一株過表達(dá)3-磷酸甘油脫氫酶基因的高山被孢霉、其構(gòu)建方法及應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】本發(fā)明涉及一種在高山被孢霉中過表達(dá)3-磷酸甘油脫氫酶基因的工程菌株及其構(gòu)建方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
多不飽和脂肪酸(PUFAs)是指含有兩個(gè)或兩個(gè)以上雙鍵、碳原子數(shù)為16-26的直鏈脂肪酸。PUFAs是人體所必需的脂肪酸，對人類和動物的營養(yǎng)與健康具有十分重要的意義，具有調(diào)節(jié)血脂，清理血栓，調(diào)節(jié)免疫功能，健腦補(bǔ)腦等作用。由于傳統(tǒng)的PUFAs來源已經(jīng)無法滿足日益增長的市場需求，所以能夠積累多不飽和脂肪酸的微生物日漸成為食品、醫(yī)藥、化工和養(yǎng)殖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。高山被孢霉(Mortierellaalpina，M.alpina)是一種工業(yè)化生產(chǎn)花生四烯酸(Arachidonicacid，ARA)的產(chǎn)油真菌，可以以甘油三酯形式積累多種多不飽和脂肪酸，已經(jīng)通過美國農(nóng)業(yè)部(FDA)的安全性評估，同時(shí)也是脂質(zhì)生物化學(xué)基礎(chǔ)研究的重要模式菌。甘油三酯是脂質(zhì)積累的主要形式，其合成主要遵循kennedy途徑：游離脂肪酸首先被活化形成脂酰輔酶A，隨后在不同酶的催化作用下與3-磷酸甘油進(jìn)行酯化反應(yīng)生成甘油一酯，進(jìn)而合成甘油二酯，最終合成甘油三酯并結(jié)合蛋白形成脂肪顆粒?？梢姡?-磷酸甘油作為合成甘油三酯的骨架，有可能對產(chǎn)油微生物的脂質(zhì)積累具有重要的意義。以往對于產(chǎn)油微生物脂質(zhì)積累的研究多集中于脂肪酸的合成途徑，期待通過過表達(dá)這些途徑中的基因(例如乙酰輔酶A羧化酶和脂肪酸合成酶)以增加脂質(zhì)產(chǎn)量，而有關(guān)3-磷酸甘油對甘油三酯合成影響的研究沒有大規(guī)模深入展開，3-磷酸甘油脫氫酶是廣泛存在于微生物、動植物細(xì)胞中的一類代謝調(diào)控酶，有多種同工酶形式，分別參與能量代謝、磷脂合成以及細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)的調(diào)節(jié)。NAD+依賴型的3-磷酸甘油脫氫酶可催化磷酸二羥丙酮生成3-磷酸甘油，是甘油合成途徑中的關(guān)鍵酶。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中存在兩種NAD+依賴型3-磷酸甘油脫氫酶同工酶(G3PD1和G3PD2)：一種參與滲透壓的調(diào)節(jié)；另一種與厭氧環(huán)境下的能量代謝有關(guān)。Nguyen等研究者發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母中過表達(dá)G3PD1使3-磷酸甘油脫氫酶的活性提高了4倍左右，并導(dǎo)致菌株中3-磷酸甘油的含量升高了20倍，但是其脂肪酸含量與野生型沒有區(qū)別，這就意味著3-磷酸甘油并沒有影響到釀酒酵母的甘三酯積累。但是，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，將釀酒酵母的3-磷酸甘油脫氫酶基因在歐洲油菜(Brassicanapus)中表達(dá)，兩倍酶活性的提高直接導(dǎo)致油菜種子的3-磷酸甘油含量提高了3～4倍，最終使油菜種子脂質(zhì)產(chǎn)量提高了40％，這表明在種子中，3-磷酸甘油能調(diào)控甘三酯的合成。此外，在耶氏解脂酵母中過表達(dá)自身的G3PD1后，甘油三酯總量也有所提高。所以，3-磷酸甘油很有可能在脂質(zhì)合成過程中發(fā)揮著重要的作用，提高細(xì)胞內(nèi)3-磷酸甘油的供給將有助于提高產(chǎn)油真菌的脂質(zhì)產(chǎn)量。高山被孢霉中存在3-磷酸甘油脫氫酶同工酶，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，選取在脂質(zhì)代謝中發(fā)生明顯變化的G3PD1基因?yàn)檠芯繉ο?