專利名稱：生產(chǎn)l－抗壞血酸和d－異抗壞血酸的酶方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)使用α-淀粉酶或具有α-淀粉酶活性的酶分別由2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸來(lái)生產(chǎn)L-抗壞血酸或D-異抗壞血酸的新方法。
L-抗壞血酸，也被稱為維生素C，不僅被廣泛用作藥物，而且還被用廣泛用于食品工業(yè)、化妝品工業(yè)等領(lǐng)域，是一種十分有用的化合物。D-異抗壞血酸主要作為抗氧劑用于食品添加劑。
迄今為止，一直是用眾所周知的Reichstein法來(lái)工業(yè)制備L-抗壞血酸，在該方法中，L-抗壞血酸是由D-葡萄糖經(jīng)由D-山梨醇、L-山梨糖、乙酰丙酮-L-山梨糖、乙酰丙酮-2-酮基-L-古洛糖酸、2-酮基-L-古洛糖酸和2-酮基-L-古洛糖酸甲酯來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)的。在這種過(guò)程中，D-山梨醇向L-山梨糖的轉(zhuǎn)化是唯一的微生物步驟，其它步驟都是化學(xué)步驟。乙酰丙酮-2-酮基-L-古洛糖酸向L-抗壞血酸的轉(zhuǎn)化是通過(guò)兩種不同的操作來(lái)完成的(i)去保護(hù)得到2-酮基-L-古洛糖酸，然后用甲醇進(jìn)行酯化并進(jìn)行堿催化的環(huán)化；和(ii)通過(guò)酸催化的環(huán)化直接由被保護(hù)形式或去保護(hù)形式的2-酮基-L-古洛糖酸獲得L-抗壞血酸。這些轉(zhuǎn)化過(guò)程必需通過(guò)無(wú)水或低水的反應(yīng)系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行。從環(huán)境和經(jīng)濟(jì)學(xué)角度考慮，優(yōu)選不使用有機(jī)溶劑的反應(yīng)。
另一方面，D-異抗壞血酸一直是由D-葡萄糖經(jīng)由2-酮基-D-葡糖酸來(lái)進(jìn)行制造的，其本身可通過(guò)用屬于假單胞菌屬的菌株進(jìn)行的發(fā)酵，并經(jīng)由2-酮基-D-葡糖酸甲酯來(lái)進(jìn)行制備。
人們投入了大量的時(shí)間和努力去發(fā)現(xiàn)通過(guò)微生物來(lái)制造L-抗壞血酸的其它方法。大多數(shù)用微生物生產(chǎn)L-抗壞血酸的研究都著重于生產(chǎn)L-抗壞血酸所用的中間體——2-酮基-L-古洛糖酸的生產(chǎn)，該中間體可以用單一的、混和的或重組的培養(yǎng)物從L-山梨糖(例如EP 213,591；US 4,960,695；EP221,707)、D-山梨醇(例如EP 213,591；US 5,312,741；WO 95/23220；WO98/17819)、或經(jīng)由2，5-二酮基葡糖酸從D-葡萄糖生產(chǎn)。然后，可以通過(guò)上述的化學(xué)方法將2-酮基-L-古洛糖酸轉(zhuǎn)化成L-抗壞血酸。
如上所述，2-酮基-L-古洛糖酸經(jīng)由2-酮基-L-古洛糖酸γ-內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成L-抗壞血酸是一種伴有除去水分子的酸催化反應(yīng)。該反應(yīng)的主要原理是形成一種羧基酯鍵從而在2-酮基-L-古洛糖酸分子中產(chǎn)生γ-內(nèi)酯環(huán)。因此，尤其是在水相中，該平衡反應(yīng)中的最終狀態(tài)是由物理-化學(xué)條件決定的。通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化由2-酮基-L-古洛糖酸進(jìn)行的L-抗壞血酸的生產(chǎn)即使在水相中也十分可觀，但不足以用于工業(yè)應(yīng)用。對(duì)于成本效果和環(huán)境需要而言，十分需要在水相或在具有低有機(jī)溶劑含量的水相中進(jìn)行的生產(chǎn)過(guò)程。于是，對(duì)于在水相中的生產(chǎn)而言，一定會(huì)需要對(duì)該化學(xué)轉(zhuǎn)化進(jìn)行一些生物學(xué)增強(qiáng)。高溫度和高酸度的(低)pH對(duì)于該反應(yīng)而言顯然都是有利的。
