專利名稱：：編碼葡萄糖－6－磷酸脫氫酶蛋白的基因的制作方法
背景技術(shù)：
：細(xì)胞中天然進(jìn)行的代謝過程所產(chǎn)生的特定產(chǎn)物和副產(chǎn)物可以用于工業(yè)的許多分支中，包括食品工業(yè)、動(dòng)物飼料工業(yè)、化妝品工業(yè)及制藥工業(yè)。這些分子合起來稱為“精細(xì)化學(xué)品”，其包括有機(jī)酸、蛋白原性(protainogenic)和非蛋白原性氨基酸、核苷酸和核苷、脂類和脂肪酸、二醇、碳水化合物、芳香化合物、維生素和輔因子、以及酶。它們的最好的產(chǎn)生途徑是大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)菌，針對(duì)不同的特定情況，這些細(xì)菌被開發(fā)出來以產(chǎn)生并分泌大量的期望分子。一種對(duì)此目的尤其適用的生物體是谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)，其為革蘭氏陽性的非致病細(xì)菌。通過菌株選擇，已開發(fā)了許多突變菌株，它們產(chǎn)生各種期望化合物。但是，對(duì)具有提高的特定分子產(chǎn)量的菌株的篩選是一種費(fèi)時(shí)且困難的方法。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了新的可用于谷氨酸棒狀桿菌或相關(guān)菌種的鑒定或分類的核酸分子。谷氨酸棒狀桿菌為革蘭氏陽性需氧細(xì)菌，其廣泛地用在工業(yè)上用于大規(guī)模產(chǎn)生多種精細(xì)化學(xué)品，也用于降解碳?xì)浠衔?如在原油泄漏物中)，以及用于氧化萜類化合物。本發(fā)明的核酸分子因此可用于鑒定能如通過發(fā)酵法用來產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品的微生物。雖然谷氨酸棒狀桿菌自身為非致病的，但它與作為人類的主要病原體的其它谷氨酸棒狀桿菌菌種，如白喉棒狀桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)(白喉的致病因子)有親緣關(guān)系。所以能夠鑒定棒狀桿菌的存在也具有顯著的臨床重要性，例如診斷應(yīng)用。而且，所述核酸分子可作為谷氨酸棒狀桿菌或相關(guān)生物基因組作圖的參考點(diǎn)。這些新的核酸分子編碼稱作葡萄糖-6-磷酸-脫氫酶蛋白的蛋白。棒狀桿菌的葡萄糖-6-磷酸-脫氫酶基因在例如EP1108790A2中描述。然而，其中描述的基因編碼的多肽序列比根據(jù)本發(fā)明在此描述的序列要短。與本文要求的多肽序列相比，EP1108790A2中描述的葡萄糖-6-磷酸-脫氫酶的N末端被截去30個(gè)氨基酸。Moritz等(Eur.J.Biochemistry267，3442-3452，2000)描述了谷氨酸棒狀桿菌葡萄糖-6-磷酸-脫氫酶的分離。其中公開的N-末端蛋白質(zhì)測(cè)序表明該多肽從絲氨酸開始，與本發(fā)明的蛋白不同。本發(fā)明涉及編碼葡萄糖-6-磷酸-脫氫酶的新基因，其從第1位或第2位氨基酸(即Val或Ser)開始，并且在243位編碼一個(gè)非Ala的蛋白原性氨基酸(根據(jù)SEQIDNO2編號(hào))。尤其優(yōu)選從1位氨基酸開始并且在243位編碼Thr的葡萄糖-6-磷酸-脫氫酶的新基因(根據(jù)SEQIDNO2編號(hào))。本發(fā)明的核酸分子可以用于生物的遺傳操作，以便使該生物成為更好的、更有效的一種或多種精細(xì)化學(xué)品的生產(chǎn)者?？梢孕揎棻景l(fā)明的分子以提高一種或多種精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或生產(chǎn)效率。此外，本發(fā)明的分子可參與一種或多種影響谷氨酸棒狀桿菌中一種或多種精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)速率的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。例如，對(duì)于從胞外培養(yǎng)基向胞內(nèi)輸入一種或多種糖所必需的蛋白質(zhì)(例如Hpr、酶I或酶II復(fù)合體的成分)，當(dāng)細(xì)胞中存在足量糖時(shí)其經(jīng)常被翻譯后修飾從而不再能夠輸入所述糖。雖然運(yùn)輸系統(tǒng)被切斷時(shí)糖的量足夠維持正常細(xì)胞功能，但是其將限制目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品的過量生產(chǎn)。所以建議修飾本發(fā)明的蛋白從而使它們不再應(yīng)答這種負(fù)調(diào)節(jié)。結(jié)果，一種或多種糖可能達(dá)到更高的胞內(nèi)濃度，并延及到含有所述突變蛋白的生物可以更有效率或更高產(chǎn)率地生產(chǎn)一種或多種精細(xì)化學(xué)品。以下將序列表中的核酸序列以及下表1中描述的在相關(guān)位置處的序列修飾一起定義為集合A。以下將序列表中的多肽序列以及下表1中描述的在相關(guān)位置處的序列修飾一起定義為集合B。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸分子長(zhǎng)度至少15個(gè)核苷酸并且在嚴(yán)緊條件下與含有集合A的核苷酸序列的核酸分子雜交。分離的核酸分子優(yōu)選與天然發(fā)生的核酸分子對(duì)應(yīng)。分離的核酸更優(yōu)選編碼天然發(fā)生的谷氨酸棒狀桿菌G6PD蛋白或其生物活性部分。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及載體(例如重組表達(dá)載體)，其含有本發(fā)明的核酸分子，還涉及所述載體導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞制備G6PD蛋白?？梢詮呐囵B(yǎng)基或宿主細(xì)胞中分離該G6PD蛋白。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及其中導(dǎo)入了G6PD基因或其中的G6PD基因被修飾的遺傳修飾的微生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過導(dǎo)入至少一個(gè)編碼突變G6PD序列的本發(fā)明核酸分子作為轉(zhuǎn)基因，修飾所述微生物的基因組。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過與修飾的G6PD基因同源重組，修飾(例如破壞功能)所述微生物基因組中的內(nèi)源性G6PD基因。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，微生物屬于棒狀桿菌或短桿菌(Brevibacterium)屬，尤其優(yōu)選谷氨酸棒狀桿菌。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該微生物也被用于制備目標(biāo)化合物，如氨基酸、尤其優(yōu)選賴氨酸。另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是具有一種以上集合A中描述的核酸分子的宿主細(xì)胞。可用各種技術(shù)人員已知的方法制備這些宿主細(xì)胞。例如，可通過攜帶幾種本發(fā)明核酸分子的載體轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。然而，也可以使用每次導(dǎo)入一個(gè)本發(fā)明的核酸分子的載體并由此同時(shí)或相繼使用多個(gè)載體。從而可能構(gòu)建攜帶多個(gè)乃至高達(dá)數(shù)百個(gè)的本發(fā)明核酸序列的宿主細(xì)胞。這種積累通常能夠?qū)λ拗骷?xì)胞的精細(xì)化學(xué)品的生產(chǎn)力產(chǎn)生超加性效應(yīng)。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及分離的G6PD蛋白或其部分，例如具有生物學(xué)活性的部分。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該分離的G6PD蛋白或其部分可參與輸入富含能量的碳分子(例如葡萄糖、果糖或蔗糖)到谷氨酸棒狀桿菌中，而且還可參與谷氨酸棒狀桿菌的一種或多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該分離的G6PD蛋白或其部分與集合B的一條氨基酸序列充分同源以至該蛋白或其部分仍然能夠參與輸入富含能量的碳分子(例如葡萄糖、果糖或蔗糖)到谷氨酸棒狀桿菌中和/或參與谷氨酸棒狀桿菌的一種或多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。此外，本發(fā)明提供了一種分離的葡萄糖-6-磷酸-脫氫酶蛋白制品。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該葡萄糖-6-磷酸-脫氫酶蛋白(G6PD)含有一段集合B的氨基酸序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的完整長(zhǎng)度的蛋白，其和集合B的完整氨基酸序列(其由集合A中的可讀框編碼)基本同源。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及制備精細(xì)化學(xué)品的制備方法。該方法涉及培養(yǎng)含有可以導(dǎo)致本發(fā)明核酸分子表達(dá)的載體的細(xì)胞從而生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法還包括得到含有載體的細(xì)胞的步驟，其中所述細(xì)胞被可以導(dǎo)致核酸表達(dá)的載體轉(zhuǎn)染。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法還包括從培養(yǎng)物中得到精細(xì)化學(xué)品的步驟。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該細(xì)胞屬于棒狀桿菌屬或短桿菌屬。I.精細(xì)化學(xué)品術(shù)語“精細(xì)化學(xué)品”為本領(lǐng)域所認(rèn)知，其包括已用于多種工業(yè)的由生物體產(chǎn)生的分子，其中所述工業(yè)例如但不限于制藥工業(yè)、農(nóng)業(yè)工業(yè)和化妝品工業(yè)。此類化合物包括有機(jī)酸如酒石酸、衣康酸和二氨基庚二酸、蛋白原的和非蛋白原的氨基酸、嘌呤和嘧啶堿基、核苷和核苷酸(如在Rehm等人編輯的生物技術(shù)(Biotechnology)第6卷中Kuninaka，A.(1996)核苷酸和相關(guān)化合物(Nucleotidesandrelatedcompounds)，561-612頁，VCHWeinheim及其中所含參考文獻(xiàn)中所述)、脂類、飽和和不飽和脂肪酸(如花生四烯酸)、二醇(如丙二醇和丁二醇)、碳水化合物(如透明質(zhì)酸和海藻糖)、芳香化合物(如芳香胺、香草醛和靛藍(lán))、維生素和輔因子(參見如Ullmann工業(yè)化學(xué)百科全書(Ullmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry)，A27卷，“維生素”(“Vitamins”)，443-613頁(1996)VCHWeinheim及其中的參考文獻(xiàn)；以及Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)UNESCO/馬來西亞科學(xué)和技術(shù)協(xié)會(huì)和亞州自由基研究協(xié)會(huì)聯(lián)盟舉辦的“營(yíng)養(yǎng)、脂類、健康和疾病“論文集(“Nutrition，Lipids，Health，andDisease”ProceedingsoftheUNESCO/ConfederationofScientificandTechnologicalAssociationsinMalaysia，andtheSocietyforFreeRadicalResearch-Asia)，1994年9月1-3日在馬來西亞檳榔嶼舉行，AOCSPress，(1995))、酶以及在Gutcho(1983)通過發(fā)酵的化學(xué)品(ChemicalsbyFermentation)，NoyesDataCorporation，ISBN0818805086和其中的參考文獻(xiàn)中所述的所有其它化學(xué)品。這些精細(xì)化學(xué)品中的某些化學(xué)品的代謝和用途進(jìn)一步闡述如下。A.氨基酸代謝和用途氨基酸包含所有蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元，由此為正常細(xì)胞功能所必需。術(shù)語“氨基酸”為本領(lǐng)域所認(rèn)知。蛋白原性氨基酸有20種，為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元，在蛋白質(zhì)中它們通過肽鍵連接，非蛋白原性氨基酸(已知成百種非蛋白原的氨基酸)在蛋白質(zhì)中通常不存在(參見Ulmann工業(yè)化學(xué)百科全書(Ulmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry))，A2卷，57-97頁，VCHWeinheim(1985))。氨基酸可為D-或L-構(gòu)型，盡管在天然存在的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的唯一類型通常為L(zhǎng)-氨基酸。已充分說明了20種蛋白原性氨基酸中每一種在原核和真核細(xì)胞中的生物合成和降解途徑(參見例如，Stryer，L.生物化學(xué)(Biochemistry)，第三版，578-590頁(1988))?！氨匦琛卑被?組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸)，這樣稱呼是因?yàn)橛捎谒鼈兩锖铣傻膹?fù)雜性，通常必須從食物中攝取它們，它們被簡(jiǎn)單的生物合成途徑轉(zhuǎn)化為其余11種“非必需”氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸和酪氨酸)。