，以中國專利申請CN201310347934.8中公開的高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株MAU1為宿主菌株，以中國專利申請?zhí)朇N201310524221.4中公開的高山被孢霉(M.alpina)重組基因表達(dá)系統(tǒng)為基礎(chǔ)，通過根癌土壤桿菌介導(dǎo)的方法過表達(dá)G3PD1基因，使得重組菌株具有高產(chǎn)脂質(zhì)的能力，對于產(chǎn)油真菌高山被孢霉的基礎(chǔ)理論研究及產(chǎn)品開發(fā)均具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是通過根癌土壤桿菌介導(dǎo)的方法提供一株過表達(dá)G3PD1基因的重組高山被孢霉工程菌株，以及在高山被孢霉(M.alpina)中過表達(dá)G3PD1基因的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一株含有質(zhì)粒pBIG2-ura5s-G3PD1的根癌土壤桿菌。本發(fā)明的再一個(gè)目的是將所述重組高山被孢霉工程菌株用于工業(yè)生產(chǎn)油脂。一方面，本發(fā)明提供了一株過表達(dá)G3PD1基因的高山被孢霉工程菌株，該菌株是以含G3PD1基因的根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株構(gòu)建而成的。特別地，該高山被孢霉工程菌株是用含有3-磷酸甘油脫氫酶基因的重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-G3PD1轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌后，再以含轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBIG2-ura5s-G3PD1的根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株構(gòu)建而成的。在本發(fā)明中，重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-G3PD1的構(gòu)建可參考中國專利申請CN201310524221.4中公開的內(nèi)容。根據(jù)該申請的記載，首先用PCR的方法從pD4質(zhì)粒上獲得HPH表達(dá)單元，將HPH表達(dá)單元用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI酶切，插入到EcoRI和XbaI酶切過的pET28a(+)的多克隆位點(diǎn)(MCS)中，得到質(zhì)粒pET28a-HPHs。利用PCR從高山被孢霉cDNA中獲得ura5(乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶；OPRTase)基因，并利用限制性內(nèi)切酶BspHI和BamHI酶切ura5基因，將酶切過的ura5基因插入到NcoI和BamHI酶切過的質(zhì)粒pET28a-HPHs中，以替換的hpt基因，構(gòu)建質(zhì)粒pET28a-ura5s。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI酶切質(zhì)粒pET28a-ura5s得到ura5s表達(dá)單元。將ura5s表達(dá)單元替換質(zhì)粒pBIG2RHPH2中的HPH表達(dá)單元，進(jìn)一步構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBIG2-ura5s。更進(jìn)一步地在質(zhì)粒pBIG2-ura5s和質(zhì)粒pET28a-HPHs的基礎(chǔ)上，構(gòu)建高山被孢霉基因操作通用載體。用PCR的方法從高山被孢霉基因組中獲得非編碼的內(nèi)含子DNA片段IT。用限制性內(nèi)切酶NcoI和BamHI分別對IT基因片段和質(zhì)粒pET28a-HPHs進(jìn)行酶切，并通過連接反應(yīng)將IT片段取代質(zhì)粒pET28a-HPHs的hpt基因，得到質(zhì)粒pET28a-ITs。用限制性內(nèi)切酶SpeI和XbaI雙酶切質(zhì)粒pET28a-ITs得到ITs表達(dá)單元。將ITs表達(dá)單元插入到XbaI酶切過的質(zhì)粒pBIG2-ura5s中，得到高山被孢霉基因操作通用載體pBIG2-ura5s-ITs。然后通過基因工程技術(shù)將3-磷酸甘油脫氫酶基因插入高山被孢霉通用載體pBIG2-ura5s-ITs中，構(gòu)建二元表達(dá)載體pBIG2-ura5s-G3PD1。在本發(fā)明中，所述高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株是已公開的重組高山被孢霉MAU1，其保藏編號為CGMCCNo.8414，該菌株已在中國專利申請CN201310347934.8中公開。在本發(fā)明中，重組高山被孢霉MAU1(CGMCCNo.8414)被命名為重組高山被孢霉CCFM501，為同一株工程菌株。