專利名稱：一種葡萄糖脫氫酶的生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程領域，具體涉及一種利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖脫氫酶的方法，主要用到微生物發(fā)酵方面的流加補料技術。
背景技術：
葡萄糖脫氫酶(Glucose dehydrogenase,縮寫GlcDH),是短鏈乙醇脫氫酶家族的一員，在輔酶NAD (P)+等存在時能夠催化β-D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸。葡萄糖脫氫酶廣泛應用于催化制備手性醇、羥基酸、氨基酸等方面，這些酶催化反應一般都需要輔酶NAD (P) H的參與，而這些輔酶價格昂貴，因此NAD(P)H的再生對于消減成本是非常必要的。美國施貴寶公司在利用白地霉脫氫酶不對稱還原4-氯-3-羰基丁酸甲酯合成(s) -4-氯-3-羥基丁酸甲酯的規(guī)?；a(chǎn)中，有效地利用了葡萄糖脫氫酶進行輔酶NADP+-NADPH的循環(huán)，該反應的產(chǎn)率高達95%，產(chǎn)品為降膽固醇藥物的手性原料?，F(xiàn)有技術中，葡萄糖脫氫酶主要從動物的肝臟提取，或者由芽孢桿菌發(fā)酵而來，來源受到限制。而國內(nèi)葡萄糖脫氫酶都主要依靠進口。由于葡萄糖脫氫酶具有廣泛的應用價值，市場需求量也日益增加，因此，開發(fā)一種廉價高效的葡萄糖脫氫酶的生產(chǎn)方法具有十分重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術中葡萄糖脫氫酶的來源受到限制而難以滿足市場需求的問題，提供一種利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖脫氫酶的方法。為解決以上技術問題，本發(fā)明采取如下技術方案
一種葡萄糖脫氫酶的生產(chǎn)方法，是先構建表達了葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌并將其接種至初始培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，發(fā)酵過程中通過流加補料技術向包含所述重組大腸桿菌的發(fā)酵液中添加補料培養(yǎng)基，當發(fā)酵參數(shù)達到設定閾值時，再向發(fā)酵液中添加誘導劑，并繼續(xù)發(fā)酵一定時間至發(fā)酵結(jié)束，最后從發(fā)酵液的培養(yǎng)物中取得葡萄糖脫氫酶；其中，流加補料時，補料培養(yǎng)基的流加速度隨著發(fā)酵時間的延長而梯度遞增，至添加誘導劑后保持不變。流加補料技術是發(fā)酵過程中用來提高菌體濃度的一種傳統(tǒng)方法。這種方法能控制發(fā)酵時培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分的濃度，因此在細胞生長或產(chǎn)物形成對底物濃度受限敏感的工藝過程中使用比較理想。根據(jù)本發(fā)明，所述的發(fā)酵參數(shù)可以為發(fā)酵液的細胞光密度、發(fā)酵液中的溶氧或發(fā)酵液中的碳源總濃度等。若未經(jīng)特殊說明，本發(fā)明中所述的細胞光密度皆指的是0D_值。0D_是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標準方法。OD是optical density (光密度)的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度，是檢測方法里的專有名詞。光通過被檢測物，前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量，特定波長下，同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關系。0D_指的就是某種溶液在600nm波長處的吸光值。吸光值正比于溶液中的吸光物質(zhì)的濃度，相應地與樣品的透過率成反比。本發(fā)明優(yōu)選的一種生產(chǎn)方法，包括以下步驟
(1)、準備階段構建基因工程菌，配制種子培養(yǎng)基、初始培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基；使基因工程菌在所述種子培養(yǎng)基中活化，然后將活化后得到的種子液接種到初始培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，按體積比，接種時種子液/初始培養(yǎng)基=1°/Γ4% ;所述基因工程菌為表達了葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌；
(2)、發(fā)酵過程本發(fā)明根據(jù)發(fā)酵進行的不同階段，細胞對培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分的消耗速度不同，將發(fā)酵過程分為六個階段，并以培養(yǎng)液中的細胞光密度(0D_)來劃分這六個階段， 依次為第一階段(Γ4、第二階段Γ8、第三階段8 12、第四階段12 16、第五階段16 20和第六階段 OD6tltl > 20 ；