高等動(dòng)物能夠合成這些氨基酸中的一部分氨基酸，但必需氨基酸必須從食物中攝取，以進(jìn)行正常的蛋白質(zhì)合成。除了它們?cè)诘鞍踪|(zhì)生物合成中的功能外，這些氨基酸本身還是令人感興趣的化學(xué)品，并且許多已發(fā)現(xiàn)在人類食品、動(dòng)物飼料、化學(xué)品、化妝品、農(nóng)業(yè)和藥學(xué)工業(yè)中具有多種應(yīng)用。賴氨酸不僅對(duì)人的營(yíng)養(yǎng)而且對(duì)單胃動(dòng)物如禽和豬都是一種重要的氨基酸。谷氨酸鹽是最常用的調(diào)味添加劑(谷氨酸單鈉鹽，MSG)，并且還用于食品工業(yè)，天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和半胱氨酸也是如此。甘氨酸、L-甲硫氨酸和色氨酸均用于藥學(xué)工業(yè)。谷氨酰胺、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸、絲氨酸和丙氨酸用于藥學(xué)工業(yè)和化妝品工業(yè)。蘇氨酸、色氨酸和D/L-甲硫氨酸是廣泛使用的動(dòng)物飼料添加劑。(Rehm等人(編輯)，生物技術(shù)(Biotechnology)，第6卷，第14a章中的Leuchtenberger，W.(1996)Aminoaids-technicalproductionanduse，466-502頁，VCHWeinheim)。還發(fā)現(xiàn)這些氨基酸適用作前體，用于合成合成的氨基酸和蛋白質(zhì)，如N-乙酰半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羥色氨以及在Ulmann工業(yè)化學(xué)百科全書(Ulmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry)，A2卷，57-97頁，VCHWeinheim，1985中所述的其它物質(zhì)。在可產(chǎn)生這些天然氨基酸的生物體如細(xì)菌中已充分描述了它們的生物合成(細(xì)菌氨基酸生物合成及其調(diào)節(jié)的綜述，見Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47533-606)。谷氨酸通過還原胺化α-酮戊二酸(檸檬酸循環(huán)中的中間體)而合成。谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸接下來由谷氨酸產(chǎn)生。絲氨酸的生物合成為三步，由3-磷酸甘油(糖酵解中間體)開始，在氧化、氨基轉(zhuǎn)移和水解步驟后產(chǎn)生該氨基酸。半胱氨酸和甘氨酸兩者均產(chǎn)生自絲氨酸；具體地，前者通過高半胱氨酸與絲氨酸縮合，后者在絲氨酸轉(zhuǎn)羥甲基酶催化的反應(yīng)中通過側(cè)鏈β-碳原子轉(zhuǎn)移至四氫葉酸上合成。苯丙氨酸和酪氨酸在9步的生物合成途徑中合成自糖酵解和磷酸戊糖途徑的前體赤蘚糖4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸，它們的不同僅在預(yù)苯酸合成后的最后兩步。色氨酸也從這兩種起始分子產(chǎn)生，但其合成為11步的途徑。酪氨酸也可在苯丙氨酸羥化酶催化的反應(yīng)中由苯丙氨酸合成。丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸均為來自丙酮酸鹽(糖酵解的終產(chǎn)物)的生物合成產(chǎn)物。天冬氨酸形成自草酰乙酸(檸檬酸循環(huán)的中間體)。天冬酰胺、甲硫氨酸、蘇氨酸和賴氨酸均通過轉(zhuǎn)化天冬氨酸而形成。異亮氨酸從蘇氨酸形成。組氨酸在一個(gè)復(fù)雜的9步途徑中從一種活化糖——5-磷酸核糖-1-焦磷酸形成。超過細(xì)胞蛋白質(zhì)生物合成所需的量的氨基酸不能被貯藏，并被降解以提供用于細(xì)胞主要代謝途徑的中間體(綜述參見Stryer，L.生物化學(xué)(Biochemistry)第三版，21章，“氨基酸降解和尿素循環(huán)”495-516頁(1988))。雖然細(xì)胞可將不想要的氨基酸轉(zhuǎn)化為有用的代謝中間體，但從所需用于合成氨基酸的能量、前體分子和酶來說，氨基酸的產(chǎn)生是昂貴的。因此對(duì)于氨基酸的生物合成受到反饋抑制調(diào)節(jié)并不讓人吃驚，其中特定氨基酸的存在起到減緩或完全終止其自身產(chǎn)生的作用(關(guān)于氨基酸生物合成途徑中的反饋機(jī)制的綜述參見Stryer，L.生物化學(xué)(Biochemistry)第三版，24章”氨基酸和血紅素的生物合成”575-600頁(1988))。因此，特定氨基酸的輸出受到細(xì)胞中存在的該氨基酸的量的限制。B.維生素、輔因子和營(yíng)養(yǎng)成分的代謝和用途維生素、輔因子和營(yíng)養(yǎng)成分包含高等動(dòng)物不能合成且必須攝取的另一類分子，雖然它們易于被其它生物體如細(xì)菌合成。這些分子自身為生物活性物質(zhì)或?yàn)樵诙喾N代謝途徑中作為電子載體或中間體的生物活性物質(zhì)的前體。除了它們的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外，這些化合物作為著色劑、抗氧化劑和催化劑或其它操作輔助劑也具有重要的工業(yè)價(jià)值(這些化合物的結(jié)構(gòu)、活性和工業(yè)應(yīng)用的概述參見例如，Ullmann工業(yè)化學(xué)百科全書(Ullmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry)，“維生素”A27卷，443-613頁，VCHWeinheim，1996)。術(shù)語”維生素”為本領(lǐng)域認(rèn)知，包括生物體行使正常功能所需的營(yíng)養(yǎng)素，且該生物體自身不能合成它們。維生素組可以包括輔因子和營(yíng)養(yǎng)性化合物。術(shù)語“輔因子”包括進(jìn)行正常酶促活性所需的非蛋白質(zhì)性化合物。此類化合物可為有機(jī)的或無機(jī)的，本發(fā)明的輔因子優(yōu)選有機(jī)的。術(shù)語“營(yíng)養(yǎng)成分”包括促進(jìn)植物和動(dòng)物尤其是人的健康的食物添加劑。此類分子的實(shí)例為維生素、抗氧化劑和某些脂類(如多不飽和脂肪酸)。已大量描述了這些分子在可產(chǎn)生它們的生物體如細(xì)菌中的生物合成(Ullmann工業(yè)化學(xué)百科全書(Ullmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry)，“維生素”A27卷，443-613頁，VCHWeinheim，1996；Michal，G.(1999)生物化學(xué)途徑生物化學(xué)和分子生物學(xué)圖集(BiochemicalPathwaysAnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology)，JohnWiley&Sons；Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)UNESCO/馬來西亞科學(xué)和技術(shù)協(xié)會(huì)和亞州自由基研究協(xié)會(huì)聯(lián)盟舉辦的“營(yíng)養(yǎng)、脂類、健康和疾病“論文集(“Nutrition，Lipids，Health，andDisease”ProceedingsoftheUNESCO/ConfederationofScientificandTechnologicalAssociationsinMalaysia，andtheSocietyforFreeRadicalResearch-Asia)，1994年9月1-3日在馬來西亞檳榔嶼舉行，AOCSPressChampaign，ILX，374S)。硫胺素(維生素B1)由嘧啶和噻唑部分通過化學(xué)偶聯(lián)產(chǎn)生。核黃素(維生素B2)由鳥苷-5’-三磷酸(GTP)和核糖-5’-磷酸合成。核黃素接下來用于合成黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。合起來稱為‘維生素B6’的化合物類(例如，吡哆素、吡哆胺、5’-磷酸吡哆醛和商業(yè)上使用的維生素B6鹽酸鹽)均為共同結(jié)構(gòu)單元5-羥基-6-甲基吡啶的衍生物。泛酸鹽(泛酸(R)-(+)-N-(2，4-二羥基-3，3-二甲基-1-氧代丁基)-β-丙氨酸)可通過化學(xué)合成或發(fā)酵產(chǎn)生。泛酸生物合成的最后步驟由ATP-驅(qū)動(dòng)的β-丙氨酸和泛解酸的縮合組成。負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化為泛解酸和β-丙氨酸及泛酸縮合生物合成步驟的酶是已知的。泛酸鹽的代謝活性形式為輔酶A，其生物合成由5步酶促步驟進(jìn)行。泛酸鹽、5’-磷酸吡哆醛、半胱氨酸和ATP為輔酶A的前體。這些酶不僅催化泛酸鹽的形成，而且催化(R)-泛解酸、(R)-pantolacton、(R)-泛醇(維生素B5原)、泛酰巰基乙胺(及其衍生物)和輔酶A的產(chǎn)生。已詳細(xì)研究了微生物中生物素從前體分子庚二酰輔酶A的生物合成，并鑒定了幾種所涉及的基因。發(fā)現(xiàn)許多相應(yīng)的蛋白質(zhì)也參與Fe-簇合成，屬于蛋白質(zhì)nifS類。硫辛酸衍生自辛酸，并在能量代謝中作為輔酶，此時(shí)其成為丙酮酸脫氫酶復(fù)合體和α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體的一部分。葉酸鹽為一組這樣的物質(zhì)，其均為葉酸衍生物，而葉酸來自于L-谷氨酸、對(duì)氨基苯甲酸和6-甲基蝶呤。已詳細(xì)研究了某些微生物中始于鳥苷-5’-三磷酸(GTP)的生物轉(zhuǎn)化的代謝中間體、L-谷氨酸和對(duì)氨基苯甲酸的葉酸及其衍生物的生物合成。類可啉(如鈷胺素且尤其是維生素B12)和卟啉屬于一組特征在于四吡咯環(huán)體系的化學(xué)品。維生素B12的生物合成太復(fù)雜，目前尚未徹底解釋清楚，但許多涉及的酶和底物現(xiàn)已知。煙酸(煙酸鹽)和煙酰胺為吡啶衍生物，也稱為‘煙酸(niacin)’。煙酸為重要的輔酶NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)和它們的還原形式的前體。這些化合物的工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)基本上依賴于無細(xì)胞的化學(xué)合成，雖然這些化學(xué)品中的一些如核黃素、維生素B6、泛酸鹽和生物素也已通過微生物的大規(guī)模培養(yǎng)物產(chǎn)生。只有維生素B12因?yàn)槠浜铣傻膹?fù)雜性是僅通過發(fā)酵產(chǎn)生的。體外方法需要支出相當(dāng)大量的材料和時(shí)間，并常常代價(jià)很高。C.嘌呤、嘧啶、核苷和核苷酸的代謝和用途嘌呤和嘧啶代謝基因及它們相應(yīng)的蛋白質(zhì)為治療腫瘤和病毒感染的重要靶標(biāo)。術(shù)語“嘌呤”或“嘧啶”包括構(gòu)成核酸、輔酶和核苷酸的含氮堿基。術(shù)語“核苷酸”包括核酸分子的基本結(jié)構(gòu)單元，其包括含氮堿基、戊糖(對(duì)RNA而言，該糖為核糖，對(duì)DNA而言，該糖為D-脫氧核糖)和磷酸。術(shù)語“核苷”包括作為核苷酸前體的分子，但其不含核苷酸所具有的磷酸單元。通過抑制這些分子的生物合成，或抑制它們形成核酸分子的代謝，可抑制RNA和DNA合成；通過以靶向癌細(xì)胞的方式抑制這種活性，可抑制腫瘤細(xì)胞分裂和復(fù)制的能力。此外，有不形成核酸分子但作為能量貯存體(即AMP)或作為輔酶(即FAD和NAD)的核苷酸。一些出版物已描述了這些化學(xué)品在嘌呤和/或嘧啶代謝受到影響的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥中的用途(例如Christopherson，R.I.和Lyons，S.D.(1990)”作為化學(xué)治療劑的嘧啶和嘌呤從頭生物合成的強(qiáng)力抑制劑”醫(yī)學(xué)研究述評(píng)(Med.Res.Reviews)10505-548)。對(duì)參與嘌呤和嘧啶代謝的酶的研究集中在研發(fā)可用作如免疫抑制劑或抗增生劑的新藥上(Smith，J.L.，(1995)”核苷酸合成中的酶”，結(jié)構(gòu)生物學(xué)最新觀點(diǎn)(Curr.Opin.Struct.Biol.)5752-757；(1995)BiochemSoc.Transact.23877-902)。但是，嘌呤和嘧啶堿基、核苷和核苷酸具有其它可能應(yīng)用用作多種精細(xì)化學(xué)品(例如，硫胺素、S-腺苷-甲硫氨酸、葉酸鹽或核黃素)生物合成的中間體，作為細(xì)胞的能量載體(例如，ATP或GTP)，和本身作為化學(xué)品，通常用作增味劑(例如，IMP或GMP)或用于一些醫(yī)藥用途(參見例如，Kuninaka，A.(1996)生物技術(shù)中的核苷酸和相關(guān)化合物(NucleotidesandRelatedCompoundsinBiotechnology)第6卷，Rehm等人編輯。VCHWeinheim，561-612頁)。同樣，參與嘌呤、嘧啶、核苷或核苷酸代謝的酶越來越多地用作靶，研發(fā)用于作物保護(hù)的抗這些酶的化學(xué)品包括殺真菌劑、除草劑和殺蟲劑。已闡釋了這些化合物在細(xì)菌中的代謝(綜述參見例如，核酸研究和分子生物學(xué)進(jìn)展(ProgressinNucleicAcidResearchandMolecularBiology)，第42卷，AcademicPress中的Zalkin，H.和Dixon，J.E.(1992)”嘌呤核苷酸的從頭生物合成”，259-287頁；和生物化學(xué)途徑生物化學(xué)和分子生物學(xué)圖集(BiochemicalPathwaysAnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology)，Wiley紐約一書中的Michal，G.(1999)”核苷酸和核苷”，第8章)。