)域：T366S+L368A+Y407V+K409A+K392D；

16)第一CH3結(jié)構(gòu)域：T366W+F405K，第二CH3結(jié)構(gòu)域：T366S+L368G+Y407A+K409A；

17)第一CH3結(jié)構(gòu)域：T366W+F405K+Y349D，第二CH3結(jié)構(gòu)域：T366S+L368A+Y407V+K409A+E357A；和

18)第一CH3結(jié)構(gòu)域：T366W+F405K+Y349D+S345D，第二CH3結(jié)構(gòu)域：T366S+L368A+Y407V+K409A+E357A；

優(yōu)選第2)、4)、9)、10)、11)、13)、15)、16)或18)組。

在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述的第一多肽鏈和第二多肽鏈還分別含有抗體重鏈恒定區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述CH2結(jié)構(gòu)域位于CH3結(jié)構(gòu)域的N端，其與CH3結(jié)構(gòu)域的N端直接連接或通過連接肽連接。

在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述的第一多肽鏈和第二多肽鏈還分別含有抗體重鏈恒定區(qū)的絞鏈區(qū)或絞鏈區(qū)的一部分。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述絞鏈區(qū)的一部分為D221-P230。

在本發(fā)明的具體實施方案中，所述絞鏈區(qū)或絞鏈區(qū)的一部分位于CH3結(jié)構(gòu)域的N端，當(dāng)存在CH2結(jié)構(gòu)域時，所述絞鏈區(qū)或絞鏈區(qū)的一部分進一步位于CH2結(jié)構(gòu)域的N端，其與CH2或CH3結(jié)構(gòu)域直接連接或通過連接肽連接。

在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述的抗體恒定區(qū)來源于IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(例如IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM。

在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述的第一和/或第二多肽鏈還含有分子結(jié)合區(qū)域，例如抗原結(jié)合區(qū)域、受體結(jié)合區(qū)域或酶結(jié)合區(qū)域。

在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述的抗原結(jié)合區(qū)域含有抗體可變區(qū)。

在本發(fā)明的一個實施方案中，其為雙特異性抗體、雙特異性融合蛋白或抗體-融合蛋白嵌合體。

本發(fā)明還涉及組合物，其含有本發(fā)明第一方面任一項的異二聚體分子以及藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。

本發(fā)明還涉及核酸分子，其編碼本發(fā)明第一方面任一項的異二聚體分 子的第一多肽鏈或第二多肽鏈，或者編碼本發(fā)明第一方面任一項的異二聚體分子的第一多肽鏈和第二多肽鏈

本發(fā)明還涉及載體，其含有本發(fā)明任一項的核酸分子。

本發(fā)明還涉及宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明任一項的載體。

本發(fā)明還涉及本發(fā)明第一方面任一項的異二聚體分子、任一項的組合物、核酸分子、載體或宿主細(xì)胞在制備雙特異性抗體、雙特異性融合蛋白和抗體-融合蛋白嵌合體中的用途。

本發(fā)明還涉及一種制備異二聚體分子的方法，其包括使用本發(fā)明任一項的宿主細(xì)胞表達所述異二聚體分子的步驟。

在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述的宿主細(xì)胞同時含有編碼異二聚體分子中第一多肽鏈和第二多肽鏈的載體，利用該宿主細(xì)胞表達，回收，得到異二聚體分子。

在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述的宿主細(xì)胞分別含有編碼異二聚體分子中第一多肽鏈和第二多肽鏈的載體，第一多肽鏈和第二多肽鏈在兩個宿主細(xì)胞中分別表達后形成第一多肽鏈同二聚體和第二多肽鏈同二聚體，將同二聚體解離成單鏈，然后再將不同的單鏈混合在一起，在合適的條件下制備得到異二聚體分子。

在本發(fā)明的一個實施方案中，其中所述的第一多肽鏈和第二多肽鏈的摩爾比為1:4～4:1，例如1:2～2:1，例如約1:1。

以下對本發(fā)明做進一步描述。

在本發(fā)明中，第一多肽鏈和第二多肽鏈都含有抗體Fc片段的CH3區(qū)域，兩條多肽鏈之間通過CH3區(qū)域或含有CH3的Fc片段發(fā)生相互作用，形成二聚體，特別是異二聚體。兩條多肽鏈之間可以是不同的組合，例如第一多肽鏈為抗體，第二多肽鏈為融合蛋白，或者兩條多肽鏈均為融合蛋白，或者兩條多肽鏈均為抗體，靶向不同的抗原或抗原表位。當(dāng)融合蛋白包含抗體的Fc段與細(xì)胞粘附分子的胞膜外區(qū)時也稱為免疫粘附素。所述細(xì)胞粘附分子主要指能識別特異性配基細(xì)胞表面受體的分子，例如包括鈣粘素、選擇素、免疫球蛋白超家族、整合素及透明質(zhì)酸粘素。

在本發(fā)明中，所述CH3來源于抗體Fc片段，優(yōu)選來源于人的抗體Fc片段。在一般情況下，人抗體Fc片段的CH3區(qū)域來源于野生型的人抗體Fc片 段。野生型的人抗體Fc是指存在于人群中的氨基酸序列，當(dāng)然Fc片段在個體中會有一些細(xì)微的差異。本發(fā)明中人抗體Fc片段也包括對于野生型人抗體Fc序列的個別氨基酸的改變，例如某些氨基酸的改變，例如包括某些在糖基化位點突變的氨基酸，或者其它無義的突變，也包括根據(jù)“把手-孔洞”模型突變的個別氨基酸的改變。例如，對于CH3以及CH2結(jié)構(gòu)域，除了本發(fā)明中提到的突變外，還可能含有其它不影響抗體特別是Fc段功能的突變。