根據(jù)CN201310347934.8說明書記載，重組高山被孢霉MAU1是通過失活高山被孢霉(Mortierellaalpine)ATCC32222基因組中編碼乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶OPRTase的ura5基因構(gòu)建而成的。其中，ura5基因的失活是通過缺失654bp的ura5基因中的213bp-230bp共18bp的序列而實(shí)現(xiàn)的，所使用的同源臂分別是ura5基因上游-1180至+212的1393bp和下游+231至+1592的1362bp的片段，具體步驟為：首先獲得ura5敲除基因片段，并進(jìn)一步構(gòu)建敲除質(zhì)粒pBIG4KOura5，然后用重組質(zhì)粒pBIG4KOura5轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌，最后用經(jīng)轉(zhuǎn)化的含質(zhì)粒pBIG4KOura5的根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化高山被孢霉并對轉(zhuǎn)化后的高山被孢霉進(jìn)行篩選和鑒定，獲得尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型高山被孢霉MAU1菌株。另一方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建過表達(dá)3-磷酸甘油脫氫酶基因的重組高山被孢霉菌株的方法，該方法包括如下步驟：克隆來源于高山被孢霉(M.alpina)ATCC#32222的3-磷酸甘油脫氫酶基因，然后通過基因工程技術(shù)將其插入高山被孢霉通用載體pBIG2-ura5s-ITs中，構(gòu)建二元表達(dá)載體pBIG2-ura5s-G3PD1，再用含重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-G3PD1的根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化高山被孢霉尿嘧啶缺陷型菌株CCFM501，通過篩選和鑒定，獲得過表達(dá)3-磷酸甘油脫氫酶的高山被孢霉工程菌株。在本發(fā)明中，應(yīng)用于轉(zhuǎn)化高山被孢霉的根癌土壤桿菌為：根癌土壤桿菌AgrobacteriumtumefaciensC58C1(TsujiG,FujiiS,FujiharaN,etal.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationforrandominsertionalmutagenesisinColletotrichumlagenarium[J].JournalofGeneralPlantPathology,2003,69(4):230-239.)，為本領(lǐng)域技術(shù)人員可以公開獲得的菌株。本發(fā)明以中國發(fā)明專利申請CN201310347934.8公開的高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株MAU1(CGMCCNo.8414)作為轉(zhuǎn)化宿主菌株，以中國發(fā)明專利申請CN201310524221.4公開的高山被孢霉重組基因表達(dá)系統(tǒng)為基礎(chǔ)，在其基礎(chǔ)上通過進(jìn)一步的基因重組方法構(gòu)建一株新的能夠高表達(dá)3-磷酸甘油脫氫酶基因的重組高山被孢霉菌株。本發(fā)明所涉及的Broth培養(yǎng)基，其組成為：20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，1g/L磷酸二氫鉀，0.25g/L七水硫酸鎂，10g/L硝酸鉀，余量為水，pH6.0。本發(fā)明所涉及的MM固體培養(yǎng)基，其組成為：1.74g/L磷酸氫二鉀，1.37g/L磷酸二氫鉀，0.146g/L氯化鈉，0.49g/L七水硫酸鎂，0.078g/L氯化鈣，0.0025g/L七水硫酸亞鐵，0.53g/L硫酸銨，1.8g/L葡萄糖，0.5wt％甘油，20g/L瓊脂，余量為水，pH6.8。本發(fā)明所涉及的IM培養(yǎng)基是在MM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了200μM的乙酰丁香酮(AS)構(gòu)成的。本發(fā)明所涉及的SC-CS培養(yǎng)基是添加了濃度為100μg/mL壯觀霉素奇霉素(spectinomycin)和濃度為100μg/mL頭孢噻肟抗生素(CefotaximeSodium)的SC固體培養(yǎng)基。