嘌呤代謝已是深入研究的主題，其對(duì)細(xì)胞的正常功能是必需的。高等動(dòng)物中受損的嘌呤代謝可引起嚴(yán)重疾病，如痛風(fēng)。嘌呤核苷酸從核糖-5-磷酸開始，經(jīng)過一系列步驟，通過中間體化合物次黃苷-5’-磷酸(IMP)，產(chǎn)生鳥苷-5’-單磷酸(GMP)或腺苷-5’-單磷酸(AMP)，由此可以容易地形成用作核苷酸的三磷酸形式。這些化合物也用作能量貯存體，這樣它們的降解可為細(xì)胞內(nèi)許多不同生物化學(xué)過程提供能量。嘧啶的生物合成由核糖-5-磷酸形成尿苷-5’-單磷酸(UMP)而進(jìn)行。UMP接下來轉(zhuǎn)化為胞苷-5’-三磷酸(CTP)。所有這些核苷酸的脫氧形式通過一步還原步驟從核苷酸的二磷酸核糖形式產(chǎn)生為核苷酸的二磷酸脫氧核糖形式。通過磷酸化后，這些分子可參與DNA合成。D.海藻糖的代謝和用途海藻糖由兩個(gè)葡萄糖分子通過α、α-1，1鍵連接組成。它通常作為甜味劑用于食品工業(yè)，或作為干的或冷凍食品和飲料中的添加劑。但它也用于藥學(xué)、化妝品和生物技術(shù)工業(yè)(參見例如，Nishimoto等人(1998)美國專利號(hào)5,759,610；Singer，M.A.和Lindquist，S.生物技術(shù)趨勢(shì)(TrendsBiotech.)16(1998)460-467；Paiva，C.L.A.和Panek，A.D.Biotech.Ann.Rev.2(1996)293-314；和Shiosaka，M.J.Japan172(1997)97-102)。海藻糖可以通過許多微生物的酶產(chǎn)生，并天然釋放入環(huán)境介質(zhì)中，從中可用本領(lǐng)域公知的方法收集海藻糖。II.本發(fā)明的元素和方法本發(fā)明至少部分是基于新分子的發(fā)現(xiàn)，它們?cè)诒疚闹斜环Q作G6PD核酸分子和G6PD蛋白分子，并且它們參與攝取富含能量的碳分子(例如葡萄糖、蔗糖和果糖)到谷氨酸棒狀桿菌中，并且還可能參與該微生物中一種或多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在一個(gè)實(shí)施方案中，G6PD分子將富含能量的碳分子輸入到細(xì)胞中，在細(xì)胞中這些分子降解產(chǎn)生的能量被用于驅(qū)動(dòng)能量上較不利的生化反應(yīng)。它們的降解產(chǎn)物可被用作許多其他代謝途徑的中間體或前體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，G6PD分子可參與一種或多種胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并且修飾形式的G6PD分子(例如磷酸化的G6PD蛋白)可參與調(diào)節(jié)一種或多種細(xì)胞過程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的G6PD分子的活性影響所述生物對(duì)目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品的生產(chǎn)。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的G6PD分子的活性受到調(diào)節(jié)，從而谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)一種或多種精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)率、產(chǎn)量或生產(chǎn)效率也受到調(diào)節(jié)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的G6PD分子能夠調(diào)節(jié)微生物如谷氨酸棒狀桿菌中目標(biāo)分子如精細(xì)化學(xué)品的生產(chǎn)。在基因重組技術(shù)的幫助下，可以操作一種或多種本發(fā)明的G6PD蛋白使它們的功能受到調(diào)節(jié)。例如，可以修飾參與G6PD介導(dǎo)的葡萄糖輸入的蛋白使其具有最佳活性，從而用于輸入葡萄糖的G6PD系統(tǒng)能夠運(yùn)輸更大量的葡萄糖到細(xì)胞中。葡萄糖不僅被用作能量上不利的生化反應(yīng)(如精細(xì)化學(xué)品的生物合成)的能源，而且被用作許多精細(xì)化學(xué)品的生物合成途徑中的前體和中間體(例如，絲氨酸從3-磷酸甘油酸合成)。總之，通過增加可用于目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品生產(chǎn)的能量或者通過增加所述生產(chǎn)所需的化合物的可用量，可以增加這些目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品的任何一種的總產(chǎn)率或生產(chǎn)速率。制備本發(fā)明的核酸序列的一個(gè)適宜的起點(diǎn)是谷氨酸棒狀桿菌菌株的基因組，該菌株可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得，其保藏號(hào)是ATCC13032。可以使用常用方法通過表1中所示的修飾從這些核酸序列制備本發(fā)明的核酸序列。本發(fā)明的G6PD蛋白或其生物學(xué)活性部分或片段可以參與運(yùn)輸富含能量的含碳分子如葡萄糖到谷氨酸棒狀桿菌中或者參與該微生物中胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，或者它們可以具有表1中列出的一種或多種活性。下面的小章節(jié)更詳細(xì)地描述了本發(fā)明的各個(gè)方面A.分離的核酸分子本發(fā)明的一個(gè)方面涉及編碼G6PD多肽或其生物活性部分的分離核酸分子及核酸分子片段，其中所述核酸分子片段足以用作雜交探針或引物，用來鑒定或擴(kuò)增編碼G6PD的核酸(例如G6PDDNA)。如此處所用，術(shù)語“核酸分子”是指包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)和用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA類似物。該術(shù)語也包括位于基因編碼區(qū)3’和5’端的非翻譯區(qū)基因編碼區(qū)5’端上游的至少約100個(gè)核苷酸的序列和基因編碼區(qū)3’端下游的至少約20個(gè)核苷酸的序列。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但優(yōu)選地為雙鏈DNA。“分離的”核酸分子為從存在于此核酸的天然源中的其它核酸分子中取出的核酸分子。優(yōu)選地，“分離的”核酸不具有在該核酸所來自的生物體基因組DNA中天然存在于該核酸側(cè)翼的序列(例如，位于該核酸5’或3’端的序列)。例如，在不同實(shí)施方案中，該分離的G6PD核酸分子可包含少于約5kb，4kb，3kb，2kb，1kb，0.5kb或0.1kb在該核酸所來自的細(xì)胞(如谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞)基因組DNA中天然存在于該核酸分子側(cè)翼的核苷酸序列。而且，“分離的”核酸分子如cDNA分子當(dāng)通過重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)可基本上不含有其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，當(dāng)通過化學(xué)合成產(chǎn)生時(shí)，可基本上不含有化學(xué)前體或其它化學(xué)品。本發(fā)明的核酸分子，如具有集合A的核苷酸序列的核酸分子或其部分可用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)和本文提供的序列信息制備。例如，使用集合A的完整或部分序列作為雜交探針和標(biāo)準(zhǔn)的雜交技術(shù)(例如，在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.和Maniatis，T.分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularCloningALaboratoryManual).第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989中所述)，可自谷氨酸棒狀桿菌文庫分離谷氨酸棒狀桿菌G6PDDNA。而且，包含集合A的完整序列或其部分的核酸分子可使用根據(jù)該序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)分離(例如，包含集合A的完整或部分序列的核酸分子可使用根據(jù)該同樣序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)分離)。例如，可從正常的內(nèi)皮細(xì)胞分離mRNA(例如，通過Chirgwin等人(1979)生物化學(xué)(Biochemistry)185294-5299的硫氰酸胍提取法)并用反轉(zhuǎn)錄酶(例如，莫洛尼鼠類白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶，可從Gibco/BRL，Bethesda，MD獲得；或AMV反轉(zhuǎn)錄酶，可從SeikagakuAmerica，Inc.，St.Petersburg，F(xiàn)L獲得)制備cDNA。用于聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的合成寡核苷酸引物可根據(jù)集合A所述的核苷酸序列之一設(shè)計(jì)。本發(fā)明的核酸可用cDNA或用基因組DNA作為模板、使用合適的寡核苷酸引物按照標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)來擴(kuò)增。這樣擴(kuò)增的核酸可克隆入合適的載體并通過DNA序列分析鑒定。對(duì)應(yīng)于G6PD核苷酸序列的寡核苷酸可通過標(biāo)準(zhǔn)的合成技術(shù)制備，例如用DNA自動(dòng)合成儀制備。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離核酸分子包含集合A中所示的核苷酸序列之一。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子含有與集合A中所示核酸序列之任一互補(bǔ)的核酸分子或其部分，所述核酸分子與集合A中所示核酸序列之任一足夠互補(bǔ)以致其與集合A中所示序列之一能雜交而得到穩(wěn)定雙鏈體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子編碼這樣的蛋白質(zhì)或其部分，其包括的氨基酸序列充分同源于集合B的一個(gè)氨基酸序列，以至于該蛋白質(zhì)或其部分仍然能夠參與運(yùn)輸富含能量的碳分子(如葡萄糖)到谷氨酸棒狀桿菌中和參與一種或多種胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。如此處所用，術(shù)語“充分同源”是指蛋白質(zhì)或其部分所具有的氨基酸序列包括最小數(shù)目的與集合B的氨基酸序列相同或等同的氨基酸殘基(例如，氨基酸殘基具有與集合B中序列之一的氨基酸殘基相似的側(cè)鏈)，以至于該蛋白質(zhì)或其部分能夠運(yùn)輸富含能量的碳分子(如葡萄糖)到谷氨酸棒狀桿菌中和參與該微生物中的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。如此處所述，這些代謝途徑的蛋白組分運(yùn)輸富含能量的碳分子(如葡萄糖)到谷氨酸棒狀桿菌中并可能參與該微生物中的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此類活性的實(shí)例也在此進(jìn)行了描述。因此，“G6PD蛋白的功能”涉及到一種或多種基于磷酸烯醇丙酮酸的糖運(yùn)輸途徑的整個(gè)運(yùn)行和/或調(diào)節(jié)。G6PD蛋白活性的實(shí)例在表1中給出。本發(fā)明G6PD核酸分子編碼的蛋白的部分優(yōu)選是任何G6PD蛋白的具生物學(xué)活性的部分。文中所用術(shù)語“G6PD蛋白的生物學(xué)活性部分”包括G6PD蛋白的一部分，例如結(jié)構(gòu)域或基元，其能夠運(yùn)輸富含能量的含碳分子如葡萄糖到谷氨酸棒狀桿菌中或者能夠參與該微生物中細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或者具有表1中所示活性。為了確定G6PD蛋白或者其生物學(xué)活性部分能否參與運(yùn)輸富含能量的含碳分子如葡萄糖到谷氨酸棒狀桿菌中或者能夠參與該微生物中細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以進(jìn)行酶活性分析。這些分析方法在實(shí)施例部分的實(shí)施例8中詳細(xì)描述，且技術(shù)人員熟知這些方法。除了群體中可能存在的G6PD序列的天然變體外，技術(shù)人員還理解可通過突變向集合A的核苷酸序列中導(dǎo)入變化，由此導(dǎo)致所編碼的G6PD蛋白的氨基酸序列改變，但不損害G6PD蛋白的功能。例如，可在集合A的核苷酸序列中進(jìn)行在“非必需”氨基酸殘基處導(dǎo)致氨基酸替換的核苷酸替換?！胺潜匦琛卑被釟埢侨我粋€(gè)G6PD蛋白野生型序列(集合B)中可被修飾而不改變所述G6PD蛋白的活性的殘基，但“必需”氨基酸殘基為G6PD蛋白活性所需。然而，其它氨基酸殘基(例如，在具有G6PD活性的結(jié)構(gòu)域中不保守或僅為半保守的那些氨基酸殘基)對(duì)活性可能為非必需的，并因此可能被改變而不導(dǎo)致G6PD活性的改變。編碼同源于集合B的蛋白質(zhì)序列的G6PD蛋白的分離核酸分子可通過將一個(gè)或多個(gè)核苷酸替換、添加或缺失導(dǎo)入集合A的核苷酸序列中以使一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、添加或缺失導(dǎo)入所編碼的蛋白質(zhì)中而產(chǎn)生?