在本發(fā)明中，當(dāng)?shù)谝欢嚯逆満?或第二多肽鏈中含有絞鏈區(qū)時，該絞鏈區(qū)作為柔性片段連接在兩段多肽之間，以保證各段多肽鏈的功能；本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要選擇絞鏈區(qū)的長度，例如可選擇全長序列或其中的部分序列。

在本發(fā)明中，所述Fc或其CH2、CH3結(jié)構(gòu)域或絞鏈區(qū)中氨基酸位置的編號均根據(jù)Kabat EU編號索引的位置確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，即使上述區(qū)域中由于氨基酸的插入或缺失或其它突變導(dǎo)致氨基酸序列的改變，根據(jù)Kabat EU編號索引確定的與標(biāo)準(zhǔn)序列對應(yīng)的各氨基酸的位置編號仍然不變。

在本發(fā)明中，人的抗體重鏈恒定區(qū)可包括重鏈CH1、CH2、CH3、CH4的兩個或更多結(jié)構(gòu)域與抗體的絞鏈區(qū)的組合。在本發(fā)明的實施方案中，所述人的抗體Fc片段包括至少一個抗體絞鏈區(qū)、一個CH2結(jié)構(gòu)域和一個CH3結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的實施方案中，所述的CH2結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于依照EU編號系統(tǒng)的氨基酸228-340，但其也可以是如本文中描述的任何其它抗體同種型。在本發(fā)明的實施方案中，所述的CH3結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于依照EU編號系統(tǒng)的氨基酸341-447，但其也可以是如本文中描述的任何其它抗體同種型。

在本發(fā)明中，所述帶電氨基酸包括精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。

在本發(fā)明中，異二聚體分子可以用標(biāo)準(zhǔn)的實驗手段從宿主細(xì)胞中純化。例如，當(dāng)異二聚體蛋白包含抗體Fc片段，可以用蛋白A來純化。純化方法包括但不限于色譜技術(shù)如體積排阻法、離子交換法、親和色譜法及超濾法，或者上述各種方法的適當(dāng)組合。

在本發(fā)明中，所述EU索引例如描述于Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)。

發(fā)明的有益效果

本發(fā)明通過綜合考慮界面氨基酸之間的各種相互作用，例如離子作用、疏水相互作用和空間作用等，篩選到優(yōu)選的CH3突變序列，其更傾向于形成異二聚體，而不形成同二聚體，因而大大提高了異二聚體分子的產(chǎn)量；同時，在本發(fā)明的一些實施方案中，制備了含有Fc片段的異二聚體蛋白晶體，通過對晶體結(jié)構(gòu)的解析以及三維結(jié)構(gòu)建模，更進一步了解了界面氨基酸之間直接的相互作用，同時摒棄了以往認(rèn)為的Y349C與D356C的兩個半胱氨酸之間必然會形成穩(wěn)定二硫鍵的觀點，在此基礎(chǔ)上進行的突變組合更有利于形成異二聚體，而更不利于形成同二聚體，在大大提高異二聚體所占比例的同時大大降低了同二聚體的比例。

附圖說明

圖1：瞬時表達ScFv-Fc/Fc異二聚體的電泳分析。4～12％SDS-PAGE蛋白凝膠電泳。泳道自1～7依次為：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，突變組合KH，突變組合1，突變組合2，突變組合3，突變組合4，野生型陰性對照組合。每組產(chǎn)物中所包含的同二聚體和異二聚體因為分子量差異而在凝膠電泳中的遷移距離不同。不同的同二聚體或異二聚體蛋白所處的位置在圖中被標(biāo)注出。

圖2：瞬時表達ScFv-Fc/Fc異二聚體的電泳分析。12％SDS-PAGE蛋白凝膠電泳。泳道自1～9依次為：，突變組合9，突變組合8，突變組合7，突變組合4，突變組合6，突變組合5，突變組合2，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。每組產(chǎn)物中所包含的同二聚體和異二聚體因為分子量差異而在凝膠電泳中的遷移距離不同。與圖1相似，自上而下分別為ScFv-Fc/ScFv-Fc同二聚體，ScFv-Fc/Fc異二聚體，F(xiàn)c/Fc同二聚體。

圖3：突變組合4中的異二聚體Fc上CH3-CH3界面的晶體結(jié)構(gòu)局部圖.突變的氨基酸殘基用短棍表示，具體包含的相互接觸的突變氨基酸殘基對有如下：T366W/A鏈-T366S,L368A,Y407V/B鏈,K409A/A鏈-F405K/B鏈,S354C/A鏈-Y349C/B鏈。A鏈(左測顏色稍淺的鏈)用綠色表示，B鏈(右側(cè)顏色稍深的鏈)用淺藍色表示。

圖4：在F405K-K409A這一對突變氨基酸殘基對附近引入D399S-K392D這一對新突變，能進一步增強異二聚體之間相互吸引，同時加大同二聚體之間的相互排斥之力。左圖，為引入新突變時，F(xiàn)405K-K409A這一突變對附近的界面氨基酸相互作用。右圖，引入新突變后帶來的相互作用的改變。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1：第一輪突變候選組合序列的獲得

在US7695936.B2中提到的優(yōu)選Fc突變組合(a:Y349C+T366W；b：E356C+T366S+L368A+Y407V)的基礎(chǔ)上進一步引入界面氨基酸突變，改變異二聚體Fc蛋白兩條Fc鏈之間的離子作用，從而加強異二聚體Fc蛋白的獲得，減少同二聚體Fc蛋白的產(chǎn)生。

