重組蓖麻毒素b鏈截短蛋白及其表達方法和應用
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及生物工程技術領域，具體涉及一種重組蓖麻毒素 B鏈截短蛋白及其表 達方法和應用。
【背景技術】
[0002] 蓖麻毒素(ricin)是一種異源二聚體糖蛋白，由A鏈(RTA)和B鏈(RTB)組成，兩條鏈 通過二硫鍵連接。RTA是一種核糖體滅活蛋白，在哺乳動物細胞內可抑制蛋白質合成。RTB無 毒，具有凝集素活性，協(xié)助A鏈進入細胞內發(fā)揮生物學功能。RTB是一個兩葉形結構的分子， 由兩個相同折疊的拓撲學球狀結構域構成，每一個區(qū)域又包括三個亞區(qū)（α，β，γ )，只有Ια 和2β有明顯的半乳糖結合活性，RTB可以結合不同的糖結構，調解各種生物過程，包括細胞 與宿主、病原體相互作用和先天免疫反應。

【發(fā)明內容】

[0003] 為了解決現(xiàn)有重組蓖麻毒素 B鏈蛋白復性率低、復性蛋白穩(wěn)定性差等技術問題，本 發(fā)明提供一種重組蓖麻毒素 B鏈截短蛋白及其表達方法和應用。
[0004] 本發(fā)明為解決技術問題所采用的技術方案如下：
[0005] 本發(fā)明提供一種重組蓖麻毒素 B鏈截短蛋白，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。
[0006] 進一步的，蓖麻毒素 B鏈蛋白基因中具有9個半胱氨酸，將蓖麻毒素 B鏈蛋白的氨基 酸序列中前五位氨基酸截短，得到蓖麻毒素 B鏈截短基因序列，并用該蓖麻毒素 B鏈截短基 因序列進行蛋白質重組表達，從而獲得重組蓖麻毒素 B鏈截短蛋白。
[0007] 本發(fā)明還提供了上述重組蓖麻毒素 B鏈截短蛋白的表達方法，包括以下步驟：
[0008] (1)大腸桿菌表達工程菌BL21 (DE3)/PET28a-RTB的獲得
[0009] 在氨基酸序列不變的條件下，根據(jù)已有的蓖麻毒素 B鏈序列進行密碼子優(yōu)化，并通 過人工合成蓖麻毒素 B鏈密碼子優(yōu)化后的全序列，其核苷酸序列為序列表中的序列1，其氨 基酸序列為序列表中的序列2;
[0010] 以蓖麻毒素 B鏈密碼子優(yōu)化后的全序列為模板，用rRTB sense primer和rRTB anti-sense primer進行PCR擴增，獲得的PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T克隆載體，獲得pMD18T-RTB；
[0011] 雙酶切PMD18T-RTB和PET-28a表達載體，將酶切產(chǎn)物鏈接并轉入大腸桿菌感受態(tài) 細胞BL21 (DE3)，經(jīng)篩選獲得陽性菌BL21 (DE3) /PET28a-RTB，提取質粒PET28a-RTB并測序；
[0012] (2)重組蓖麻毒素 B鏈截短蛋白的誘導表達與純化
[0013] 將陽性菌BL21(DE3)/PET28a-RTB按1:100v/v的比例接種于5mL含濃度為100ug/mL Kan的LB培養(yǎng)基中，37°C下、180rpm恒溫振蕩培養(yǎng)至0D 6Q() = 0.6時，再按1:100v/v的比例轉接 至500mL同樣的LB培養(yǎng)基中，并補加 Kan至終濃度為100ug/mL，37°C下、180rpm恒溫振蕩培養(yǎng) 至0D6q() = 0.6;誘導組添加 IPTG至終濃度為ImM，37°C下、180rpm恒溫振蕩誘導16h;經(jīng)誘導 16h后，4°C下、8000rpm離心獲得菌體沉淀；
[0014]用大腸桿菌細菌裂解試劑盒裂解菌體沉淀，離心獲得包涵體沉淀;將包涵體沉淀 用8M尿素溶解后加2X SDS-PAGE上樣緩沖液，100°C下煮沸5min，吸取樣品進行SDS-PAGE電 泳;經(jīng)12 % SDS-PAGE電泳分析，重組蓖麻毒素 B鏈截短蛋白在包涵體有特異性的表達，且其 蛋白分子量為38Kd，與預期的蛋白大小相符合。
[0015] 進一步的，步驟（1)中，PCR擴增條件為:預變性94°C: 5min、變性:94°C30s、退火:60 °C30s延伸：72°C45s共擴增25循環(huán)。
[0016] 進一步的，步驟（2)中，所述2X SDS-PAGE上樣緩沖液包括：PH6.8的100mmol/L Tris · Cl、200mmol/mL DTT、4%SDS、0.2%溴酚藍和20%甘油。
[0017] 進一步的，還包括步驟(3):將步驟(2)獲得的包涵體溶解液進行親和層析，親和層 析柱為cOmplete His-Tag Purification Resin Ni2+，洗脫液為含500mM咪唑的8M尿素，當 咪唑濃度為300mM時，收集洗脫峰即為純化后的重組蓖麻毒素 B鏈截短蛋白。
[0018] 本發(fā)明提供了重組蓖麻毒素 B鏈蛋白作為疫苗佐劑的應用。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的重組蓖麻毒素 B鏈復性率提高，穩(wěn)定性增強，免疫 原性好，增強疫苗免疫效果、降低疫苗用量，可作為滅活疫苗、減活疫苗、裂解疫苗、DNA疫 苗、重組疫苗、亞單位疫苗、多肽蛋白疫苗等多種疫苗的佐劑。