當發(fā)酵液中的細胞光密度(0D_)隨著發(fā)酵的進行依次達到4、8、12、16、20時，通過流加補料技術分批向發(fā)酵液中補充補料培養(yǎng)基，且補料培養(yǎng)基的流加速度依次對應為(TlOg/ l/h、l(T20g/l/h、2(T30g/l/h、3(r40g/l/h、4(r50g/l/h ;當細胞光密度(0D_) > 20 時，向發(fā)酵液中添加誘導劑，且誘導劑在發(fā)酵液中的加入質(zhì)量占發(fā)酵液總量的O. 019Γ0. 2% ;然后在保持補料培養(yǎng)基的流加速度不變的情況下繼續(xù)發(fā)酵16 20小時；
發(fā)酵過程的前五個階段為菌體生長階段，補料培養(yǎng)基的流加速度保持較低，在(Γ40 g/ Ι/h之間,且補料培養(yǎng)基的流加速度應隨著發(fā)酵的進行逐漸加快，以適應菌體生長對培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)的需求增加；發(fā)酵過程的第六階段為誘導表達階段，補料培養(yǎng)基的流加速度應保持較快，在40 50 g/1/h之間。(3)、步驟(2)完成后，采用常規(guī)方法從步驟(2)所得發(fā)酵液的培養(yǎng)物中取得葡萄糖脫氫酶，經(jīng)后續(xù)處理，完成整個生產(chǎn)過程。優(yōu)選地，所述初始培養(yǎng)基包括蛋白胨6 15g/L、酵母粉5 10g/L、甘油6 18g/L、硫酸鎂f4g/L、磷酸鹽r8g/L和氯化鈉5 12g/L ;所述補料培養(yǎng)基包括蛋白胨、酵母粉和甘油，且按質(zhì)量計蛋白胨酵母粉甘油=2:1:14 15。優(yōu)選地，發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的溶氧維持在309Γ40%之間，發(fā)酵液pH值控制在
6.8 7.3之間(可用氨水調(diào)節(jié))。優(yōu)選地，所述誘導劑為異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。優(yōu)選地，添加誘導劑前，發(fā)酵溫度控制在37°C ;添加誘導劑后的發(fā)酵溫度控制在 28°C。即發(fā)酵過程的前五個階段(菌體生長階段)，溫度應控制在37°C，利于菌體繁殖生長， 而發(fā)酵過程的第六階段(誘導表達階段)，發(fā)酵溫度應控制在28°C，利于葡萄糖脫氫酶的誘導生成。優(yōu)選地，步驟(I)中，所述種子培養(yǎng)基包括蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L和NaCl IOg/ L,且pH值為7. 0，使用前需高溫滅菌。由于以上技術方案的實施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)點
I、本發(fā)明利用基因工程菌發(fā)酵的方法獲得葡萄糖脫氫酶，根據(jù)發(fā)酵過程的不同階段采用流加補料的技術為發(fā)酵液逐漸補充營養(yǎng)物質(zhì)，使發(fā)酵過程中的發(fā)酵條件盡可能與菌體實際需要相適應，大大有利于菌體的生長和外源蛋白的高效表達。2、本發(fā)明可有效避免由于發(fā)酵某個階段培養(yǎng)基過量引起的底物抑制，并可有效控制誘導表達階段菌體的生長速度。
3、用本發(fā)明方法生產(chǎn)葡萄糖脫氫酶的時候，葡萄糖脫氫酶的表達量在總蛋白中的比例可高達47. 2%，可達6. 3g/L。
具體實施例方式下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，但不限于這些實施例。本發(fā)明中的基因工程菌一重組大腸桿菌的構建按照常規(guī)分子生物操作完成見 《分子克隆》(科學出版社，第二版，2002年)。本實驗使用的發(fā)酵罐為上海保興生物設備工程有限公司生產(chǎn)的BIOTECH-1OL發(fā)酵罐。各培養(yǎng)基的組成如下
種子培養(yǎng)基
蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L, NaCl 10 g/L，調(diào)節(jié)pH=7. 0，121°C滅菌20分鐘。初始培養(yǎng)基
蛋白胨12g/L、酵母粉6 g/L、甘油18 g/L、硫酸鎂2. 3 g/L、磷酸二氫鉀I. 7 g/L、磷酸氫二鉀2. 6 g/L、氯化鈉10 g/L，調(diào)節(jié)pH=7. 2，加消泡劑O. 5 g/L，121°C滅菌30分鐘。初始裝液量5L。補料培養(yǎng)基
蛋白胨為60 g/L，酵母粉為30 g/L，甘油為432 g/L，121°C滅菌30分鐘。以下通過葡萄糖脫氫酶的幾種不同發(fā)酵生產(chǎn)方法的對比，對本發(fā)明的生產(chǎn)方法做進一步說明。實施例I
本實施例提供一種發(fā)酵過程中不采用流加補料技術來生產(chǎn)葡萄糖脫氫酶的方法，具體過程如下