1、Fc結(jié)構(gòu)建模及界面氨基酸的獲取

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB,www.pdb.org)中共獲得48個包含F(xiàn)c區(qū)域的人IgG1抗體晶體結(jié)構(gòu)，通過結(jié)構(gòu)相似性搜索算法(參考文獻：Yuzhen Ye and Adam Godzik.FATCAT:a web server for flexible structure comparison and structure similarity searching.Nucleic Acids Res.,2004，32(Web Server issue):W582-585.),得出這48個抗體的Fc段的來自1DN2(PDB編號)。

用蛋白質(zhì)接觸氨基酸識別軟件CMA(網(wǎng)址為：http://ligin.weizmann.ac.il/cma/)，根據(jù)氨基酸作用的距離篩選并識別抗體(PDB編號:1DN2)中CH3-CH3之間的氨基酸接觸。根據(jù)氨基酸接觸規(guī)則，界面氨基酸指側(cè)鏈重原子與另外一條鏈的任何一個氨基酸的重原子之間的距離小于一個閾值的一些氨基酸。本實施例的閾值選擇為也可以選擇(如文獻：B.Erman,I.Bahar and R.L.Jernigan.Equilibrium states of rigid bodies with multiple interaction sites.Application to protein helices.J.Chem.Phys.1997,107:2046-2059.)。人和鼠IgG亞型氨基酸接觸界面的保守情況可以通過序列多重比對得到。表1為通過氨基酸接觸篩選(即氨基酸距離小于)的抗體1DN2的34個界面氨基酸，其中，鏈A和鏈B分別代表抗體1DN2的第一鏈和第二鏈。以下氨基酸位置是根據(jù)抗體Fc的KABAT編號的EU索引所命名的。

表1.抗體1DN2的CH3-CH3界面氨基酸列表

2、突變氨基酸以造成離子作用的改變

根據(jù)表1的結(jié)果，選擇接觸氨基酸對中包含帶電荷氨基的配對，對其中一條鏈上的一個氨基進行突變(非帶電氨基酸變?yōu)閹щ姾砂被?，或是帶電荷氨基酸變成非帶電荷氨基酸，或者改變帶電荷氨基酸所帶的電荷性質(zhì))，使得Fc鏈A與Fc鏈B之間的離子作用不平衡，并降低同二聚體形成的幾率或提高異二聚體形成的幾率。同時，為了配合以US7695936.B2中提到的優(yōu)選Fc突變組合(a:Y349C+T366W；b：E356C+T366S+L368A+Y407V)，進一步優(yōu)化其形成異二聚體的能力，我們盡量選擇該突變組合中突變氨基酸 接觸界面附近的接觸界面氨基酸殘基作為突變對象。

如對鏈A的Phe405進行突變，突變?yōu)镻he405Lys(也可寫作F405K)，同時保持鏈B不變。由于第405位氨基酸殘基周圍的位于鏈B上的接觸氨基酸殘基中含有兩個Lys，均為帶正電荷的氨基酸，因此當(dāng)鏈A與鏈A配對時，兩條鏈上的F405K突變所帶的正電荷會引入極大的斥力；而當(dāng)鏈A與鏈B配對時，只有一條鏈(A)上有F405K突變引入的斥力，而另一條鏈(B)則保持Phe405，沒有引入斥力。在此情況下，AA之間兩條鏈的相互排斥十分顯著，遠(yuǎn)大于AB或是BB，因此能有效降低AA同二聚體的形成。

如果在鏈A引入F405K突變的同時，將鏈B上與鏈A的F405K突變殘基對應(yīng)的接觸氨基酸殘基Lys409突變?yōu)镵409E或K409A，則當(dāng)鏈A與鏈A配對時，兩條鏈A上的F405K突變所引入的正電荷會依然引入極大的斥力；而當(dāng)鏈A與鏈B配對時，鏈A上有F405K突變，與鏈B上的K409E或K409A突變相作用，沒有斥力，甚至還有引力(K409E)；而當(dāng)鏈B與鏈B配對的時候，既不引入斥力也不引入引力。在此情況下，AA之間兩條鏈的相互排斥十分顯著，AB之間斥力降低或是引入引力，因此能有效降低AA同二聚體的形成，并同時促進AB異二聚體的形成。

以US7695936.B2中提到的優(yōu)選Fc突變組合(a:Y349C+T366W；b：E356C+T366S+L368A+Y407V)為基礎(chǔ)，加上新引入的突變組合，得到的突變組合如下表，其中組合KH為US7695936.B2中的原型突變組合，組合1～4為新的候選突變組合：

表2：異二聚體突變組合列表

實施例2：制備并考察ScFv-Fc/Fc異二聚體

1、構(gòu)建表達突變的人IgG1的Fc片段以及ScFv-Fc融合蛋白的重組載體

根據(jù)蛋白數(shù)據(jù)庫Uniprot上人免疫球蛋白gamma1(IgG1)的恒定區(qū)氨基酸序列(P01857)，得到人IgG1-Fc區(qū)氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR，從人PBMC總RNA中獲得編碼人IgG1-Fc的核酸片段(SEQ ID NO:2，命名為Fc基因)，通過重疊PCR在其5’端加上小鼠kappaIII信號肽的編碼序列(如SEQ ID NO:3所示)，之后再亞克隆至載體pcDNA4(Invitrogen，Cat V86220)，得到用于哺乳動物細(xì)胞表達人IgG1-Fc(簡稱Fc)蛋白的重組表達載體。