WO 97/43433描述了一種通過(guò)將2-酮基-L-古洛糖酸或其酯與水解酶催化劑進(jìn)行接觸來(lái)制備L-抗壞血酸的方法，所說(shuō)的水解酶催化劑選自蛋白酶(酶分類為EC 3.4.x.x)、酯酶(酶分類為EC 3.1.x.x)、脂肪酶(酶分類為EC 3.1.x.x)和酰胺酶(酶分類為EC 3.5.x.x)。US 6,022,719舉例說(shuō)明了用水解酶如蛋白酶、酯酶、脂肪酶或酰胺酶，由2-酮基-L-古洛糖酸的酯如2-酮基-L-古洛糖酸丁酯來(lái)形成L-抗壞血酸，但是從2-酮基-L-古洛糖酸本身不能明顯地形成L-抗壞血酸。其并沒(méi)有公開(kāi)α-淀粉酶或具有α-淀粉酶活性的酶可作為水解酶催化劑用于由2-酮基-L-古洛糖酸來(lái)形成L-抗壞血酸。
α-淀粉酶是一種可催化淀粉α-1，4-糖苷鍵水解并釋放出各種長(zhǎng)度的多糖和低聚糖的內(nèi)切型水解酶。α-淀粉酶來(lái)源廣泛，可得自微生物、植物以及動(dòng)物。已知一些α-淀粉酶具有良好的熱穩(wěn)定性。此外，熱嗜酸性細(xì)菌酸熱脂環(huán)酸桿菌產(chǎn)生一種α-淀粉酶，其在酸性條件下具有很好的熱穩(wěn)定性。
本發(fā)明提供了一種由2-酮基-L-古洛糖酸來(lái)制備L-抗壞血酸的酶方法，其包括將2-酮基-L-古洛糖酸在溶液中與α-淀粉酶進(jìn)行接觸。此外，本發(fā)明還提供了一種由2-酮基-D-葡糖酸來(lái)制備D-異抗壞血酸的方法，其包括將2-酮基-D-葡糖酸在溶液中與α-淀粉酶相接觸。
這里所用的術(shù)語(yǔ)“α-淀粉酶”包括α-淀粉酶本身和具有α-淀粉酶活性的酶。
微生物“解淀粉芽孢桿菌”、“地衣芽孢桿菌”和“酸熱脂環(huán)酸桿菌”還包括如原核生物命名法的國(guó)際代碼所定義的具有相同物理-化學(xué)性質(zhì)的該類種屬的同義詞和基本異名。
在本發(fā)明的方法中用作催化劑的α-淀粉酶是那些得自生物體的淀粉酶，所說(shuō)的生物體包括動(dòng)物、植物以及微生物如真菌、酵母菌和細(xì)菌。本發(fā)明優(yōu)選的α-淀粉酶是那些解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酸熱脂環(huán)酸桿菌以及豬胰腺的α-淀粉酶。更優(yōu)選的是酸熱脂環(huán)酸桿菌、尤其是酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC 27009的具有α-淀粉酶活性的酶。
用于本發(fā)明方法的α-淀粉酶可以購(gòu)自供應(yīng)商如Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，USA)或可以通過(guò)常規(guī)的蛋白純化方法如硫酸銨沉淀法、色譜法和結(jié)晶法從任何適宜的生物體，包括動(dòng)物、植物和微生物中被分離出來(lái)。在本發(fā)明的方法中，可以使用任何形式的α-淀粉酶，特別是酶溶液或被固定的酶。
在本發(fā)明的方法中，2-酮基-L-古洛糖酸和2-酮基-D-葡糖酸優(yōu)選的化學(xué)形式是游離酸或其金屬鹽如鈉鹽和鈣鹽。
該反應(yīng)混合物可以包含適宜的α-淀粉酶穩(wěn)定劑如Ca離子，并且可以進(jìn)一步包含抗氧化劑如2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇或半胱氨酸以防止所產(chǎn)生的L-抗壞血酸或D-異抗壞血酸降解。
本發(fā)明方法的反應(yīng)溫度在0℃至120℃的范圍內(nèi)。優(yōu)選的溫度為20℃至100℃，并且最優(yōu)選地為37℃至90℃。
本發(fā)明方法適宜的pH為1.5至12。優(yōu)選的pH為1.5至8，并且最優(yōu)選的為2至7?？梢杂眠m宜的緩沖液對(duì)該反應(yīng)混合物的pH進(jìn)行調(diào)整或可以通過(guò)加入酸例如HCl或堿例如NaOH來(lái)對(duì)其直接進(jìn)行調(diào)整。
反應(yīng)周期適宜地在1至7天的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在1至3天的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的方法可以在溶劑如水、含水醇、有機(jī)溶劑或其混合物中進(jìn)行。醇的實(shí)例包括C1-C6醇，如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇或叔丁醇。有機(jī)溶劑的實(shí)例包括脂族烴(例如，庚烷和異辛烷)、脂環(huán)族烴(例如，環(huán)己烷)和芳族烴(例如，苯和甲苯)。優(yōu)選的溶劑是水或含水溶劑。