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將突變導(dǎo)入集合A的核苷酸序列之一，如定點(diǎn)誘變和PCR-介導(dǎo)的誘變。優(yōu)選地，在一處或多處預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基處進(jìn)行保守氨基酸替換?！氨Ｊ匕被崽鎿Q”為將氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已在本領(lǐng)域定義過。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳族側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，優(yōu)選地在G6PD蛋白中預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基用來自同一側(cè)鏈家族的另一氨基酸殘基替換?；蛘?，在另一實(shí)施方案中，可通過如飽和誘變沿著全部或部分G6PD編碼序列隨機(jī)導(dǎo)入突變，并根據(jù)文中所述的G6PD活性對(duì)所得突變體進(jìn)行篩選，以鑒定保留G6PD活性的突變體。對(duì)集合A序列之任一誘變后，可重組表達(dá)編碼蛋白，并用例如文中所述的試驗(yàn)(參見實(shí)施例部分的實(shí)施例8)確定所述蛋白質(zhì)的活性。B.重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明的另一方面涉及包含編碼G6PD蛋白(或其部分)的核酸的載體，優(yōu)選表達(dá)載體。如此處所用，術(shù)語”載體”是指這樣的核酸分子，其可轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的另一核酸。一種類型的載體為”質(zhì)?！保侵钙渲锌蛇B接額外DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體為病毒載體，其中可將額外DNA片段連接入病毒基因組。某些載體可在它們所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和游離型哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如，非游離型哺乳動(dòng)物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后整合入宿主細(xì)胞的基因組，并因此隨著宿主基因組而復(fù)制。而且，某些載體可指導(dǎo)與它們操作性連接的基因的表達(dá)。此類載體此處稱為”表達(dá)載體”。一般，用于重組DNA技術(shù)中的表達(dá)載體為質(zhì)粒形式。在本說明書中，”質(zhì)粒”和”載體”可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最經(jīng)常使用的載體形式。但是，本發(fā)明旨在包括其它形式的表達(dá)載體，如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)，它們起到類似的作用。本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含以適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的形式存在的本發(fā)明的核酸，這就是說重組表達(dá)載體包括一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列，這些調(diào)節(jié)序列基于表達(dá)所用的宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇并功能性地與待表達(dá)的核酸序列連接。在重組表達(dá)載體中，術(shù)語“功能性連接”是指目的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列以允許該核苷酸序列表達(dá)(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，或當(dāng)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)在宿主細(xì)胞中表達(dá))的方式連接。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”旨在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)調(diào)控元件(例如，多聚腺苷酸化信號(hào))。此類調(diào)節(jié)序列如在Goeddel；基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology)185，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)中描述。調(diào)節(jié)序列包括控制核苷酸序列在許多類型宿主細(xì)胞中組成型表達(dá)的調(diào)節(jié)序列和控制核苷酸序列僅在特定宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可取決于如對(duì)欲轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇、所需的蛋白質(zhì)表達(dá)程度等因素。本發(fā)明的表達(dá)載體可導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生由此處所述核酸所編碼的蛋白質(zhì)或肽，包括融合蛋白或融合肽(例如，G6PD蛋白、G6PD蛋白的突變形式、融合蛋白等)。本發(fā)明的重組表達(dá)載體可設(shè)計(jì)用于在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)G6PD蛋白。例如，G6PD基因可在細(xì)菌細(xì)胞如谷氨酸棒狀桿菌、昆蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞和其它真菌細(xì)胞(參見Romanos，M.A.等人(1992)“在酵母中外源基因的表達(dá)綜述”(”ForeigngeneExpressioninyeastareview”)，酵母(Yeast)8423-488；J.W.Bennet&L.L.Lasure編輯的《更多的用于真菌的基因操作》(MoreGeneManipulationsinFungi)，AcademicPressSanDiego一書中的vandenHondel，C.A.M.J.J.等人(1991)“絲狀真菌中的異源基因表達(dá)”(”HeterologousgeneExpressioninfilamentousfungi”)，396-428頁；以及Peberdy，J.F.等人編輯的《真菌的應(yīng)用分子遺傳學(xué)》(AppliedMolecularGeneticsofFungi)，CambridgeUniversityPressCambridge一書中的vandenHondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.(1991)“絲狀真菌的基因轉(zhuǎn)移體系和載體開發(fā)”(”Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi)，1-28頁)、藻類和單細(xì)胞植物細(xì)胞(參見Schmidt，R.和Willmitzer，L.(1988)，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥葉和子葉外植體的高效轉(zhuǎn)化，植物細(xì)胞報(bào)道(PlantCellRep.)583-586)、或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。合適的宿主細(xì)胞在Goeddel，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology)185，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)中進(jìn)一步進(jìn)行了討論。另外，可體外轉(zhuǎn)錄并翻譯重組表達(dá)載體，如使用T7啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶。在原核生物中蛋白質(zhì)的表達(dá)主要用含有組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體進(jìn)行，以控制融合或非融合蛋白的表達(dá)。融合載體將一些氨基酸添加至其中編碼的蛋白質(zhì)上，通常添加至重組蛋白的氨基末端。此類融合載體一般具有三個(gè)任務(wù)1)用于增強(qiáng)重組蛋白的表達(dá)；2)用于增加重組蛋白的溶解性；和3)在親和層析中作為配體而利于重組蛋白的純化。通常，于融合單元和重組蛋白的連接處導(dǎo)入蛋白酶剪切位點(diǎn)到融合表達(dá)載體中，這使得在該融合蛋白純化后，可將重組蛋白與融合單元分離。這些酶和它們的對(duì)應(yīng)識(shí)別序列包括Xa因子、凝血酶和腸激酶。通常的融合表達(dá)載體包括pGEX(PharmaciaBiotechInc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)基因(Gene)6731-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它們分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白和蛋白A融合至重組靶蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，將G6PD蛋白的編碼序列克隆入pGEX表達(dá)載體，以產(chǎn)生編碼融合蛋白的載體，該蛋白從N-末端至C-末端包含GST-凝血酶切割位點(diǎn)-X蛋白。該融合蛋白可以使用谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂通過親和層析純化。通過將該融合蛋白用凝血酶切割可得到不與GST融合的重組G6PD蛋白。合適的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌表達(dá)載體的實(shí)例包括pTrc(Amann等人(1988)基因(Gene)69301-315)和pET11d(Studier等人，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology)185，AcademicPress，SanDiego，California(1990)60-89)。pTrc載體中目標(biāo)基因的表達(dá)依賴于宿主RNA聚合酶從雜合的trp-lac融合啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。pET11d載體中目標(biāo)基因的表達(dá)依賴于共表達(dá)的病毒RNA聚合酶(T7gn1)介導(dǎo)的從T7-gn10-lac融合啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。該病毒聚合酶可以由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)中居住的、具有位于lacUV5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的T7gn1基因的λ原噬菌體提供。最大化重組蛋白表達(dá)的一個(gè)策略是將該蛋白質(zhì)在對(duì)所述重組蛋白進(jìn)行蛋白酶切割的能力被破壞的宿主細(xì)菌中表達(dá)(Gottesman，S.，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology)185，AcademicPress，SanDiego，California(1990)119-128)。另一策略是改變欲插入表達(dá)載體的核酸的核酸序列，以使編碼每一氨基酸的各密碼子為選擇用于表達(dá)的細(xì)菌如谷氨酸棒狀桿菌所優(yōu)選使用的密碼子(Wada等人(1992)核酸研究(NucleicAcidsRes.)202111-2118)。本發(fā)明核酸序列的此改變可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的DNA合成技術(shù)實(shí)施。在另一實(shí)施方案中，G6PD蛋白表達(dá)載體為酵母表達(dá)載體。用于在釀酒酵母中表達(dá)的載體包括pYepSec1(Baldari，等人(1987)EmboJ.6229-234)，pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)細(xì)胞(Cell)30933-943)，pJRY88(Schultz等人(1987)基因(Gene)54113-123)，和pYES2(InvitrogenCorporation，SanDiego，CA)。適用于其它真菌如絲狀真菌的載體和用于構(gòu)建載體的方法包括在J.F.Peberdy等人編輯的《真菌的應(yīng)用分子遺傳學(xué)》(AppliedMolecularGeneticsofFungi)，CambridgeUniversityPressCambridge一書中的vandenHondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.(1991)“絲狀真菌的基因轉(zhuǎn)移體系和載體開發(fā)”(”Genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi)，1-28頁中詳述的那些。作為另一可選擇方案，本發(fā)明的G6PD蛋白可使用桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。