SC固體培養(yǎng)基組成為：20g/L葡萄糖，5g/L酵母氮源無氨基酸和硫酸銨，1.7g/L硫酸銨，60mg/L異亮氨酸，60mg/L亮氨酸，60mg/L苯丙氨酸，50mg/L蘇氨酸，40mg/L賴氨酸，30mg/L酪氨酸，20mg/L腺嘌呤，20mg/L精氨酸，20mg/L組氨酸，10mg/L甲硫氨酸，20g/L瓊脂，余量為水，pH6.8。本發(fā)明所涉及的GY-CS培養(yǎng)基是添加了濃度為100μg/mL壯觀霉素奇霉素(spectinomycin)和濃度為100μg/mL頭孢噻肟抗生素(CefotaximeSodium)的GY固體培養(yǎng)基。GY固體培養(yǎng)基組成為：20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g/L硝酸鉀，1g/L磷酸二氫鈉，3g/L七水硫酸鎂，20g/L瓊脂，余量為水，pH6.8。本發(fā)明在現(xiàn)有的高山被孢霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，采用根癌土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法，構(gòu)建了在高山被孢霉中過表達(dá)3-磷酸甘油脫氫酶基因(G3PD1)的工程菌株高山被孢霉GPD-1。獲得的基因工程菌株經(jīng)過多次傳代，G3PD1片段仍穩(wěn)定存在基因組中，且生長特性與原養(yǎng)型菌株無明顯差別，但總脂產(chǎn)量相對于原始菌株提高了50％左右，這為該基因工程菌株工業(yè)化生產(chǎn)油脂提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明的重組高山被孢霉菌株(Mortierellaalpina)GPD-1于2015年7月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo.11001高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株(Mortierellaalpina)MAU1于2013年11月01日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，其保藏編號為CGMCCNo.8414?！靖綀D說明】圖1為二元表達(dá)載體pBIG2-ura5s-G3PD1的構(gòu)建示意圖；圖2為過表達(dá)G3PD1基因的高山被孢霉重組菌株鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，M為marker，N為高山被孢霉野生型對照菌株，1、2、3、4、5分別為pBIG2-ura5s-G3PD1轉(zhuǎn)化的重組菌株：MA-G3PD1-1，MA-G3PD1-2，MA-G3PD1-3，MA-G3PD1-4，MA-G3PD1-5；圖3為高山被孢霉野生型菌株與5株基因工程菌株3-磷酸甘油脫氫酶基因(G3PD1)RT-qPCR的結(jié)果分析圖；其中，M.alpina為野生型對照；MA-G3PD1-1，MA-G3PD1-2，MA-G3PD1-3，MA-G3PD1-4，MA-G3PD1-5為重組菌株。圖4為高山被孢霉野生型菌株與5株基因工程菌株3-磷酸甘油脫氫酶活性的測定結(jié)果分析圖；其中，M.alpina為野生型對照；MA-G3PD1-1，MA-G3PD1-2，MA-G3PD1-3，MA-G3PD1-4，MA-G3PD1-5為重組菌株?！揪唧w實(shí)施方式】以下實(shí)施例用于非限制性地解釋本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例1過表達(dá)3-磷酸甘油脫氫酶基因的重組高山被孢霉菌株的構(gòu)建一、高山被孢霉G3PD1的克隆根據(jù)高山被孢霉(M.alpina)ATCC#32222G3PD1基因(GeneBankKT344118)的序列信息，設(shè)計(jì)引物P1、P2，下劃線部分分別為酶切位點(diǎn)KpnI和XmaI，以高山被孢霉cDNA為模板，用引物P1/P2、KOD高保真聚合酶，通過PCR對G3PD1基因進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的片段。PCR程序?yàn)椋?4℃3min，94℃30s，58℃30s，68℃1.5min，30個(gè)循環(huán)，68℃5min；得到PCR產(chǎn)物，再對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。P1(sense)：CGGGGTACCCCATGTCTGAAAAAGTAGCACTAATCGP2(antisense)：TCCCCCCGGGTTAGATATCCTCGACAATCCTGATG二、二元表達(dá)載體的構(gòu)建1.酶切反應(yīng)在37℃條件下，先用限制性內(nèi)切酶KpnI過夜酶切步驟(一)的PCR純化產(chǎn)物及載體pBIG2-ura5s-ITs。