人工合成獲得如SEQ ID NO：5所示的ScFv-Fc融合蛋白編碼基因(其中的ScFv是指抗HER2的單鏈抗體)，該基因編碼ScFv-Fc融合蛋白序列見SEQ ID：4，之后亞克隆至哺乳動物細(xì)胞表達載體pcDNA4(Invitrogen，Cat V86220)獲得用于哺乳動物細(xì)胞表達ScFv-Fc融合蛋白的重組表達載體。

根據(jù)實施例1的表2，利用重疊PCR法對scFV-Fc及Fc編碼基因進行組合突變，其中針對A鏈的突變位于scFV-Fc融合蛋白上，針對B鏈的突變位于Fc蛋白上。將突變后的基因亞克隆到pcDNA4(Invitrogen，Cat V86220)，最終分別得到用于在哺乳動物細(xì)胞中表達突變的scFV-Fc融合蛋白及突變的Fc蛋白的重組表達載體。

2、瞬時表達ScFv-Fc/Fc異二聚體，并檢測不同突變組合對異二聚體含量的影響

將步驟1的4種突變組合，KH組合(作為參比組)，外加一種野生型組合(即未突變的ScFv-Fc融合蛋白和Fc蛋白，作為陰性對照組)相應(yīng)的表達載體用PEI轉(zhuǎn)染至懸浮培養(yǎng)的293H細(xì)胞(ATCC CRL-1573)，每一組突變組合都包括了其相對應(yīng)的A鏈(指代scFV-Fc融合蛋白鏈)和B鏈(指代Fc蛋白鏈)的重組表達載體共同轉(zhuǎn)染，且A鏈和B鏈的重組表達載體共轉(zhuǎn)比例為1:1。培養(yǎng)5～6天后，收集瞬時表達培養(yǎng)上清液，通過Protein A親和層析法，得到初步純化的4組突變組合、HK突變組合以及野生型陰性對照組的瞬轉(zhuǎn)產(chǎn)物。這些瞬轉(zhuǎn)產(chǎn)物中都包含了不同比例的同二聚體蛋白(ScFv-Fc/ScFv-Fc，F(xiàn)c/Fc)和異二聚體蛋白(ScFv-Fc/Fc)。由于這三種蛋白(ScFv-Fc/ScFv-Fc，F(xiàn)c/Fc，和ScFv-Fc/Fc)的分子量大小有差異，可以通過非還原條件下SDS-PAGE電泳檢測每組產(chǎn)物中同二聚體蛋白(ScFv-Fc/ScFv-Fc，F(xiàn)c/Fc)和異二聚體蛋白(ScFv-Fc/Fc)的組成情況，同時用 BioRad公司推出的ImageLab專業(yè)圖像分析軟件進行同二聚體蛋白(ScFv-Fc/ScFv-Fc，F(xiàn)c/Fc)和異二聚體蛋白(ScFv-Fc/Fc)比例的分析，電泳檢測結(jié)果如圖1及表3所示。

表3.各突變組合在瞬轉(zhuǎn)產(chǎn)物中同二聚體和異二聚體的比例

相對于野生型陰性對照組合，4組候選突變組合，以及KH組合中異二聚體(ScFv-Fc/Fc)的比例都大幅度上升。同時，在KH基礎(chǔ)上，引入新的突變后，異二聚體的比例也發(fā)生了改變，有的顯著增加(如組合2，4)，有的則適當(dāng)提高(如組合1,3)。這里值得注意的是，由于這幾組新的突變組合中包含了對接觸面?zhèn)孺溁鶊F的空間作用以及離子作用兩種主要相互作用的調(diào)整，因此，其對異二聚體含量的影響大小并不能簡單的只考慮兩種作用的疊加。比如，同樣是引入了F405K這個突變造成同二聚體之間斥力增大，但是在突變組合2中對異二聚體增加的效果就遠(yuǎn)高于突變組合1中(突變組合2中異二聚體含量約為70％，而1約為58％)。另外，對于K409位點上引入的突變，位于突變組合4中的非帶電突變帶來的異二聚體含量的增加(77％)，要遠(yuǎn)優(yōu)于突變組合3中的相反電荷的突變(57％)；而如果從理論上單純考慮兩種相互作用的疊加，這兩種突變帶來的效果應(yīng)該相似。

為了進一步考察A鏈和B鏈的重組表達載體共轉(zhuǎn)比例對于同二聚體和異二聚體比例的影響，將較優(yōu)的兩種突變組合(2和4)，以及KH組合所用的共轉(zhuǎn)表達載體分別用4:1及1:4的比例用PEI轉(zhuǎn)染至懸浮培養(yǎng)的293H細(xì)胞(ATCC CRL-1573)，培養(yǎng)5-6天后，收集細(xì)胞上清。通過Protein A親和層析法，得到各自的瞬轉(zhuǎn)產(chǎn)物。通過非還原條件下SDS-PAGE電泳檢測同二聚體蛋白(ScFv-Fc/ScFv-Fc，F(xiàn)c/Fc)和異二聚體蛋白(ScFv-Fc/Fc)的組成情況。具體結(jié)果見表4。從結(jié)果可以看出：重組表達載體共轉(zhuǎn)比例對于產(chǎn)物中 同二聚體和異二聚體比例的會帶來比較明顯的影響。無論是4:1還是1:4的共轉(zhuǎn)比例，其產(chǎn)物中異二聚體的含量都顯著降低。該結(jié)果說明，這三種組合雖然在A鏈與B鏈表達相對平衡的情況下，能極大的增加產(chǎn)物中異二聚體比例，降低同二聚體的比例，但是當(dāng)產(chǎn)物中A鏈與B鏈表達不平衡，造成A鏈或B鏈過量的時候，過量的那一種產(chǎn)物，其形成同二聚體的比例就會增加，而異二聚體含量則相對降低。其中KH組合中，無論哪條鏈過量，都會造成異二聚體含量大幅度降低；突變組合2中B鏈(Fc)過量造成的影響較大；突變組合4中，A鏈(ScFv-Fc)過量造成的影響較大。進一步分析該結(jié)果，可以看出，這三種突變組合中，雖然A鏈與B鏈之間的相互作用得到了大幅度的增強，但是A鏈與A鏈或是B鏈與B鏈之間的相互作用減弱的幅度尚有不足，這才進一步造成當(dāng)其中一個組分表達過剩的時候，同二聚體及異二聚體形成的平衡被打破，產(chǎn)生更多的同二聚體。其中，新的突變組合2與4相比于KH組合，在阻止同二聚體形成方面都有較明顯的優(yōu)化。