可用于在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(例如Sf9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等人(1983)Mol.CellBiol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)病毒學(xué)(Virology)17031-39)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的G6PD蛋白可在單細(xì)胞植物細(xì)胞(如藻類)或在來自高等植物(如種子植物，諸如作物)的植物細(xì)胞中表達(dá)。植物表達(dá)載體的實(shí)例包括在Becker，D.，KemPer，E.，Schell，J.和Masterson，R.(1992)“具有靠近左邊界的選擇性標(biāo)記的新植物雙元載體(”Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder”)，植物分子生物學(xué)(PlantMol.Biol.)201195-1197；和Bevan，M.W.(1984)“用于植物轉(zhuǎn)化的雙元農(nóng)桿菌載體”(”BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation”)，核酸研究(Nucl.Acid.Res.)128711-8721中詳述的那些。又在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的實(shí)例包括pCDM8(Seed，B.(1987)自然(Nature)329840)和pMT2PC(Kaufman等人(1987)EMBOJ.6187-195)。當(dāng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，表達(dá)載體的調(diào)控功能通常由病毒調(diào)控元件提供。例如，常用的啟動(dòng)子來自多瘤病毒、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和猿猴病毒40。用于原核和真核細(xì)胞的其它合適表達(dá)系統(tǒng)參見Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.和Maniatis，T.分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularCloningALaboratoryManual)，第二版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989中的第16和17章。在另一實(shí)施方案中，重組哺乳動(dòng)物表達(dá)載體優(yōu)選地可以指導(dǎo)核酸在特定細(xì)胞類型中表達(dá)(例如，使用組織-特異性調(diào)控元件來表達(dá)核酸)。組織-特異性調(diào)控元件為本領(lǐng)域公知。合適的組織-特異性啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括白蛋白啟動(dòng)子(肝特異性；Pinkert等人(1987)基因進(jìn)展(GenesDev.)1268-277)、淋巴特異性啟動(dòng)子(CalameandEaton(1988)Adv.Immunol.43235-275)，特別是T細(xì)胞受體啟動(dòng)子(Winoto和Baltimore(1989)EMBOJ.8729-733)和免疫球蛋白啟動(dòng)子(Banerji等人(1983)細(xì)胞(Cell)33729-740；Queen和Baltimore(1983)細(xì)胞(Cell)33741-748)、神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子(例如，神經(jīng)絲啟動(dòng)子；Byrne和Ruddle(1989)PNAS865473-5477)、胰特異性啟動(dòng)子(Edlund等人(1985)科學(xué)(Science)230912-916)、以及乳腺特異性啟動(dòng)子(例如，milkserum啟動(dòng)子；美國專利號(hào)4,873,316和歐洲專利申請(qǐng)文件號(hào)264,166)。此外，還包括發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，如鼠hox啟動(dòng)子(Kessel和Gruss(1990)科學(xué)(Science)249374-379)和甲胎蛋白啟動(dòng)子(Campes和Tilghman(1989)基因進(jìn)展(GenesDev.)3537-546)。本發(fā)明還提供了含本發(fā)明的DNA分子的重組表達(dá)載體，其中該DNA分子以反義方向克隆在表達(dá)載體中。也就是，DNA分子功能性連接到調(diào)控序列上，該連接方式使得可以表達(dá)(通過轉(zhuǎn)錄該DNA分子)產(chǎn)生與G6PDmRNA反義的RNA分子?？梢詫?duì)功能性連接反義方向克隆的核酸的調(diào)控序列進(jìn)行選擇以控制反義RNA分子在多種細(xì)胞類型中持續(xù)表達(dá)，例如，可選擇病毒啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子或調(diào)控序列以控制反義RNA實(shí)現(xiàn)組成型組織特異性或細(xì)胞類型特異性表達(dá)。反義表達(dá)載體的形式可為重組質(zhì)粒、噬菌?；驕p毒病毒，其中在高效調(diào)控區(qū)域的控制下產(chǎn)生反義核酸，而所述調(diào)控區(qū)域的活性由載體所導(dǎo)入的細(xì)胞的類型決定。關(guān)于利用反義基因?qū)嵤┗虮磉_(dá)調(diào)控的討論見Weintraub，H.等人，反義RNA作為遺傳分析的分子工具，Reviews-TrendsinGenetics，Vol.1(1)1986。本發(fā)明的另一方面涉及已導(dǎo)入本發(fā)明重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”在此處可互換使用。當(dāng)然，該術(shù)語不僅指特定的靶細(xì)胞，也指該細(xì)胞的后代或潛在后代。由于突變或環(huán)境因素細(xì)胞在傳代過程中可發(fā)生某些改變，這樣，后代實(shí)際上可能并不一定與親代細(xì)胞相同，但其仍包括在此處所用術(shù)語的范圍之內(nèi)。宿主細(xì)胞可為原核或真核細(xì)胞。例如，G6PD蛋白可在細(xì)菌細(xì)胞如谷氨酸棒狀桿菌、昆蟲細(xì)胞、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或COS細(xì)胞)中表達(dá)。其他合適的宿主細(xì)胞為技術(shù)人員公知。與谷氨酸棒狀桿菌有關(guān)的、可以以適宜方式用作本發(fā)明核酸和蛋白質(zhì)分子的宿主細(xì)胞的微生物如表3所示。載體DNA可通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞中。如此處所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”意指本領(lǐng)域內(nèi)公知的各種將外源核酸(例如DNA)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染或電穿孔。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法可在Sambrook等人(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularCloningALaboratoryManual).第二版，ColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989)和其它的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中找到。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，已知根據(jù)所用的表達(dá)載體和所用的轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅一小部分的細(xì)胞可將外源DNA整合到基因組中。一般將編碼選擇標(biāo)記的基因(如抗生素抗性基因)與目的基因一同導(dǎo)入宿主細(xì)胞以鑒定和篩選整合體。優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括那些可賦予藥物抗性的基因，所述藥物如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。編碼選擇標(biāo)記的核酸可與編碼G6PD蛋白質(zhì)的基因位于同一載體上被導(dǎo)入宿主細(xì)胞或可以位于不同的載體上導(dǎo)入。被導(dǎo)入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可通過藥物篩選進(jìn)行鑒定(例如，摻入了選擇標(biāo)志基因的細(xì)胞將存活，而其他細(xì)胞死亡)。通過制備出含至少部分G6PD基因的載體——所述部分G6PD基因中已經(jīng)導(dǎo)入缺失、添加或替代因而可以改變G6PD基因(如功能性破壞)——可以生成同源重組微生物。優(yōu)選地該G6PD基因?yàn)楣劝彼岚魻顥U菌G6PD基因，但也可為來自相關(guān)細(xì)菌或甚至來自哺乳動(dòng)物、酵母或昆蟲的同系物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體設(shè)計(jì)為在同源重組后可功能性破壞內(nèi)源G6PD基因(即，該基因不再編碼功能蛋白質(zhì)；也稱為“敲除”載體)。另外，載體可設(shè)計(jì)為在同源重組后使內(nèi)源G6PD基因發(fā)生突變或改變但仍編碼功能蛋白質(zhì)(例如，可改變上游調(diào)控區(qū)域由此改變內(nèi)源G6PD蛋白的表達(dá))。在此同源重組載體中，改變的G6PD基因部分在其5′和3′端側(cè)翼為G6PD基因的其它核酸，從而使得載體所攜帶的外源G6PD基因和微生物中的內(nèi)源G6PD基因之間可以發(fā)生同源重組。此額外的兩翼G6PD核酸的長(zhǎng)度應(yīng)足以使與內(nèi)源基因的同源重組成功進(jìn)行。通常，載體內(nèi)包括幾千堿基的側(cè)翼DNA(5′及3′端)(參見例如，Thomas，K.R.，和Capecchi，M.R.(1987)細(xì)胞(Cell)51503中對(duì)同源重組載體的描述)。使用本領(lǐng)域公知的方法，將該載體導(dǎo)入微生物(例如，通過電穿孔)，并篩選內(nèi)源G6PD基因已與導(dǎo)入的G6PD基因同源重組的細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，產(chǎn)生的重組微生物含有可調(diào)控導(dǎo)入的基因的表達(dá)的選定系統(tǒng)。例如，將G6PD基因插入載體中位于乳糖操縱子的控制下，可以使G6PD基因僅在存在IPTG時(shí)表達(dá)。此類調(diào)控系統(tǒng)為本領(lǐng)域熟知。本發(fā)明的宿主細(xì)胞如培養(yǎng)的原核或真核宿主細(xì)胞可用于產(chǎn)生(即表達(dá))G6PD蛋白。因此，本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞來產(chǎn)生G6PD蛋白的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(其中已導(dǎo)入了編碼G6PD蛋白的重組表達(dá)載體，或其基因組中已導(dǎo)入了編碼野生型或改變的G6PD蛋白的基因)，直至產(chǎn)生G6PD蛋白。在另一實(shí)施方案中，該方法還包括從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞分離G6PD蛋白。C.本發(fā)明的用途和方法文中所述的核酸分子、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)同系物、融合蛋白、引物、載體和宿主細(xì)胞可用于下述一種或多種方法中鑒定谷氨酸棒狀桿菌及相關(guān)生物體；繪制與谷氨酸棒狀桿菌相關(guān)的生物體的基因組圖譜；鑒定并定位目標(biāo)谷氨酸棒狀桿菌序列；進(jìn)化研究；確定G6PD蛋白的功能和活性調(diào)節(jié)所需的G6PD蛋白區(qū)域；調(diào)節(jié)G6PD途徑的活性；調(diào)節(jié)目標(biāo)化合物如精細(xì)化學(xué)品的細(xì)胞生產(chǎn)。本發(fā)明的G6PD核酸分子具有多種用途。首先，它們可用于鑒定生物體是否為谷氨酸棒狀桿菌或其近親。它們也可用于在混合的微生物群體中鑒定谷氨酸棒狀桿菌或其相關(guān)菌。本發(fā)明提供了許多谷氨酸棒狀桿菌基因的核酸序列。通過將從微生物單一群體或混合群體的培養(yǎng)物提取的基因組DNA在嚴(yán)格條件下用包含對(duì)谷氨酸棒狀桿菌而言獨(dú)特的谷氨酸棒狀桿菌基因區(qū)域的探針來探測(cè)，可確定該生物體是否存在。雖然谷氨酸棒狀桿菌自身為非致病的，但它與致病種如白喉棒狀桿菌有親緣關(guān)系。這種生物體的檢測(cè)具有實(shí)質(zhì)上的臨床重要性。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)分子也可用作基因組特定區(qū)域的標(biāo)記。這不僅可用于繪制基因組圖譜，也可用于谷氨酸棒狀桿菌蛋白質(zhì)的功能研究。例如，可切割谷氨酸棒狀桿菌基因組，并將片段與DNA-結(jié)合蛋白孵育來確定與特定的谷氨酸棒狀桿菌DNA-結(jié)合蛋白結(jié)合的基因組區(qū)域。另外，那些結(jié)合蛋白的片段可用本發(fā)明的核酸分子探測(cè)，優(yōu)選地用具有易于檢測(cè)的標(biāo)記物實(shí)施探測(cè)；此核酸分子與基因組片段的結(jié)合可將片段定位于谷氨酸棒狀桿菌的基因組圖譜中，并且當(dāng)用不同的酶重復(fù)此過程幾次時(shí)，將有利于快速確定蛋白質(zhì)結(jié)合的核酸序列。