KpnI酶切體系(100μL)為：2μLKpnI-HF，30μL質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物，10μLcutmartBuffer，58μL去離子水，37℃水浴酶切12h。其中，載體pBIG2-ura5s-Its是中國專利申請CN201310524221.4中已經(jīng)公開的內(nèi)容。酶切產(chǎn)物回收純化后，再用內(nèi)切酶XmaI單酶切，酶切體系為(100μL)：2μLXmaI，30μL質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物，10μLcutmartBuffer，58μL去離子水，37℃水浴酶切12h。本發(fā)明涉及的內(nèi)切酶緩沖液cutsmartbuffer：50mM乙酸鉀(Potassiumacetate)，20mM(Tris-乙酸)Tris-acetate，10mM乙酸鎂(Magnesiumacetate)，100μg/mlBSA，余量為水，pH7.9。2.連接反應(yīng)用T4連接酶將酶切純化后的片段G3PD1與載體pBIG2-ura5s-ITs連接，4℃連接12h，得到重組表達(dá)載體為pBIG2-ura5s-G3PD1。連接體系為(10μL)：2μL目的基因酶切后片段，3μL載體酶切后片段，1μL連接酶buffer，1μLT4連接酶，3μL無菌水，4℃連接12h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法如下：⑴無菌狀態(tài)下取100μL感受態(tài)細(xì)胞，加入1-2μL連接產(chǎn)物，吹吸混勻。⑵將混勻的感受態(tài)細(xì)胞移入預(yù)冷過的電轉(zhuǎn)杯中，避免產(chǎn)生氣泡。⑶將電轉(zhuǎn)杯放入Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀，調(diào)到合適預(yù)設(shè)程序檔位，電轉(zhuǎn)。電壓條件為1.8kv。⑷加入1mlSOC復(fù)蘇培養(yǎng)基于電轉(zhuǎn)后的感受態(tài)細(xì)胞中，混勻轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，37℃，150rpm孵育1小時(shí)。⑸取200μL涂布含有100μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板。倒置37℃培養(yǎng)過夜。挑取陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，測序驗(yàn)證結(jié)果表明連接成功，獲得二元表達(dá)載體pBIG2-ura5s-G3PD1。其中，SOC復(fù)蘇培養(yǎng)基的組成為：20g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，0.5g/L氯化鈉，2.5mM氯化鉀，10mM氯化鎂，20mM葡萄糖，余量為水；LB固體培養(yǎng)基的組成是：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化鈉，20g/L瓊脂，余量為水。二元表達(dá)載體pBIG2-ura5s-G3PD1電擊轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌的方法參照轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10的方法，得到含有質(zhì)粒pBIG2-ura5s-G3PD1的根癌土壤桿菌C58C1。三、根癌土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化高山被孢霉MAU1(即高山被孢霉CCFM501)在已有的國內(nèi)外文獻(xiàn)有關(guān)根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化方法報(bào)道的基礎(chǔ)上，做了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化調(diào)整，具體如下：⑴將保存于-80℃的含有質(zhì)粒pBIG2-ura5s-G3PD1的根癌土壤桿菌C58C1在含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的YEP固體培養(yǎng)基平板上劃線。28℃倒置避光培養(yǎng)48小時(shí)；⑵挑取單克隆接種至20mL含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的液體YEP培養(yǎng)基中28℃，200rpm避光培養(yǎng)24-48小時(shí)；⑶4000g離心5分鐘收集菌體，倒掉上清。