【附圖說明】
[0020] 圖1為免疫后狂犬病中和抗體水平。
【具體實施方式】
[0021] 本發(fā)明提供一種重組蓖麻毒素 B鏈截短蛋白，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。
[0022] 蓖麻毒素 B鏈蛋白基因中具有9個半胱氨酸，將蓖麻毒素 B鏈蛋白的氨基酸序列中 前五位氨基酸截短，得到蓖麻毒素 B鏈截短基因序列，并用該蓖麻毒素 B鏈截短基因序列進 行蛋白質重組表達，從而獲得重組蓖麻毒素 B鏈截短蛋白。
[0023] 本發(fā)明提供了一種重組蓖麻毒素 B鏈截短蛋白的表達方法，通過大腸桿菌表達系 統(tǒng)表達重組蓖麻毒素 B鏈截短蛋白。
[0024]經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，兩種方法表達的重組蓖麻毒素 B鏈截短蛋白在包涵體有特 異性的表達，且其蛋白分子量為38Kd，與預期的蛋白大小相符合。
[0025] 本發(fā)明提供了重組蓖麻毒素 B鏈蛋白作為疫苗佐劑的應用，通過重組蓖麻毒素 B鏈 截短蛋白作為疫苗佐劑增強狂犬疫苗免疫效果試驗以及重組蓖麻毒素 B鏈截短蛋白作為疫 苗佐劑增強流感病毒疫苗免疫效果試驗證明：本發(fā)明的重組蓖麻毒素 B鏈蛋白作為疫苗佐 劑可以增強疫苗免疫效果。
[0026] 實施例1大腸桿菌表達系統(tǒng)表達重組蓖麻毒素 B鏈截短蛋白
[0027] 1、大腸桿菌表達工程菌BL21(DE3)/PET28a-RTB的獲得
[0028]在氨基酸序列不變的條件下，根據(jù)已有的蓖麻毒素 B鏈(rRTB)序列進行密碼子優(yōu) 化，具體的是:蓖麻毒素 B鏈蛋白基因中具有9個半胱氨酸，將其氨基酸序列中前五位氨基酸 截短，得到蓖麻毒素 B鏈截短基因序列，并通過人工合成蓖麻毒素 B鏈密碼子優(yōu)化后的全序 列，其核苷酸序列為序列表中的序列1，其氨基酸序列為序列表中的序列2。
[0029]根據(jù)上述的蓖麻毒素 B鏈密碼子優(yōu)化后的全序列作為模板，用rRTB sense primer (序列3)和rRTB anti-sense primer(序列4)進行PCR擴增，PCR擴增條件如下:預變性94°C: 5min、變性：94°C30s、退火：60°C30s延伸：72°C45s共擴增25循環(huán)。獲得的PCR產(chǎn)物連接至 PMD18-T克隆載體(寶生物工程(大連)有限公司），獲得pMD18T-RTB。
[0030] 用EcoR I和Hind III雙酶切PMD18T-RTB回收小片段，與經(jīng)過同樣EcoR I和Hind III雙酶切的PET-28a表達載體鏈接，得到的鏈接產(chǎn)物轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21 (DE3)， 經(jīng)篩選獲得陽性菌，對陽性菌提取質粒后進行測序，結果該質粒為序列表中序列1插入 PET28a表達載體的EcoR I和Hind III的酶切位點間得到的質粒，將該質粒命名為PET28a-RTB，其對應的陽性菌命名為BL21 (DE3) /PET28a-RTB。
[0031] 2、重組蓖麻毒素 B鏈截短蛋白的誘導表達與純化
[0032] 將上述獲得的陽性菌BL21(DE3)/PET28a-RTB按1:100v/v的比例接種于5mL含Kan (濃度為l〇〇ug/mL)的LB培養(yǎng)基(配方:蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)中，在37 °C下，180rpm恒溫振蕩培養(yǎng)至0D6qq = 0.6時，再按1:100v/v的比例轉接至500mL同樣的LB培 養(yǎng)基(配方:蛋白胨l〇g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)中，并補加 Kan至終濃度為100ug/ mL，同上述培養(yǎng)條件即在37°C下，180rpm恒溫振蕩培養(yǎng)至0D6Q() = 0.6;誘導組添加 IPTG至終 濃度為ImM，同上述培養(yǎng)條件即在37°C下，180rpm恒溫振蕩誘導16h;經(jīng)誘導16h后，在4°C下， 8000rpm離心獲得菌體沉淀。
[0033]獲得的菌體沉淀用大腸桿菌細菌裂解試劑盒裂解，離心獲得包涵體沉淀;將包涵 體沉淀用8M尿素(配方:Tris 50mmol/mL，尿素8mol/L，NaCl 0.5111〇1/1]11^!1=8.0)溶解后加 2X SDS-PAGE上樣緩沖液（配方：100mmol/L Tris.Cl(pH6.8)、200mmol/mL DTT、4%SDS、 0.2%溴酚藍、20%甘油），在100°C下煮沸5min，吸取20ul樣品，進行SDS-PAGE電泳。
[003