甘油管保存的重組大腸桿菌種子經(jīng)種子培養(yǎng)基活化15小時后，按2%接種量接入發(fā)酵罐。發(fā)酵罐參數(shù)設置溫度37°C，初始通氣量5L/min，初始攪拌速度200rpm，初始溶氧(DO) 為100%。通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速及通氣量控制發(fā)酵過程溶氧水平在30%-40%之間，用氨水控制 pH=7. 2 + 0. I。發(fā)酵3小時左右，當OD600達到4時，開始降溫至28°C，并加入占發(fā)酵液總量
O.03%的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)12小時至溶氧回升至100%，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分耗盡后發(fā)酵結(jié)束。采用此發(fā)酵工藝，15小時發(fā)酵終了時，菌體濃度(用細胞光密度OD6c 表示)達到 15，葡萄糖脫氫酶產(chǎn)量可以達到1.6g/L。實施例2
本實施例提供一種發(fā)酵過程中采用恒速流加補料技術來生產(chǎn)葡萄糖脫氫酶的方法，具體過程如下
甘油管保存的重組大腸桿菌種子經(jīng)種子培養(yǎng)基活化15小時后，按2%接種量接入發(fā)酵罐。發(fā)酵罐參數(shù)設置溫度37°C，初始通氣量5L/min，初始攪拌速度200rpm，初始溶氧(DO) 為100%。通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速及通氣量控制發(fā)酵過程溶氧水平在30%-40%之間，用氨水控制 pH=7. 2±0. I。發(fā)酵3小時左右，當0D_達到4時，開始以恒定的40 g/1/h的流加速度向發(fā)酵液中添加補料培養(yǎng)基。14小時左右，OD600達到20時，開始降溫至28°C，并加入占發(fā)酵液總量O. 03%的IPTG，保持40 g/1/h的補料速度繼續(xù)培養(yǎng)14小時后發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過程攪拌最高轉(zhuǎn)速為600rpm，通氣量最大至20L/min，溶氧可一直控制在30%_40%之間。
采用此發(fā)酵工藝，28小時發(fā)酵終了時，菌體濃度(用細胞光密度OD6c 表示)達到 68，葡萄糖脫氫酶產(chǎn)量可以達到4. 8g/L。實施例3
本實施例提供一種發(fā)酵過程中采用本發(fā)明的梯度流加補料技術來生產(chǎn)葡萄糖脫氫酶的方法，具體過程如下
甘油管保存的重組大腸桿菌種子經(jīng)種子培養(yǎng)基活化15小時后，按2%接種量接入發(fā)酵罐。發(fā)酵罐參數(shù)設置溫度37°C，初始通氣量5L/min，初始攪拌速度200rpm，初始溶氧(DO) 為100%。通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速及通氣量控制發(fā)酵過程溶氧水平在30%-40%之間，用氨水控制 pH=7. 2±0. I。發(fā)酵3小時左右，當OD6tltl達到4時，開始以8 g/1/h的流加速度向發(fā)酵液中添加補料培養(yǎng)基；5小時左右，當OD6tltl達到8時，調(diào)整補料速度為16g/l/h ；7小時左右，當 OD600達到12時，調(diào)整補料速度為24 g/1/h ；8. 5小時左右，當0D_達到16時，調(diào)整補料速度為32 g/1/h ；10小時左右，當OD600達到20時，調(diào)整補料速度為40 g/1/h，同時開始降溫至28°C，并加入占發(fā)酵液總量O. 03%的IPTG，保持40 g/1/h的補料速度繼續(xù)培養(yǎng)18小時后發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過程攪拌最高轉(zhuǎn)速為600rpm,通氣量最大至20L/min,溶氧可一直控制在 30%-40% 之間。采用此發(fā)酵工藝，28小時發(fā)酵終了時，菌體濃度(用細胞光密度OD6c 表示)達到 95，葡萄糖脫氫酶產(chǎn)量可以達到6. 3g/L。以上對本發(fā)明做了詳盡的描述，其目的在于讓熟悉此領域技術的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍，凡根據(jù)本發(fā)明的精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
權利要求
1.一種葡萄糖脫氫酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所述生產(chǎn)方法是先構建表達了葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌并將其接種至初始培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，發(fā)酵過程中通過流加補料技術向包含所述重組大腸桿菌的發(fā)酵液中添加補料培養(yǎng)基，當發(fā)酵參數(shù)達到設定閾值時，再向發(fā)酵液中添加誘導劑，并繼續(xù)發(fā)酵一定時間至發(fā)酵結(jié)束，最后從發(fā)酵液的培養(yǎng)物中取得葡萄糖脫氫酶；其中，流加補料時，補料培養(yǎng)基的流加速度隨著發(fā)酵時間的延長而梯度遞增，至添加誘導劑后保持不變。