而且，本發(fā)明的核酸分子充分同源于親緣種的序列，這樣這些核酸分子可用作在親緣菌如乳糖發(fā)酵短桿菌(BrevibacteriumLactofermentum)中構(gòu)建基因組圖譜的標(biāo)記。本發(fā)明的G6PD核酸分子也適用于進(jìn)化研究和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究。許多細(xì)胞應(yīng)用本發(fā)明分子參與的糖攝取系統(tǒng)；通過將本發(fā)明核酸分子的序列與那些來自其它生物體的編碼類似酶的序列比較，可確定所述生物體的進(jìn)化關(guān)系。由此，此比較使得可確定哪些區(qū)域保守和哪些區(qū)域不保守，這有利于確定那些對(duì)酶功能所必需的蛋白質(zhì)區(qū)域。這種確定對(duì)蛋白質(zhì)工程研究有價(jià)值，并可指出蛋白質(zhì)可耐受哪種誘變且不丟失其功能。對(duì)本發(fā)明G6PD核酸分子的操作可導(dǎo)致產(chǎn)生與野生型G6PD蛋白功能不同的G6PD蛋白。這些蛋白質(zhì)可在功效或活性上提高，可以在細(xì)胞內(nèi)以比通常多的量存在，或可以在功效或活性上降低。操作本發(fā)明的G6PD核酸分子可以使一種或多種精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或生產(chǎn)效率得到提高。通過修飾參與葡萄糖攝取的G6PD蛋白使其具有最佳活性，可以增加葡萄糖攝入程度或者葡萄糖被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的速度。細(xì)胞中葡萄糖和其他糖降解提供的能量可被用于驅(qū)動(dòng)能量上不利的生化反應(yīng)(如那些參與精細(xì)化學(xué)品生物合成的生化反應(yīng))。所述降解同樣為特定精細(xì)化學(xué)品如氨基酸、維生素和輔因子的生物合成提供了中間體和前體。所以，通過修飾本發(fā)明的G6PD分子而增加胞內(nèi)富含能量的碳分子的量，可以增加能用于代謝途徑——生產(chǎn)一種或多種精細(xì)化學(xué)品時(shí)所需的代謝途徑——中的能量，而且還可以增加所述生產(chǎn)所需的代謝物的胞內(nèi)庫。相反地，通過降低糖的輸入——該糖的降解產(chǎn)物包括僅僅在與產(chǎn)生目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品的代謝途徑競(jìng)爭(zhēng)酶、輔因子或中間體的代謝途徑中使用的化合物，則有可能下調(diào)所述代謝途徑，從而可能增加目標(biāo)生物合成途徑的產(chǎn)量。本發(fā)明的G6PD分子可參與影響谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)一種或多種精細(xì)化學(xué)品的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)速率的一種或多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。例如，從細(xì)胞外介質(zhì)輸入一種或多種糖時(shí)所需的蛋白(例如HPr、酶I或酶II復(fù)合體的成分)在細(xì)胞中存在足量所述糖時(shí)經(jīng)常被翻譯后修飾，以至于它們不再能夠輸入所述糖。一個(gè)例子見于大腸桿菌，其中高的胞內(nèi)果糖1，6-二磷酸水平導(dǎo)致Hpr在絲氨酸46位磷酸化，此后所述分子不再能夠參與糖的運(yùn)輸。雖然運(yùn)輸系統(tǒng)關(guān)閉時(shí)的胞內(nèi)糖水平可能足夠保持正常細(xì)胞功能，但是其將限制目標(biāo)精細(xì)化學(xué)品的過量生產(chǎn)。所以，需要修飾本發(fā)明的G6PD蛋白使得它們不再對(duì)這種負(fù)調(diào)節(jié)敏感。結(jié)果，可以得到一種或多種糖的更高的胞內(nèi)濃度，并延及到含有這些突變G6PD蛋白的生物生產(chǎn)一種或多種精細(xì)化學(xué)品時(shí)更有效率或產(chǎn)率更高。這些上面提到的突變G6PD蛋白以增加目標(biāo)化合物的產(chǎn)率的策略并不旨在限制；這些突變策略的變通方案對(duì)技術(shù)人員是相當(dāng)明顯的。這些機(jī)制使得可以使用本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生表達(dá)突變的G6PD核酸和蛋白質(zhì)分子的谷氨酸棒狀桿菌或者相關(guān)細(xì)菌菌株，從而提高目標(biāo)化合物的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或生產(chǎn)效率。目標(biāo)化合物可以是谷氨酸棒狀桿菌的產(chǎn)物，包括生物合成途徑的終產(chǎn)物和天然代謝途徑的中間產(chǎn)物以及非天然存在于谷氨酸棒狀桿菌代謝中的但是被本發(fā)明谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)的分子。對(duì)本發(fā)明通過如下實(shí)施例進(jìn)一步闡述，但不應(yīng)將下面的實(shí)施例理解為限制性的。在本專利申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)、專利申請(qǐng)、專利、公開的專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容特此引用作為參考。實(shí)施例實(shí)施例1谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032的總基因組DNA的制備谷氨酸棒狀桿菌(ATCC13032)的培養(yǎng)物在30℃于BHI培養(yǎng)基(Difco)中劇烈振搖過夜。離心收獲細(xì)胞，棄上清并將細(xì)胞重懸于5ml緩沖液-I(培養(yǎng)物原初體積的5％—所有顯示的體積為按100ml培養(yǎng)物體積計(jì)算所得)。緩沖液-I的組成140.34g/l蔗糖，2.46g/lMgSO4·7H2O，10ml/lKH2PO4溶液(100g/l，用KOH調(diào)節(jié)至pH6.7)，50ml/lM12濃縮物(10g/l(NH4)2SO4，1g/lNaCl，2g/lMgSO4·7H2O，0.2g/lCaCl2，0.5g/l酵母提取物(Difco)，10ml/l痕量元素混合物(200mg/lFeSO4·H2O，10mg/lZnSO4·7H2O，3mg/lMnCl2·4H2O，30mg/lH3BO3，20mg/lCoCl2·6H2O，1mg/lNiCl2·6H2O，3mg/lNa2MoO4·2H2O，500mg/l絡(luò)合劑(EDTA或檸檬酸)，100ml/l維生素-混合物(0.2mg/l生物素，0.2mg/l葉酸，20mg/l對(duì)氨基苯甲酸，20mg/l核黃素，40mg/l泛酸鈣，140mg/l煙酸，40mg/l維生素B6鹽酸鹽，200mg/l肌醇)。向懸液中加入溶菌酶至終濃度2.5mg/ml。在37℃孵育約4小時(shí)后，細(xì)胞壁降解，離心收獲所得的原生質(zhì)體。沉淀用5ml緩沖液-I洗一次并用5mlTE-緩沖液(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8)洗一次。將沉淀重懸于4mlTE-緩沖液，并加入0.5mlSDS溶液(10％)和0.5mlNaCl溶液(5M)。加入蛋白酶K至終濃度200μg/ml后，將懸液在37℃孵育約18小時(shí)。使用標(biāo)準(zhǔn)方法用酚、酚/氯仿/異戊醇和氯仿/異戊醇提取而純化DNA。然后，加入1/50體積的3M醋酸鈉和2體積的乙醇，于-20℃孵育30分鐘，并在高速離心機(jī)上使用SS34轉(zhuǎn)子(Sorvall)于12,000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，沉淀DNA。將該DNA溶于含20μg/mlRNaseA的1mlTE-緩沖液中，并用1000mlTE-緩沖液于4℃透析至少3小時(shí)。在此期間，更換緩沖液3次。向分裝的0.4ml透析過的DNA溶液中加入0.4ml2MLiCl和0.8ml乙醇。于-20℃孵育30分鐘后，離心(13,000轉(zhuǎn)/分，BiofugeFresco，Heraeus，Hanau，德國)收集DNA。將該DNA沉淀溶于TE-緩沖液。用此方法制備的DNA可用于所有目的，包括southern印跡或構(gòu)建基因組文庫。實(shí)施例2在大腸桿菌中構(gòu)建谷氨酸棒狀桿菌(ATCC13032)的基因組文庫使用如實(shí)施例1所述制備的DNA，按照公知的且已建立的方法(參見例如，Sambrook，J.等人(1989)“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，ColdSpringHarborLaboratoryPress，或Ausubel，F(xiàn).M.等人(1994)“分子生物學(xué)最新方法”，JohnWiley&Sons.)構(gòu)建粘粒和質(zhì)粒文庫?？梢允褂萌魏钨|(zhì)粒或粘粒。特別優(yōu)選使用的是質(zhì)粒pBR322(Sutcliffe，J.G.(1979)美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)753737-3741)；pACYC177(Change&Cohen(1978)細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol)1341141-1156)、pBS系列的質(zhì)粒(pBSSK+，pBSSK-及其它；Stratagene，LaJolla，USA)、或粘粒如SuperCos1(Stratagene，LaJolla，USA)或Lorist6(Gibson，T.J.，RosenthalA.和Waterson，R.H.(1987)基因(Gene)53283-286。實(shí)施例3DNA序列測(cè)定和計(jì)算機(jī)功能分析如實(shí)施例2所述的基因組文庫按照標(biāo)準(zhǔn)方法用于DNA序列測(cè)定，尤其是使用ABI377序列測(cè)定儀通過鏈終止法測(cè)定(參見例如，F(xiàn)leischman，R.D.等人(1995)“流感嗜血菌(HaemophilusInfluenzae)Rd的全基因組隨機(jī)序列測(cè)定和組裝”，科學(xué)(Science)，269496-512)。使用具有以下核苷酸序列的測(cè)序引物5’-GGAAACAGTATGACCATG-3’或5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’。實(shí)施例4體內(nèi)誘變谷氨酸棒狀桿菌的體內(nèi)誘變可通過將質(zhì)粒(或其它載體)DNA在不能維持其遺傳信息完整性的大腸桿菌或其它微生物(例如芽孢桿菌屬種或酵母如釀酒酵母)中傳代而實(shí)施。通常的增變菌株在用于DNA修復(fù)系統(tǒng)的基因中有突變(例如mutHLS，mutD，mutT等；參考文獻(xiàn)見Rupp，W.D.(1996)，大腸桿菌和沙門氏菌(Salmonella)中的DNA修復(fù)機(jī)制，ASMWashington一書中的2277-2294頁)。此類菌株為技術(shù)人員熟知。此類菌株的用途在例如Greener，A.和Callahan，M.(1994)Strategies732-34中進(jìn)行了闡述。實(shí)施例5在大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌之間的DNA轉(zhuǎn)移幾種棒狀桿菌和短桿菌物種含有自主復(fù)制的內(nèi)源質(zhì)粒(例如pHM1519或pBL1)(綜述參見例如，Martin，J.F.等人(1987)生物技術(shù)(Biotechnology)，5137-146)。使用標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌載體可以容易地構(gòu)建用于大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌的穿梭載體(Sambrook，J.等人(1989)，“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，ColdSpringHarborLaboratoryPress，或Ausubel，F(xiàn).M.等人(1994)“分子生物學(xué)最新方法”(”CurrentProtocolsinMolecularBiology”)，JohnWiley&Sons)，其中加入用于谷氨酸棒狀桿菌中的復(fù)制起點(diǎn)和來自谷氨酸棒狀桿菌的適當(dāng)標(biāo)記。此類復(fù)制起點(diǎn)優(yōu)選取自從棒狀桿菌和短桿菌分離的內(nèi)源質(zhì)粒。對(duì)于這些物種，作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記尤其有用的是卡那霉素抗性基因(如源自Tn5或Tn903轉(zhuǎn)座子的基因)或氯霉素抗性基因(Winnacker，E.L.(1987)”FromGenestoClones-IntroductiontoGeneTechnology，VCH，Weinheim)。在文獻(xiàn)中有許多在大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌中均復(fù)制的多種穿梭載體的構(gòu)建例子，這些載體可用于多種目的，包括基因過表達(dá)(參見例如，Yoshihama，M.等人(1985)細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)162591-597，MartinJ.F.等人(1987)生物技術(shù)(Biotechnology)，5137-146和Eikmanns，B.J.等人(1991)基因(Gene)，10293-98)。