加5mLIM培養(yǎng)基重懸菌體，4000g離心5分鐘，倒掉上清。加2mLIM培養(yǎng)基重懸菌體；⑷用IM培養(yǎng)基調(diào)整菌濃度至OD600為0.3。置于28℃，200rpm搖床避光培養(yǎng)至OD600到1.0；⑸用500μL滅菌的生理鹽水沖刷在GY-U斜面培養(yǎng)1個(gè)月以上的高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株CCFM501(申請?zhí)枮?01310347934.8的專利申請中公開的M.alpina尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株)，收集孢子，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子濃度到107個(gè)每100μL；⑹取100μL根癌土壤桿菌與100μL孢子混合，均勻涂布于鋪有玻璃紙的IM固體培養(yǎng)基上。23℃避光培養(yǎng)36-48小時(shí)；⑺將玻璃紙轉(zhuǎn)移到含有100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL頭孢噻肟抗生素的SC平板(SC-CS)上。18℃避光培養(yǎng)12h，隨后轉(zhuǎn)移至25℃培養(yǎng)；⑻持續(xù)觀察菌落在SC-CS平板上的生長情況，若長出明顯菌落，及時(shí)用尖頭鑷子將菌落外沿挖出(大約2mm2)，接種于SC-CS平板上，繼續(xù)正置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；⑼待SC-CS平板上的轉(zhuǎn)化子長出后，挑菌絲轉(zhuǎn)接于SC-CS平板，重復(fù)篩選3次，排除陰性轉(zhuǎn)化子；⑽將篩選3次后生長的菌落接種至GY平板，28℃培養(yǎng)至產(chǎn)生大量孢子，保藏在4℃。其中，MM培養(yǎng)基成分是：1.74g/L磷酸氫二鉀，1.37g/L磷酸二氫鉀，0.146g/L氯化鈉，0.49g/L七水硫酸鎂，0.078g/L氯化鈣，0.0025g/L七水硫酸亞鐵，0.53g/L硫酸銨，1.8g/L葡萄糖，0.5wt％甘油，pH6.8，余量為水。IM培養(yǎng)基是在MM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了200μM的乙酰丁香酮(AS)構(gòu)成的。SC培養(yǎng)基的組分是：5g/L酵母氮源(無氨基酸與硫酸銨)，1.7g/L硫酸銨，20g/L葡萄糖，20mg/L腺嘌呤，30mg/L絡(luò)氨酸，1mg/L甲硫氨酸，2mg/L組氨酸，4mg/L賴氨酸，4mg/L色氨酸，5mg/L蘇氨酸，6mg/L異亮氨酸，6mg/L亮氨酸，6mg/L苯丙氨酸，2mg/L精氨酸，余量為水。GY固體培養(yǎng)基的組分是：20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g/L硝酸鉀，1g/L磷酸二氫鈉，3g/L七水硫酸鎂，20g/L瓊脂，余量為水。YEP培養(yǎng)基的組分是：10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L氯化鈉，余量為水。涉及到固體培養(yǎng)基時(shí)添加20g/L瓊脂。四、高山被孢霉過表達(dá)G3PD1工程菌株篩選和鑒定1)用3mL生理鹽水沖刷GY表面，收集液體于一個(gè)無菌1.5mL離心管中，過25μm濾膜；2)用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，調(diào)整為三種孢子濃度梯度108個(gè)每100μL、106個(gè)每100μL、104個(gè)每100μL，分別取200μL涂布于含有100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL頭孢噻肟的GY-CS平板上，25℃避光培養(yǎng)2-3天；3)隨時(shí)用無菌鑷子挑出生長的真菌菌絲SC-CS平板上，25℃培養(yǎng)2-3天；4)觀察高山被孢霉在平板上的生長情況，挑出在SC-CS平板上生長的菌絲接種于GY斜面上；5)將上述步驟4)中平板上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上傳代三次；6)將穩(wěn)定遺傳的菌株鑒定為過表達(dá)G3PD1基因的重組高山被孢霉菌株，保藏于GY斜面上；7)提取鑒定正確的重組高山被孢霉菌株的基因組DNA，用一對與啟動子和終止子特異性結(jié)合的引