表4.不同共轉(zhuǎn)比例對于同二聚體和異二聚體的比例的影響

實施例3：第二輪突變候選組合序列的獲得

在實施例1與2中提到的優(yōu)選Fc突變組合(突變組合2與突變組合4)的基礎(chǔ)上，根據(jù)已經(jīng)公開的野生型Fc的三維晶體結(jié)構(gòu)，進一步引入界面氨基酸突變，旨在進一步減少A鏈-A鏈及B鏈-B鏈之間的相互吸引，抑制同二聚體蛋白的形成。

根據(jù)表1的結(jié)果，進一步選擇靠近突變組合2與突變組合4中突變位點附近的接觸氨基酸中包含帶電荷氨基酸的配對氨基酸，對其中一條鏈上的一個氨基酸進行突變(非帶電氨基酸變?yōu)閹щ姾砂被?，或是帶電荷氨基酸變成非帶電荷氨基酸，或者改變帶電荷氨基酸所帶的電荷性質(zhì))，進一步增加鏈A與鏈B之間的離子作用不平衡性，并降低同二聚體形成的幾率或同時提高異二聚體形成的幾率。

如對鏈A的Lys360與鏈B的Gln347這一對接觸氨基酸進行突變，改變其間的離子作用。其中一條鏈(比如鏈A)上將這兩個氨基酸殘基都突變?yōu)閹ж?fù)電荷的氨基酸殘基，如引入K360E和Q347E兩個突變；而另一條鏈 (如鏈B)上將其中不帶電荷的氨基酸殘基突變?yōu)閹д姾傻陌被釟埢?，如引入Q347R的突變。這時候，當(dāng)鏈A-鏈A相互作用時，360、347位上所帶的負(fù)電荷會相互排斥；鏈B-鏈B相互作用時，則由這兩個位點上的正電荷相互排斥；只有當(dāng)鏈A與鏈B相互作用時，各自的正負(fù)電荷才會產(chǎn)生相互吸引作用。該突變預(yù)計將增加AA以及BB之間兩條鏈的相互排斥，同時增加AB兩條鏈之間的相互吸引。

同時考察Leu368這一氨基酸殘基。該殘基周圍有兩個帶電荷氨基酸殘基，Glu357以及Lys409。考慮到之前的突變組合4中，我們曾引入K409A突變，在此情況下，在已經(jīng)引入K409A突變的同一條Fc鏈上(根據(jù)實施例2，這里指定為鏈A)，我們進一步將Leu368突變?yōu)閹ж?fù)電荷氨基酸殘基(如368E)。此時，則當(dāng)鏈A與鏈A配對時，兩條鏈上的L368E所帶的負(fù)電荷會與E357上的負(fù)電荷相互作用，引入斥力；而當(dāng)鏈A與鏈B配對時，鏈A上的L368E所帶的負(fù)電荷與鏈B上的E357上的負(fù)電荷相互排斥，但同時又與鏈B上的K409相互吸引，綜合下來，并沒有引入太多斥力或引力。該突變預(yù)計將增加AA之間兩條鏈的相互排斥，但并不影響AB或BB兩條鏈之間的相互作用。

實施例1與2中提到的優(yōu)選Fc突變組合(突變組合2與突變組合4)為基礎(chǔ)，加上新引入的突變組合，得到的突變組合如表5所示：

表5：異二聚體突變組合列表-2

實施例4：制備并考察新一輪ScFv-Fc/Fc異二聚體突變組合

1、構(gòu)建表達突變的人IgG1的Fc片段以及ScFv-Fc融合蛋白的重組載 體

以實施例2中構(gòu)建好的野生型scFV-Fc及Fc蛋白表達重組載體為模板，根據(jù)實施例3的表5，利用重疊PCR法對scFV-Fc及Fc編碼基因進行組合突變，其中針對A鏈的突變位于scFV-Fc融合蛋白上，針對B鏈的突變位于Fc蛋白上。將突變后的基因亞克隆到pcDNA4(Invitrogen，Cat V86220)，最終得到用于在哺乳動物細(xì)胞中表達新一輪突變的scFV-Fc融合蛋白及突變的Fc蛋白的重組表達載體。

