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一株過表達3?磷酸甘油脫氫酶基因的高山被孢霉、其構建方法及應用與流程

文檔序號:11868723閱讀:來源:國知局
一株過表達3?磷酸甘油脫氫酶基因的高山被孢霉、其構建方法及應用與流程

技術特征:
1.一株過表達3-磷酸甘油脫氫酶基因的重組高山被孢霉菌株(Mortierellaalpina)GPD-1,該菌株于2015年7月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號,中國科學院微生物研究所,保藏編號為CGMCCNo.11001。2.根據權利要求1所述的重組高山被孢霉菌株(Mortierellaalpina)GPD-1,其特征在于所述菌株是以含3-磷酸甘油脫氫酶基因的根癌土壤桿菌轉化高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株構建而成的。3.根據權利要求1所述的重組高山被孢霉菌株(Mortierellaalpina)GPD-1,其特征在于該菌株是用含有3-磷酸甘油脫氫酶基因的重組質粒pBIG2-ura5s-G3PD1轉化根癌土壤桿菌后,再以含轉化質粒pBIG2-ura5s-G3PD1的根癌土壤桿菌轉化高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株構建而成的。4.構建權利要求1或2所述的重組高山被孢霉菌株的方法,包括以下步驟:a)克隆來源于MortierellaalpinaATCC#32222的3-磷酸甘油脫氫酶基因G3PD1;b)構建重組質粒pBIG2-ura5s-G3PD1;c)用構建獲得的重組質粒pBIG2-ura5s-G3PD1轉化根癌土壤桿菌;d)用含重組質粒pBIG2-ura5s-G3PD1的根癌土壤桿菌轉化高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株;e)篩選鑒定轉化菌株,獲得過表達3-磷酸甘油脫氫酶基因的重組高山被孢霉菌株。5.根據權利要求4所述的方法,其特征在于步驟a)中,用于擴增3-磷酸甘油脫氫酶基因G3PD1的引物序列如下:P1(sense):CGGGGTACCCCATGTCTGAAAAAGTAGCACTAATCGP2(antisense):TCCCCCCGGGTTAGATATCCTCGACAATCCTGATG。6.根據權利要求4所述的方法,其特征在于所述步驟c)的根癌土壤桿菌為根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)C58C1。7.根據權利要求4所述的方法,其特征在于所述步驟d)的高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株是重組高山被孢霉(Mortierellaalpina)MAU1,該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCCNo.8414。8.根據權利要求4所述的構建重組高山被孢霉菌株的方法,其特征在于所述步驟e)中篩選鑒定轉化菌株的方法包括以下步驟:1)用3mL生理鹽水沖刷GY表面,收集液體于一個無菌1.5mL離心管中,過25μm濾膜;2)用血球計數器計數,調整為三種孢子濃度梯度108個每100μL、106個每100μL、104個每100μL,各取200μL涂布于含有100μg/mL壯觀霉素,100μg/mL頭孢噻肟的GY-CS平板上,25℃避光培養(yǎng)2-3天;3)隨時用無菌鑷子挑出生長的真菌菌絲于含有100μg/mL壯觀霉素,100μg/mL頭孢噻肟的SC-CS平板上,25℃培養(yǎng)2-3天;4)觀察高山被孢霉在平板上的生長情況,挑出在SC-CS平板上生長的菌絲接種于GY斜面上;5)將上述步驟4)中平板上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上傳代三次;6)將穩(wěn)定遺傳的菌株鑒定為過表達G3PD1基因的重組高山被孢霉菌株,保藏于GY斜面上;7)提取含有G3PD1基因的重組高山被孢霉菌株的基因組DNA,設計一對與啟動子和終止子特異性結合的引物進行PCR驗證:P3(sense):CACACACAAACCTCTCTCCCACTP4(antisense):CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC;8)所述重組菌株保藏于GY斜面上。9.權利要求1-3中任一項權利要求所述的過表達3-磷酸甘油脫氫酶基因的重組高山被孢霉菌株GPD-1或根據權利要求4-8中任一項權利要求所述的方法得到的重組高山被孢霉在生產脂肪酸中的用途。
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