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證：P3(sense)：CACACACAAACCTCTCTCCCACTP4(antisense)：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC；重組菌株鑒定的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果見圖2，M為marker，N為高山被孢霉野生型對照，1、2、3、4、5：MA-G3PD1-1，MA-G3PD1-2，MA-G3PD1-3，MA-G3PD1-4，MA-G3PD1-5為pBIG2-ura5s-G3PD1轉(zhuǎn)化的重組菌株，可擴(kuò)增出兩條大小分別為818bp和1187bp的產(chǎn)物條帶，電泳結(jié)果說明二元表達(dá)載體成功整合到高山被孢霉基因組中，其中MA-G3PD1-1即為本發(fā)明的高山被孢霉(Mortierellaalpina)GPD-1。8)所述重組菌株保藏于GY斜面上。實(shí)施例2高山被孢霉脂肪酸提取與檢測⑴將高山被孢霉原養(yǎng)型菌株與實(shí)施例1篩選獲得的高山被孢霉過表達(dá)G3PD1基因的工程菌株MA-G3PD1-1(即本發(fā)明的高山被孢霉GPD-1)，MA-G3PD1-2，MA-G3PD1-3，MA-G3PD1-4和MA-G3PD1-5接種于broth培養(yǎng)基中，28℃，200r/min搖床培養(yǎng)7天；⑵收集菌體，真空冷凍干燥至恒重，稱量菌體重量，計(jì)算生物量；⑶將菌體研磨成粉末，稱取50mg，加入2mL4mol/L鹽酸；⑷80℃水浴1h，-80℃放置15分鐘。重復(fù)一次。80℃水浴1h；⑸冷卻至室溫，加入1mL甲醇，混勻；⑹加入1mL氯仿，震蕩10min。6000g離心3min。收集氯仿；⑺重復(fù)⑹兩次；⑻合并氯仿(3mL)，加入1mL飽和氯化鈉，混勻，3000g離心3分鐘。收集氯仿層于新瓶。剩余液體繼續(xù)加入1mL氯仿，3000g離心3分鐘。合并氯仿(4mL)；⑼氮吹干燥，加入1mL乙醚，轉(zhuǎn)移至潔凈的已經(jīng)稱重的瓶中。氮吹干燥。脂肪酸組成及含量的測定方法：①向上述粗脂中分別加入100μL2.02mg/ml內(nèi)標(biāo)C15:0的正己烷和1mL10wt％鹽酸的甲醇，60℃水浴3h，每隔30min振蕩1min；②冷卻至室溫后加入1mL正己烷和1mL飽和NaCl溶液，震蕩混勻，3000rpm離心3min，吸出正己烷層，再加入1mL正己烷，震蕩混勻，3000rpm離心3min，吸出并合并正己烷；③37℃氮?dú)獯蹈珊螅尤?mL正己烷，混勻，轉(zhuǎn)入氣相瓶，得到脂肪酸甲酯溶液；④脂肪酸甲酯分析采用GC-2010(ShimadzuCo.，Japan)，色譜柱為DB-Waxetr(30m×0.32mm，0.22μm)。氫火焰離子檢測器檢測，汽化室和檢測器溫度分別為240℃和260℃，分流方式進(jìn)樣1μL，分流比10:1，載氣為氮?dú)?。程序升溫：初始溫?20℃保持3min，以5℃/min升到190℃，再以4℃/min升到220℃，保持20min。通過與商業(yè)化的脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(37種脂肪酸甲酯混標(biāo)，Supelco，USA)和加入內(nèi)標(biāo)C15:0的質(zhì)量比較，定性、定量分析樣品中脂肪酸組分，其中總脂肪酸含量用單位菌體中總脂肪酸的質(zhì)量表示。表1高山被孢霉野生型菌株與五株基因工程菌株脂肪酸產(chǎn)量的比較表1結(jié)果顯示各轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)脂率相比野生型高山被孢霉產(chǎn)量有明顯提高，其中MA-G3PD1-1(高山被孢霉GPD-1)的總脂含量由野生型的27.71wt％提高到42.74wt％，提高了50％左右。各轉(zhuǎn)化子總脂含量的差異可能是由G3PD1基因整合到高山被孢霉染色體的位點(diǎn)不同造成的。實(shí)施例3陽性轉(zhuǎn)化子中G3PD1轉(zhuǎn)錄水平的RT-qPCR檢測根據(jù)G3PD1序列和內(nèi)參18SrDNA序列設(shè)計(jì)引物：P5(sense)：TACGCCAACCTTCAGAGTCAAP6(antisense)：TGAGACCATCAACCAATCCACCP7(sense)：CGTACTACCGATTGAATGGCTTAGP8(antisense)：CCTACGGAAACCTTGTTACGACT高山被孢霉總RNA提取：1.取出適量在液氮中凍存的菌體，于預(yù)冷的無菌無酶研缽中加入液氮充分研磨；2.加入1mLTRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)繼續(xù)研磨至粉末，室溫放置至溶解；3.