2、瞬時表達ScFv-Fc/Fc異二聚體，并檢測不同突變組合對異二聚體含量的影響

按照實施例2-2中所述的方法，將新的5種突變組合(5～9)，以及第一輪的優(yōu)選突變組合(2和4)利用293H細(xì)胞(ATCC CRL-1573)，進行瞬時表達。其中A鏈和B鏈的重組表達載體共轉(zhuǎn)比例為1:1。培養(yǎng)5～6天后，收集瞬時表達培養(yǎng)上清液，通過Protein A親和層析法，得到初步純化的5組新突變組合、2組第一輪優(yōu)選組合的瞬轉(zhuǎn)產(chǎn)物。這些瞬轉(zhuǎn)產(chǎn)物中都包含了不同比例的同二聚體蛋白(ScFv-Fc/ScFv-Fc，F(xiàn)c/Fc)和異二聚體蛋白(ScFv-Fc/Fc)。由于這三種蛋白(ScFv-Fc/ScFv-Fc，F(xiàn)c/Fc，和ScFv-Fc/Fc)的分子量大小有差異，可以通過非還原條件下SDS-PAGE電泳檢測每組產(chǎn)物中同二聚體蛋白(ScFv-Fc/ScFv-Fc，F(xiàn)c/Fc)和異二聚體蛋白(ScFv-Fc/Fc)的組成情況，同時用BioRad公司推出的ImageLab專業(yè)圖像分析軟件進行同二聚體蛋白(ScFv-Fc/ScFv-Fc，F(xiàn)c/Fc)和異二聚體蛋白(ScFv-Fc/Fc)比例的分析，電泳檢測結(jié)果如圖2及表6所示。

表6.各突變組合瞬轉(zhuǎn)產(chǎn)物中同二聚體和異二聚體的比例-2

與第一輪突變的優(yōu)選組合比較，新引入的突變有一些略微提高了異二聚體生成的比例，如組合5相較于組合2；有幾組變化不大，如組合6相較于組合2，組合7、8相較于組合4；另外，組合9引入新的突變后，反而大大降低了異二聚體生成的比例，推測是由于鏈A新引入的L368E所帶的負(fù)電荷與鏈B上的E357上的負(fù)電荷相互排斥超過了與鏈B上的K409相互吸引，使得異二聚體變得不穩(wěn)定?？傮w說來，新引入的突變雖然有幾組對異二聚體的形成有適當(dāng)幫助，但是并未帶來顯著提高。

為了進一步考察新引入的突變對A鏈-A鏈以及B鏈-B鏈同二聚體的影響，我們單獨瞬時的表達A鏈蛋白或B鏈蛋白，通過在比較相同瞬轉(zhuǎn)條件下的同二聚體蛋白的表達水平，考察其同二聚體形成的趨勢。重組表達載體用PEI分別轉(zhuǎn)染至懸浮培養(yǎng)的293H細(xì)胞(ATCC CRL-1573)，培養(yǎng)5-6天后，收集細(xì)胞上清。通過Protein A親和層析法，得到各自的瞬轉(zhuǎn)產(chǎn)物，并利用OD280檢測其表達水平。結(jié)果見表7。從表達水平看，對組合4中的鏈A引入的部分突變(組合8，組合9)能降低其同二聚體形成的趨勢；對組合2中的鏈B引入的部分突變(組合5)能降低其同二聚體形成趨勢；其余新的突變對同二聚體的形成影響不大。同時從該結(jié)果中還可以看出，組合2以及組合2衍生出的突變組合(5、6)相對組合4以及組合4衍生出的突變組合(7、8、9)，其鏈A形成同二聚體的趨勢更小；而后者的鏈B形成同二聚體的趨勢相對前者更小。該結(jié)果與實施例2中的得到的結(jié)果相一致，也進一步證明了通過該方法初步考察同二聚體形成趨勢的可行性。另外，從表達水平來看，所有的鏈B都遠(yuǎn)低于鏈A。我們又做了野生型鏈A以及野生型鏈B的單獨瞬時表達，發(fā)現(xiàn)未引入任何突變的情況下，野生型B鏈同二聚體的表達水平低于野生型鏈A的表達水平(前者約是后者的一半)。由此推斷，鏈A中Fc序列的N端融合了ScFv序列，有助于提高其表達水平；而鏈A與鏈B之間的表達水平差異，并不能直接反映鏈A與鏈B各自同二聚體形成趨勢的差異。

表7.各突變組合中鏈A或鏈B單獨瞬轉(zhuǎn)，同二聚體表達水平比較

實施例5：第三輪突變候選組合序列的獲得

根據(jù)突變組合4的晶體結(jié)構(gòu)，配合結(jié)構(gòu)建模，找出新的接觸界面氨基酸突變候選序列，以期在原有突變組合(如突變組合2或4)基礎(chǔ)上，進一步抑制同二聚體蛋白的形成或促進異二聚體蛋白的形成。

1、突變組合4異二聚體蛋白的晶體結(jié)構(gòu)解析

選擇突變組合4，于293H細(xì)胞(ATCC CRL-1573)中瞬時表達并純化得到突變組合4的異二聚體蛋白，進行晶體結(jié)構(gòu)解析。此處，我們利用分子克隆在突變組合4鏈B的C端插入一段His-tag序列，從而可以在Protein A親和層析之后，利用IMAC的方法得到較純的鏈A-鏈B異二聚體蛋白用于結(jié)晶。

晶體結(jié)構(gòu)解析過程如下：

異二聚體Fc晶體于下述條件下形成：2uL結(jié)晶緩沖液(15％的PEG3350，1M的LiCl，0.1M的MES，pH6.0)于2uL蛋白溶液(10mg/mL目標(biāo)蛋白，10mM Tris，150mM NaCl，pH 7.4)混合，于22℃在靜置液滴中結(jié)晶。大約3天后長出晶體。之后將晶體置于下述溶液中:17％PEG3350,1M LiCl,0.1M MES,pH6.0以及20％甘油；隨后快速浸潤并冷凍于液態(tài)氮中。X衍射數(shù)據(jù)通過SSRF BL17U收集。以野生型Fc的結(jié)構(gòu)(PDB登陸號:3AVE)作為框架進行分子替換結(jié)構(gòu)解析。

晶體結(jié)構(gòu)顯示，突變后的Fc異二聚體其整體結(jié)構(gòu)與野生型Fc類似，但是在引入突變的CH3界面上由于不同的測了基團相互作用而有所改變。CH3界面的具體晶體結(jié)構(gòu)見圖3。