2.根據(jù)權利要求I所述的葡萄糖脫氫酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所述發(fā)酵參數(shù)為發(fā)酵液的細胞光密度、發(fā)酵液中的溶氧或發(fā)酵液中的碳源總濃度。
3.根據(jù)權利要求I所述的葡萄糖脫氫酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所述生產(chǎn)方法包括以下步驟(1)、準備階段構建基因工程菌，配制種子培養(yǎng)基、初始培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基；使基因工程菌在所述種子培養(yǎng)基中活化，然后將活化后得到的種子液接種到初始培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，按體積比，接種時種子液/初始培養(yǎng)基=1°/Γ4% ;所述基因工程菌為表達了葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌；(2)、發(fā)酵過程當發(fā)酵液中的細胞光密度隨著發(fā)酵的進行依次達到4、8、12、16、20時， 通過流加補料技術分批向發(fā)酵液中補充補料培養(yǎng)基，且補料培養(yǎng)基的流加速度依次對應為 (Tl0g/l/h、l(T20g/l/h、2(r30g/l/h、3(r40g/l/h、4(r50g/l/h ;當細胞光密度 > 20 時，向發(fā)酵液中添加誘導劑，且誘導劑在發(fā)酵液中的加入質(zhì)量占發(fā)酵液總量的O. 019Γ0. 2% ;然后在保持補料培養(yǎng)基的流加速度不變的情況下繼續(xù)發(fā)酵16 20小時；(3)、從步驟(2)所得發(fā)酵液的培養(yǎng)物中取得葡萄糖脫氫酶。
4.根據(jù)權利要求I或2或3所述的葡萄糖脫氫酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所述初始培養(yǎng)基包括蛋白胨6 15g/L、酵母粉5 10g/L、甘油6 18g/L、硫酸鎂f 4g/L、磷酸鹽r8g/L 和氯化鈉5 12g/L ;所述補料培養(yǎng)基包括蛋白胨、酵母粉和甘油，且按質(zhì)量計蛋白胨酵母粉甘油=2:1:14 15。
5.根據(jù)權利要求I或2或3所述的葡萄糖脫氫酶的生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的溶氧維持在30°/Γ40%之間，發(fā)酵液pH值控制在6. 8^7. 3之間。
6.根據(jù)權利要求I或2或3所述的葡萄糖脫氫酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所述誘導劑為異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷。
7.根據(jù)權利要求I或2或3所述的葡萄糖脫氫酶的生產(chǎn)方法，其特征在于添加誘導劑前，發(fā)酵溫度控制在37°C ;添加誘導劑后的發(fā)酵溫度控制在28°C。
8.根據(jù)權利要求3所述的葡萄糖脫氫酶的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(I)中，所述種子培養(yǎng)基包括蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L和NaCl 10g/L，且pH值為7. O。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種葡萄糖脫氫酶的生產(chǎn)方法，主要是采用了微生物發(fā)酵方面的流加補料技術，利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖脫氫酶。具體過程是在37℃的培養(yǎng)溫度下，培養(yǎng)含有葡萄糖脫氫酶基因的重組大腸桿菌，從而表達葡萄糖脫氫酶；然后將所述重組大腸桿菌接種至培養(yǎng)基進行發(fā)酵，發(fā)酵過程中通過流加補料技術向包含所述重組大腸桿菌的發(fā)酵液中添加補料培養(yǎng)基，并使流加速度隨著發(fā)酵時間的延長而梯度遞增；當菌體初始生長階段結(jié)束后，加入誘導劑，將溫度由37℃降至約28℃后保持恒溫，至發(fā)酵結(jié)束。本發(fā)明方法使發(fā)酵過程中的發(fā)酵條件盡可能與菌體實際需要相適應，可以使菌體密度達到高值，提高葡萄糖脫氫酶的產(chǎn)量，具有極好的產(chǎn)業(yè)應用價值。
文檔編號C12N9/04GK102604904SQ201210065718
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月14日 優(yōu)先權日2012年3月14日
發(fā)明者劉毅, 周強強, 武濤, 陳令偉 申請人:蘇州漢酶生物技術有限公司