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可將目的基因克隆入上述的穿梭載體之一中并可將此雜合載體導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌菌株。谷氨酸棒狀桿菌的轉(zhuǎn)化可通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Kastsumata，R.等人(1984)細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)159，306-311)、電穿孔(Liebl，E.等人(1989)FEMSMicrobiol.Letters，53399-303)以及當(dāng)使用特別的載體時(shí)，也可通過接合(如在Schfer，A等人(1990)細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)1721663-1666中所述)來完成。也可通過制備谷氨酸棒狀桿菌的質(zhì)粒DNA(使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法)并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，將谷氨酸棒狀桿菌的穿梭載體轉(zhuǎn)移至大腸桿菌中。該轉(zhuǎn)化步驟可使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，但有利的是使用Mcr-缺陷的大腸桿菌菌株，如NM522(Gough&Murray(1983)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)1661-19)。實(shí)施例6測(cè)定突變蛋白質(zhì)的表達(dá)在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中對(duì)突變蛋白質(zhì)活性的觀察依賴于突變蛋白質(zhì)與野生型蛋白質(zhì)以相似的方式和相似的量表達(dá)的事實(shí)。確定突變基因的轉(zhuǎn)錄水平(指示可用于翻譯為基因產(chǎn)物的mRNA量)的適宜方法是進(jìn)行Northern印跡(參考文獻(xiàn)見例如，Ausubel等人(1988)分子生物學(xué)最新方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，WileyNewYork)，其中設(shè)計(jì)為與目的基因結(jié)合的引物用可檢測(cè)標(biāo)志(通常為放射性的或化學(xué)發(fā)光的)標(biāo)記，這樣當(dāng)提取生物體培養(yǎng)物的總RNA、在凝膠上分級(jí)分離、轉(zhuǎn)移至穩(wěn)定的基質(zhì)上并與該探針孵育后，探針的結(jié)合和結(jié)合量將指示該基因的mRN的存在和存在量。該信息指示了突變基因的轉(zhuǎn)錄程度。通過多種方法可從谷氨酸棒狀桿菌中制備總細(xì)胞RNA，這些方法均為本領(lǐng)域熟知，如在Bormann，E.R.等人(1992)分子微生物學(xué)(Mol.Microbiol.)6317-326中所描述的。為了測(cè)定從該mRNA翻譯的蛋白質(zhì)的存在或相對(duì)量，可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如Western印跡(參見例如，Ausubel等人(1988)分子生物學(xué)最新方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，WileyNewYork)。在該方法中，提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)、通過凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)移至基質(zhì)如硝化纖維素上并與能和目標(biāo)蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的探針一起孵育，其中所述探針如抗體。該探針通常用易于檢測(cè)到的化學(xué)發(fā)光或顯色標(biāo)記物標(biāo)記。所觀察到的標(biāo)記物的存在和量將指示在細(xì)胞中目標(biāo)突變蛋白質(zhì)的存在和量。實(shí)施例7遺傳改變的谷氨酸棒狀桿菌的生長(zhǎng)—培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件遺傳修飾的棒狀桿菌培養(yǎng)在合成或天然的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。用于棒狀桿菌的許多種不同生長(zhǎng)培養(yǎng)基為人們熟知并易于獲得(Lieb等人(1989)Appl.Microbiol.Biotechnol.，32205-210；vonderOsten等人(1998)BiotechnologyLetters，1111-16；PatentDE4,120,867；在《原核生物》(TheProcaryotes)，VolumeII，Balows，A.等人編輯.Springer-Verlag一書中的Liebl(1992)“棒狀桿菌屬”(“TheGenusCorynebacteria”))。這些培養(yǎng)基由一種或多種碳源、氮源、無機(jī)鹽、維生素和痕量元素組成。優(yōu)選的碳源是糖類，如單糖、二糖或多糖。非常好的碳源的實(shí)例是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉和纖維素。也可通過復(fù)雜化合物如糖蜜或其它來自糖加工的副產(chǎn)品向培養(yǎng)基中提供糖。加入不同碳源的混合物也可能是有利的。其它可能的碳源為醇類和有機(jī)酸，如甲醇、乙醇、醋酸或乳酸。氮源通常為有機(jī)或無機(jī)氮化合物，或?yàn)榘@些化合物的物質(zhì)。示例性氮源包括氨氣和胺鹽如NH4Cl或(NH4)2SO4、NH4OH、硝酸鹽、尿素、氨基酸和復(fù)雜氮源如玉米漿、大豆粉、大豆蛋白質(zhì)、酵母提取物、肉膏等?？砂ㄔ谂囵B(yǎng)基中的無機(jī)鹽化合物包括鈣、鎂、鈉、鈷、鉬、鉀、錳、鋅、銅和鐵的氯化物、亞磷酸鹽或硫酸鹽。可向培養(yǎng)基中加入螯合物以維持溶液中的金屬離子。尤其有用的螯合物包括二羥基酚，如兒茶酚或原兒茶酸鹽，和有機(jī)酸如檸檬酸。培養(yǎng)基一般也包括其它生長(zhǎng)因子如維生素或生長(zhǎng)促進(jìn)劑，其實(shí)例包括生物素、核黃素、硫胺素、葉酸、煙酸、泛酸鹽和維生素B6。生長(zhǎng)因子和鹽常來自復(fù)雜的培養(yǎng)基組分，如酵母提取物、糖蜜、玉米漿等。培養(yǎng)基的確切組成強(qiáng)烈取決于具體實(shí)驗(yàn)并在每一具體情況下單獨(dú)確定。有關(guān)培養(yǎng)基優(yōu)化的信息在教科書“AppliedMicrobiol.Physiology，APracticalApproach”(P.M.Rhodes，P.F.Stanbury編輯，IRLPress(1997)53-73頁，ISBN0199635773)中可找到。也可從供應(yīng)商處得到生長(zhǎng)培養(yǎng)基，如Standard1(Merck)或BHI(Brainheartinfusion，DIFCO)等。通過加熱(1.5巴，121℃加熱20分鐘)或過濾除菌對(duì)所有的培養(yǎng)基組成成份進(jìn)行滅菌。組成成份可一起滅菌，或需要的話分開滅菌。所有的培養(yǎng)基組成成份可在培養(yǎng)開始時(shí)存在，或它們可按需要連續(xù)加入或分批加入。對(duì)每一實(shí)驗(yàn)分別確定培養(yǎng)條件。溫度應(yīng)在15℃和45℃的范圍之間。在實(shí)驗(yàn)中溫度可保持恒定或可改變。培養(yǎng)基的pH應(yīng)在5至8.5的范圍之間，優(yōu)選地在7.0附近，可通過向培養(yǎng)基中添加緩沖液而維持。用于此目的的示例性緩沖液為磷酸鉀緩沖液?？蓚溥x地或同時(shí)地使用合成的緩沖液如MOPS、HEPES、ACES和其它。在生長(zhǎng)過程中通過加入NaOH或NH4OH也可維持恒定的培養(yǎng)pH。如果使用復(fù)雜的培養(yǎng)基組分如酵母提取物，可減輕對(duì)額外的緩沖液的需要，因?yàn)樵S多復(fù)雜化合物具有高緩沖容量。如果使用發(fā)酵罐培養(yǎng)微生物，用氣態(tài)氨也可控制pH。培養(yǎng)時(shí)間通常在幾小時(shí)到幾天之間。選擇培養(yǎng)時(shí)間以允許肉湯中累積最大量的產(chǎn)物。可在多種容器如不同規(guī)格的微滴定板、玻璃管、玻璃燒瓶或玻璃或金屬發(fā)酵罐中實(shí)施公開的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于篩選大量的克隆，應(yīng)在微滴定板、玻璃管或在有或沒有擋板的搖瓶中培養(yǎng)微生物。優(yōu)選地使用100ml搖瓶，其中裝有10％(體積)的所需生長(zhǎng)培養(yǎng)基。該燒瓶應(yīng)在旋轉(zhuǎn)振蕩器(振幅25mm)上以100-300轉(zhuǎn)/分搖動(dòng)?？赏ㄟ^維持潮濕環(huán)境減少蒸發(fā)損失；備選地，對(duì)蒸發(fā)損失應(yīng)進(jìn)行數(shù)學(xué)上的校正。如果研究經(jīng)遺傳修飾后的克隆，也應(yīng)分析未修飾的對(duì)照克隆或含有無任何插入的基本質(zhì)粒的對(duì)照克隆。使用已于30℃孵育的在瓊脂板上生長(zhǎng)的細(xì)胞接種培養(yǎng)基至OD6000.5-1.5，其中所述瓊脂板如CM板(10g/l葡萄糖，2.5g/lNaCl，2g/l尿素，10g/l聚胨，5g/l酵母抽取物，5g/l肉膏，22g/l瓊脂，用2MNaOH調(diào)節(jié)至pH6.8)。培養(yǎng)基的接種通過導(dǎo)入來自CM板的谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞的鹽水溶液或添加該細(xì)菌的液體預(yù)培養(yǎng)物而完成。實(shí)施例8突變蛋白質(zhì)功能的體外分析本領(lǐng)域已建立了對(duì)酶活性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)的確定方法。為了確定特定的修飾的酶的活性，實(shí)驗(yàn)應(yīng)加以修改以適應(yīng)野生型酶的比活性，這在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。例如可在下列參考文獻(xiàn)中找到對(duì)酶的一般性總結(jié)以及有關(guān)結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)、原理、方法、應(yīng)用和多種酶活性的測(cè)定例子的具體細(xì)節(jié)Dixon，M.和Webb，E.C.，(1979)酶(Enzymes).Longmans倫敦；Fersht，(1985)酶結(jié)構(gòu)和機(jī)制(EnzymeStructureandMechanism).Freeman紐約；Walsh，(1979)酶促反應(yīng)機(jī)制(EnzymaticReactionMechanisms).FreemanSanFrancisco；Price，N.C.，Stevens，L(1982)酶學(xué)基礎(chǔ)(FundamentalsofEnzymology).OxfordUniv.PressOxford；Boyer，P.D.編輯(1983)酶(TheEnzymes)，第三版，AcademicPress紐約；Bisswanger，H.，(1994)酶動(dòng)力學(xué)(Enzymkinetik)，第二版.VCHWeinheim(ISBN3527300325)；Bergmeyer，H.U.，Bergmeyer，J.，Graβl，M.編輯(1983-1986)酶分析方法(MethodsofEnzymaticAnalysis)，第三版，I-XII卷，VerlagChemieWeinheim；以及Ullmann工業(yè)化學(xué)百科全書(Ullmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry)(1987)A9卷，”酶”.VCHWeinheim，352-363頁。可通過幾種已建立的方法測(cè)定結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)的活性，如DNA條帶移位分析(也稱為凝膠阻滯試驗(yàn))。此類蛋白質(zhì)對(duì)其它分子表達(dá)的影響可使用報(bào)告基因試驗(yàn)測(cè)定(如在Kolmar，H.等人(1995)EMBOJ.143895-3904及其中所引用的參考文獻(xiàn)中所述)。報(bào)告基因測(cè)試系統(tǒng)為人們所熟知，并被建立以應(yīng)用于原核和真核細(xì)胞，其中使用酶如β-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白和幾種其它的酶。可根據(jù)如在《生物膜，分子結(jié)構(gòu)和功能》(Biomembranes，MolecularStructureandFunction)，SpringerHeidelberg一書中的Gennis，R.B.(1989)”孔、通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白”，85-137；199-234和270-322頁中所述的技術(shù)進(jìn)行膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的測(cè)定。實(shí)施例9分析突變蛋白質(zhì)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生的影響谷氨酸棒狀桿菌中的遺傳修飾對(duì)目標(biāo)化合物(如氨基酸)產(chǎn)生的影響可通過如下方式評(píng)估將經(jīng)修飾的微生物在合適的條件(如上文中所描述的那些條件)下生長(zhǎng)，并針對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物(即氨基酸)產(chǎn)生的增加來分析培養(yǎng)基和/或細(xì)胞成分。