2、新突變候選組合的獲得

根據(jù)突變組合4晶體結(jié)構(gòu)的結(jié)果進一步篩選新的候選突變。

首先，專利US7695936.B2中提到的一組用于在異二聚體之間引入二硫鍵的突變(鏈A上的Y349C與鏈B上的D356C)，通過晶體三維結(jié)構(gòu)可以證明，由于兩個Cys側(cè)鏈基團的方向問題，并不能形成二硫鍵，而是成為了一對游離巰基。根據(jù)這一結(jié)果，我們將在第三輪突變中取消這一對突變，使其還原為突變前野生型氨基酸序列。

第二，通過三維結(jié)構(gòu)建模比較，在F405K-K409A這一對突變氨基酸殘基對附近，進一步引入突變，改變離子鍵以及氫鍵。假設(shè)K409A位于A鏈上，F(xiàn)405K位于鏈B上。則于鏈A上引入K392D突變、鏈B上引入D399S突變。如圖4所示，對于鏈A與鏈B之間的相互作用，新引入的突變對加入了K392D-F405K這一對離子鍵，以及K392D-D399S這一對氫鍵，預(yù)計能有效提高異二聚體的形成趨勢。而A鏈-A鏈相互作用中，則引入了K329D-D399之間的靜電斥力，抑制A鏈同二聚體形成。在鏈B-鏈B相互作用中，原有的K409-D399之間的離子鍵則由于D399S突變的引入而消失，降低了B鏈同二聚體形成的趨勢。

第三，將突變組合4的晶體結(jié)構(gòu)與野生型Fc蛋白晶體結(jié)構(gòu)比較，發(fā)現(xiàn)突變組合4中的鏈A有外移(即遠(yuǎn)離鏈B)，推測可能是由于鏈A中T366W突變中，變大的側(cè)鏈基團帶來了一定的空間位阻。在此基礎(chǔ)上我們進一步將鏈B上與鏈A中T366W殘基相接觸的氨基酸殘基突變?yōu)閹в懈?cè)鏈基團的氨基酸殘基，如在鏈B上，將原有的Y407V和L368A突變替換為Y407A和L386G兩個突變，為T366W突變留出足夠的空間，這樣有可能進一步穩(wěn)固異二聚體結(jié)構(gòu)。

第四，在F405K-K409A這一對突變氨基酸殘基對外圍，對其他接觸界面氨基酸對進行突變，改變界面靜電作用。此處考察Y349與E357這一對接觸氨基酸。鏈A引入突變Y349D，鏈B引入E357A。則A-A之間Y349D與E357A之間引入的靜電斥力會抑制A-A同二聚體形成；A-B之間以及B-B之間并未引入新的作用力。在此基礎(chǔ)上，A鏈進一步引入S354D突變，加強其與E357A之間的靜電斥力，進一步抑制A-A同二聚體的形成。

先以突變組合4為基礎(chǔ)，引入上述突變，得到的突變組合如表8所示：

表8：異二聚體突變組合列表-3

隨后以突變組合2為基礎(chǔ)引入上述突變同時參考突變組合4，得到的突變組合如表9所示：

表9：異二聚體突變組合列表-4

實施例6：制備并考察第三輪ScFv-Fc/VhH-Fc異二聚體突變組合

1、構(gòu)建表達突變的人IgG1的Fc片段以及ScFv-Fc融合蛋白的重組載體

考慮到單純的Fc片段表達水平較scFv-Fc低，為了能更好的掌握兩條鏈的表達比例，我們在原來的B鏈(單純的Fc鏈)的N端融合了一段駱駝單域抗體的可變區(qū)序列(標(biāo)記為VhH)。人工合成獲得如SEQ ID NO：36所示的VhH-Fc融合蛋白編碼基因，該基因編碼VhH-Fc融合蛋白序列見SEQ ID：35，之后亞克隆至哺乳動物細(xì)胞表達載體pcDNA4(Invitrogen，Cat V86220)獲得用于哺乳動物細(xì)胞表達VhH-Fc融合蛋白的重組表達載體。

以實施例2中構(gòu)建好的野生型scFV-Fc蛋白表達重組載體以及上述VhH-Fc融合蛋白的重組表達載體為模板，根據(jù)實施例5的表8，利用重疊PCR法對scFV-Fc及VhH-Fc編碼基因(SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：36)進行組合突變，其中針對A鏈的突變位于scFV-Fc融合蛋白上，針對B鏈的突變位于VhH-Fc蛋白上。將突變后的基因亞克隆到pcDNA4(Invitrogen，Cat V86220)，最終得到用于在哺乳動物細(xì)胞中表達第三輪突變的scFV-Fc融合蛋白及突變的VhH-Fc蛋白(SEQ ID NO：4到SEQ ID NO：35)的重組表達載體。