用無酶槍頭吸取1mL上述步驟中液體于無酶離心管中，加入200μL三氯甲烷混勻；4.12000rpm，4℃，離心15min吸上清于新的無酶離心管中；5.加入200μL三氯甲烷混勻，12000rpm，4℃，離心15min吸上清于新的無酶離心管中；6.加入等體積的異丙醇，靜置15min，12000rpm，4℃，離心15min。棄上清，室溫晾干；7.加入1ml的70vol％乙醇，12000rpm，4℃，離心15min。用無酶槍頭吸去乙醇，室溫放置干燥；8.加入50μL無酶水溶解RNA，-80℃儲存；9.濃度測定：取1μLRNA用Nanodrop2000測定濃度；10.變性膠電泳檢測RNA完整性：取1μgRNA在1.2％的變性膠中電泳，觀察RNA完整性。取0.5-1μg總RNA為模板，根據(jù)PrimeScriptRTreagentkit(TaKaRa,Otsu,Shiga,Japan)試劑盒說明進(jìn)行操作，獲得重組菌株的cDNA。使用ABI-Prism7900sequencedetectionsystem(AppliedBiosystems,CA)按照SYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems,CA)的說明進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：10μlSYBRGreenPCRMasterMix，兩種引物各0.5μl，8μl無酶水，1μl模板。PCR循環(huán)設(shè)置為50℃2min，95℃10min，95℃15s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)。18SrDNA作為內(nèi)參基因，各轉(zhuǎn)化子取三個(gè)平行。結(jié)果如圖3所示，M.alpina為野生型對照；MA-G3PD1-1，MA-G3PD1-2，MA-G3PD1-3，MA-G3PD1-4，MA-G3PD1-5為重組菌株，5株基因工程菌G3PD1的轉(zhuǎn)錄量均明顯高于對照菌株，提高2倍左右，其中MA-G3PD1-1表達(dá)量為M.alpina野生型對照2.3倍，說明通過使用根癌土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化高山被孢霉的方法可以明顯提高3-磷酸甘油脫氫酶基因的轉(zhuǎn)錄。實(shí)施例4陽性轉(zhuǎn)化子中3-磷酸甘油脫氫酶活性測定取0.2g菌體用液氮充分研磨至粉末，加入2mL酶提取緩沖液(含有100mM磷酸二氫鉀/氫氧化鉀緩沖液(pH7.5)，1mM苯甲脒鹽酸，1mM二硫蘇糖醇和20wt％甘油)，轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，4℃，10000g，離心5min，吸取上清液到新的1.5mL離心管中即粗蛋白提取液。3-磷酸甘油脫氫酶活性測定反應(yīng)體系各組分濃度為：20mM咪唑鹽酸緩沖液(pH7.0)，1mM氯化鎂，0.09mM還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，0.67mM磷酸二羥丙酮，粗蛋白約0.1mg/mL。測定方法：迅速混勻除磷酸二羥丙酮外的其他試劑，30℃保溫2min；340nm處測定3min，待數(shù)值基本穩(wěn)定后，加入磷酸二羥丙酮，于340nm處測定3min，根據(jù)單位時(shí)間內(nèi)吸光值的變化計(jì)算酶活。3-磷酸甘油脫氫酶酶活以每mg蛋白每分鐘產(chǎn)物的增加量或底物的減少量表示。結(jié)果如圖4所示。M.alpina為野生型對照；MA-G3PD1-1，MA-G3PD1-2，MA-G3PD1-3，MA-G3PD1-4，MA-G3PD1-5為重組菌株，5株基因工程菌3-磷酸甘油脫氫酶活性均明顯高于對照菌株，均提高2倍左右，說明過表達(dá)G3PD1提高了3-磷酸甘油脫氫酶的活性。結(jié)果表明，本發(fā)明獲得的高山被孢霉過表達(dá)3-磷酸甘油脫氫酶工程菌株經(jīng)過多次傳代后，G3PD1片段仍穩(wěn)定存在基因組中，且脂肪酸分析結(jié)果顯示所得到的基因工程菌株中脂質(zhì)產(chǎn)量均有明顯提高，挑選脂質(zhì)產(chǎn)量提高達(dá)50％的菌株MA-G3PD1-1保藏為本發(fā)明的高山被孢霉GPD-1，用此方法構(gòu)建的基因工程菌株及構(gòu)建方法為后續(xù)工業(yè)化奠定了理論及應(yīng)用基礎(chǔ)。雖然本發(fā)明專利已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種改動與修飾。因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。