此類分析技術(shù)為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知，包括光譜學(xué)、薄層色譜法、多種顯色法、酶學(xué)和微生物學(xué)方法、以及分析色譜法如高效液相色譜法(參見例如，Ullman工業(yè)化學(xué)百科全書(Ullman，EncyclopediaofIndustrialChemistry)，A2卷，89-90和443-613頁，VCHWeinheim(1985)；Fallon，A.等人(1987)《生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)》(LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology)中的“HPLC在生物化學(xué)中的應(yīng)用”，17卷；Rehm等人(1993)生物技術(shù)(Biotechnology)，3卷，III章“產(chǎn)物回收和純化”，469-714頁，VCHWeinheim；Belter，P.A.等人(1988)生物分離生物技術(shù)中的下游加工(BioseparationsdownstreamprocessingforBiotechnotogy)，JohnWileyandSons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.(1992)生物物質(zhì)的回收方法(Recoveryprocessesforbiologicalmaterials)，JohnWileyandSons；在《Ulmann工業(yè)化學(xué)百科全書》一書中的Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.(1988)生物化學(xué)分離，B3卷，11章，1-27頁，VCHWeinheim；以及Dechow，F(xiàn).J.(1989)生物技術(shù)中的分離和純化技術(shù)(Separationandpurificationtechniquesinbiotechnology)，NoyesPublications.)。除了測(cè)定發(fā)酵終產(chǎn)物外，還可分析用于產(chǎn)生目標(biāo)化合物的代謝途徑的其它成分如中間體和副產(chǎn)物來確定生物體的總體生產(chǎn)力和/或化合物的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)效率。分析方法包括測(cè)定培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)素水平(例如，糖類、碳?xì)浠衔铩⒌?、磷酸鹽和其它離子)、測(cè)定生物量組成和生長(zhǎng)、分析生物合成途徑中共同代謝物的產(chǎn)生及測(cè)定發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氣體。這些測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法在《應(yīng)用微生物生理學(xué)，實(shí)用方法》(AppliedMicrobialPhysiology，APracticalApproach)，P.M.Rhodes和P.F.Stanbury編輯，IRLPress，103-129；131-163和165-192頁(ISBN0199635773)及其引用的參考文獻(xiàn)中描述。實(shí)施例10從谷氨酸棒狀桿菌培養(yǎng)物中純化目標(biāo)產(chǎn)物可通過多種本領(lǐng)域熟知的方法從谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞或上述培養(yǎng)物上清回收目標(biāo)產(chǎn)物。如果目標(biāo)產(chǎn)物不從細(xì)胞向外分泌，可低速離心從培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞、用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如機(jī)械力或超聲裂解細(xì)胞。離心去除細(xì)胞碎片，保留含有可溶蛋白質(zhì)的上清級(jí)分用于進(jìn)一步純化目標(biāo)化合物。如果產(chǎn)物從谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞分泌，則低速離心從培養(yǎng)物中去除細(xì)胞，并保留上清級(jí)分用于進(jìn)一步純化。將來自任一種純化方法的上清級(jí)分用合適的樹脂進(jìn)行層析，其中目標(biāo)分子保留在層析樹脂上而樣本中的許多雜質(zhì)不保留在層析樹脂上，或者雜質(zhì)保留在層析樹脂上而樣本不保留。此層析步驟必需時(shí)可使用相同或不同的層析樹脂重復(fù)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在選擇合適的層析樹脂以及將它們最有效地用于特定的待純化分子方面是很精通的。可通過過濾或超濾濃縮純化產(chǎn)物，并貯存在產(chǎn)物穩(wěn)定性最大的溫度下。有大量的純化方法為本領(lǐng)域公知，上述純化方法為非限制性的。此類純化技術(shù)例如在Bailey，J.E.和Ollis，D.F.生物化學(xué)工程基礎(chǔ)(BiochemicalEngineeringFundamentals)，McGraw-Hill紐約(1986)中描述。分離的化合物的身份和純度可通過本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)評(píng)定。這些技術(shù)包括高效液相色譜(HPLC)、光譜法、顯色法、薄層色譜法、NIRS、酶學(xué)試驗(yàn)或微生物學(xué)方法。此類分析方法編纂于Patek等人(1994)Appl.Environ.Microbiol.60133-140；Malakhova等人(1996)生物技術(shù)(Biotekhnologiya)1127-32；和Schmidt等人(1998)生物加工工程(BioprocessEngineer)1967-70；Ulmann工業(yè)化學(xué)百科全書(Ulmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry)(1996)A27卷，VCHWeinheim，89-90頁，521-540頁，540-547頁，559-566頁，575-581頁和581-587頁；Michal，G.(1999)生物化學(xué)途徑生物化學(xué)和分子生物學(xué)圖集(BiochemicalPathwaysAnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology)，JohnWileyandSons；《生物化學(xué)和分子生物學(xué)中的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)》17卷中的Fallon，A.等人(1987)HPLC在生物化學(xué)中的應(yīng)用。等價(jià)方案技術(shù)人員知道可通過簡(jiǎn)單地使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)確定本發(fā)明具體實(shí)施方案的大量等價(jià)方案。此類等價(jià)方案旨在包括在下面的權(quán)利要求書中。表1中信息的理解如下在第1列“DNAID”中，每種情況下相關(guān)數(shù)字指所附序列表的SEQIDNO。所以，“DNAID”列中的“5”指SEQIDNO5。在第2列“AAID”中，每種情況下相關(guān)數(shù)字指所附序列表的SEQIDNO。因此，“AAID”列中的“6”指SEQIDNO6。在第3列“標(biāo)識(shí)”中，列出了每個(gè)序列的明確的內(nèi)部名稱。在第4列“AApos”中，每種情況下相關(guān)數(shù)字指相同行中多肽序列“AAID”的氨基酸位置。所以，“AApos”列中“26”是相應(yīng)所示的多肽序列的氨基酸位置26。位置計(jì)算從N末端為+1開始。在第5列“AA野生型”中，每種情況下相關(guān)字母指相應(yīng)野生型菌株中位于第4列中所示的位置處的氨基酸(用單字母碼表示)。在第6列“AA突變”中，每種情況下相關(guān)字母指相應(yīng)突變菌株中位于第4列中所示的位置處的氨基酸(用單字母碼表示)。在第7列“功能”中，列出了相應(yīng)多肽序列的生理學(xué)功能。蛋白原性氨基酸的單字母碼A丙氨酸C半胱氨酸D天冬氨酸E谷氨酸F苯丙氨酸G甘氨酸H組氨酸I異亮氨酸K賴氨酸L亮氨酸M甲硫氨酸N天冬酰胺P脯氨酸Q谷氨酰胺R精氨酸S絲氨酸T蘇氨酸V纈氨酸W色氨酸Y酪氨酸表1編碼葡萄糖-6-磷酸-脫氫酶蛋白的基因DNAIDAAID標(biāo)識(shí)AA位置AA野生型AA突變體功能12RXA02737243AT葡萄糖-6-磷酸脫氫酶序列表<110>巴斯福股份公司(BASFAktiengesellschaft)<120>編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶蛋白的基因<130>OZ0050/53030<140><141><160>2<170>PatentInVer.2.0<210>1<211>1672<212>DNA<213>谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)<220><221>5′UTR<222>(1)..(100)<220><221>CDS<222>(101)..(1645)<220><221>3′UTR<222>(1646)..(1672)<400>1agcacgctgcatcagtaacggcgacatgaaatcgaattagttcgatcttatgtggccgtt60acacatctttcattaaagaaaggatcgtgacactaccatcgtgagcacaaacacg115ValSerThrAsnThr15accccctccagctggacaaacccactgcgcgacccgcaggataaacga163ThrProSerSerTrpThrAsnProLeuArgAspProGlnAspLysArg101520ctcccccgcatcgctggcccttccggcatggtgatcttcggtgtcact211LeuProArgIleAlaGlyProSerGlyMetValIlePheGlyValThr253035ggcgacttggctcgaaagaagctgctccccgccatttatgatctagca259GlyAspLeuAlaArgLysLysLeuLeuProAlaIleTyrAspLeuAla404550aaccgcggattgctgcccccaggattctcgttggtaggttacggccgc307AsnArgGlyLeuLeuProProGlyPheSerLeuValGlyTyrGlyArg556065cgcgaatggtccaaagaagactttgaaaaatacgtacgcgatgccgca355ArgGluTrpSerLysGluAspPheGluLysTyrValArgAspAlaAla70758085agtgctggtgctcgtacggaattccgtgaaaatgtttgggagcgcctc403SerAlaGlyAlaArgThrGluPheArgGluAsnValTrpGluArgLeu9095100gccgagggtatggaatttgttcgcggcaactttgatgatgatgcagct451AlaGluGlyMetGluPheValArgGlyAsnPheAspAspAspAlaAla105110115ttcgacaacctcgctgcaacactcaagcgcatcgacaaaacccgcggc499PheAspAsnLeuAlaAlaThrLeuLysArgIleAspLysThrArgGly120125130accgccggcaactgggcttactacctgtccattccaccagattccttc547ThrAlaGlyAsnTrpAlaTyrTyrLeuSerIleProProAspSerPhe135140145acagcggtctgccaccagctggagcgttccggcatggctgaatccacc595ThrAlaValCysHisGlnLeuGluArgSerGlyMetAlaGluSerThr150155160165gaagaagcatggcgccgcgtgatcatcgagaagcctttcggccacaac643GluGluAlaTrpArgArgValIleIleGluLysProPheGlyHisAsn170175180ctcgaatccgcacacgagctcaaccagctggtcaacgcagtcttccca691LeuGluSerAlaHisGluLeuAsnGlnLeuValAsnAlaValPhePro185190195gaatcttctgtgttccgcatcgaccactatttgggcaaggaaacagtt739GluSerSerValPheArgIleAspHisTyrLeuGlyLysGluThrVal200205210caaaacatcctggctctgcgttttgctaaccagctgtttgagccactg787GlnAsnIleLeuAlaLeuArgPheAlaAsnGlnLeuPheGluProLeu215220225tggaactccaactacgttgaccacgtccagatcaccatggctgaagat835TrpAsnSerAsnTyrValAspHisValGlnIleThrMetAlaGluAsp230235240245attggcttgggtggacgtgctggttactacgacggcatcggcgcagcc883IleGlyLeuGlyGlyArgAlaGlyTyrTyrAspGlyIleGlyAlaAla250255260cgcgacgtcatccagaaccacctgatccagctcttggctctggttgcc931ArgAspValIleGlnAsnHisLeuIleGlnLeuLeuAlaLeuValAla265270275a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