2、瞬時表達ScFv-Fc/VhH-Fc異二聚體，并檢測不同突變組合對異二聚體含量的影響

按照實施例2-2中所述的方法，將表8中的4種突變組合(10～13)，以及突變組合4利用293H細(xì)胞(ATCC CRL-1573)，進行瞬時表達。其中A鏈和B鏈的重組表達載體共轉(zhuǎn)比例為4:1，1:1以及1:4。培養(yǎng)5～6天后，收集瞬時表達培養(yǎng)上清液，通過Protein A親和層析法，得到初步純化的4組新突變組合、以及突變組合4的瞬轉(zhuǎn)產(chǎn)物。這些瞬轉(zhuǎn)產(chǎn)物中都包含了不同比例的同二聚體蛋白(ScFv-Fc/ScFv-Fc，VhH-Fc/VhH-Fc)和異二聚體蛋白(ScFv-Fc/VhH-Fc)。由于這三種蛋白(ScFv-Fc/ScFv-Fc，VhH-Fc/VhH-Fc，和ScFv-Fc/VhH-Fc)的分子量大小有差異，可以通過非還原條件下SDS-PAGE電泳檢測每組產(chǎn)物中同二聚體蛋白(ScFv-Fc/ScFv-Fc，VhH-Fc/VhH-Fc)和異二聚體蛋白(ScFv-Fc/VhH-Fc)的組成情況，同時用BioRad公司推出的ImageLab專業(yè)圖像分析軟件進行同二聚體蛋白(ScFv-Fc/ScFv-Fc，VhH-Fc/VhH-Fc)和異二聚體蛋白(ScFv-Fc/VhH-Fc)比例的分析，電泳檢測結(jié)果如表10所示。

表10.各突變組合瞬轉(zhuǎn)產(chǎn)物中同二聚體和異二聚體的比例-3

為了進一步考察新引入的突變對A鏈-A鏈以及B鏈-B鏈同二聚體的影響，我們單獨瞬時的表達A鏈蛋白或B鏈蛋白，通過在比較相同瞬轉(zhuǎn)條件下的同二聚體蛋白的表達水平，考察其同二聚體形成的趨勢。重組表達載體用PEI分別轉(zhuǎn)染至懸浮培養(yǎng)的293H細(xì)胞(ATCC CRL-1573)，培養(yǎng)5-6天后，收集細(xì)胞上清。通過Protein A親和層析法，得到各自的瞬轉(zhuǎn)產(chǎn)物，并利用OD280檢測其表達水平。結(jié)果見表11。

表11.各突變組合中鏈A或鏈B同二聚體表達水平比較-2

綜合上述結(jié)果，可以看出。對突變組合4引入第三輪突變后，雖然并未在抑制鏈A同二聚體形成過程中展示出顯著效果，但是卻都顯著抑制了鏈B的同二聚體形成、并有效促進了異二聚體形成。在兩條鏈表達接近平衡(1:1)的時候，幾組新突變組合中異二聚體含量都能達到80％以上，比突變組合4有較明顯的提高。其中突變組合11中，針對鏈B的新突變基本以可以完全抑制鏈B同二聚體的形成?？梢钥吹郊词乖?:4(A:B)的瞬轉(zhuǎn)比例下，仍然觀察不到鏈B同二聚體，且異二聚體含量達到了89％。

根據(jù)組合10～13的結(jié)果，我們進一步選擇突變組合15,16,18，通過瞬時表達，考察其促進異二聚體形成的效果。

按照實施例2-2中所述的方法，將表9中的3種突變組合(15,16,18)，以及突變組合2利用293H細(xì)胞(ATCC CRL-1573)，進行瞬時表達。其中A鏈和B鏈的重組表達載體共轉(zhuǎn)比例為4:1，1:1以及1:4。培養(yǎng)5～6天后，收集瞬時表達培養(yǎng)上清液，通過Protein A親和層析法，得到初步純化的3組新突變組合、以及突變組合2的瞬轉(zhuǎn)產(chǎn)物。這些瞬轉(zhuǎn)產(chǎn)物中都包含了不同比例的同二聚體蛋白(ScFv-Fc/ScFv-Fc，VhH-Fc/VhH-Fc)和異二聚體蛋白(ScFv-Fc/VhH-Fc)。由于這三種蛋白(ScFv-Fc/ScFv-Fc，VhH-Fc/VhH-Fc，和ScFv-Fc/VhH-Fc)的分子量大小有差異，可以通過非還原條件下SDS-PAGE電泳檢測每組產(chǎn)物中同二聚體蛋白(ScFv-Fc/ScFv-Fc，VhH-Fc/VhH-Fc)和異二聚體蛋白(ScFv-Fc/VhH-Fc)的組成情況，同時用BioRad公司推出的ImageLab專業(yè)圖像分析軟件進行同二聚體蛋白(ScFv-Fc/ScFv-Fc，VhH-Fc/VhH-Fc)和異二聚體蛋白(ScFv-Fc/VhH-Fc)比例的分析，電泳檢測結(jié)果如表12所示?？梢钥闯?。對突變組合2引入第三輪突變后，同樣是在抑制鏈B的同二聚體形成上展示出了更顯著的效果，并有效促進了異二聚體形成。在兩條鏈表達接近平衡(1:1)的時候，幾組新突變組合中異二聚體含量都能達到80％以上，比突變組合4有較明顯的提高。其中 突變組合16與18在適當(dāng)改變瞬轉(zhuǎn)載體比例的情況下(鏈B質(zhì)粒過量或兩個質(zhì)粒平衡)，其異二聚體的比例仍然達到了80％以上。

表12.各突變組合瞬轉(zhuǎn)產(chǎn)物中同二聚體和異二聚體的比例-4

實施例7：異二聚體的其他指標(biāo)考核

1、異二聚體的加速穩(wěn)定性檢測

我們選擇了突變組合4，11及16的異二聚體進行了加速穩(wěn)定性的實驗，實驗周期31天，溫度45℃，buffer為PBS。于第0天，第8天，第18天和第31天進行非還原CE-SDS的檢測，并與野生型Fc蛋白進行比較。31天加速穩(wěn)定性SDS-PAGE結(jié)果表明，三個突變樣品及野生型對照樣品，直到第31天，其主峰含量的下降均不超過2％。可以認(rèn)為異二聚體具有和野生型相同的熱穩(wěn)定性。

盡管本發(fā)明的具體實施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。