在上述條件下所產(chǎn)生的L-抗壞血酸或D-異抗壞血酸可以用現(xiàn)有技術(shù)中公知的方法容易地進(jìn)行回收。例如，可以通過(guò)結(jié)晶、電滲析或使用離子交換樹(shù)脂的柱色譜來(lái)進(jìn)行L-抗壞血酸或D-異抗壞血酸的分離。
用下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了更詳細(xì)的說(shuō)明；但是，應(yīng)當(dāng)清楚的是本發(fā)明并不限于這些特定的實(shí)施例。
實(shí)施例1用解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和豬胰腺的α-淀粉酶將2-酮基-L-古洛糖酸轉(zhuǎn)化成L-抗壞血酸進(jìn)行了解淀粉芽孢桿菌(Sigma-Aldrich，產(chǎn)品號(hào)碼10068)、地衣芽孢桿菌(Sigma-Aldrich，產(chǎn)品號(hào)碼A4551)和豬胰腺(Sigma-Aldrich，產(chǎn)品號(hào)碼A4268)的α-淀粉酶將2-酮基-L-古洛糖酸轉(zhuǎn)化成L-抗壞血酸的試驗(yàn)。將酶粉末溶解于緩沖液1[20mM Na-MES緩沖液(pH7.0)和2mM CaCl2]中并將其用于轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。該反應(yīng)混合物在50μl 100mM的緩沖液中包含12％2-酮基-L-古洛糖酸鈉單水合物、2mM CaCl2和α-淀粉酶。α-淀粉酶和緩沖液在各反應(yīng)混合物中的濃度如表1所示。將該反應(yīng)在70℃下在厭氧條件下進(jìn)行20小時(shí)。
用使用YMC-Pack PolyamineII柱(內(nèi)徑4.6×150mm；YMC Co.，日本)的HPLC在264nm下對(duì)L-抗壞血酸進(jìn)行分析，使用包含70％(v/v)乙腈和15mM磷酸二氫銨的流動(dòng)相溶劑，流速為1.5ml/分鐘。通過(guò)由含和不含α-淀粉酶的反應(yīng)液所獲得的結(jié)果之間的差異來(lái)測(cè)定生物學(xué)產(chǎn)生的L-抗壞血酸的量。將所產(chǎn)生的L-抗壞血酸的量概括地列與表1中。
表1
*產(chǎn)品號(hào)碼實(shí)施例2得自酸熱脂環(huán)酸桿菌的具有α-淀粉酶活性的酶的純化使酸熱脂環(huán)酸桿菌ATCC 27009在24.6升包含9.8mM(NH4)2SO4、0.47mM CaCl2、2.7mM KH2PO4、1.0mM MgSO4、10μM FeSO4、9.1μMMnCl2、11.7μM Na2B4O7、0.57μM ZnSO4、0.2μM CuCl2、0.12μM VOSO4、0.16μM NaMoO4、30nM CoSO4和10mM麥芽糖(pH3.5)的基質(zhì)中在55℃下有氧生長(zhǎng)15小時(shí)。通過(guò)離心回收培養(yǎng)液。
在酶純化過(guò)程中，所有柱色譜的運(yùn)行都是在4℃下進(jìn)行的。通過(guò)用對(duì)-硝基苯基α-D-麥芽戊糖苷(Sigma-Aldrich)作為底物，用分光光度分析對(duì)α-淀粉酶活性進(jìn)行測(cè)定。該試驗(yàn)混合物在40μl 50mM的醋酸鈉緩沖液(pH4.0)中包含1mM對(duì)-硝基苯基α-D-麥芽戊糖苷和酶樣品。將其在55℃下培養(yǎng)20分鐘后，向該反應(yīng)混合物中加入100μl 1M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)。在405nm下以吸光度的方式測(cè)定所釋放的對(duì)-硝基苯酚。
將回收的培養(yǎng)液用DEAE Sepharose Fast Flow (AmershamPharmacia Biotech UK Ltd.Buckinghamshire，UK)柱色譜進(jìn)行處理。在20mM下將0.5M Na-MES緩沖液(pH6.0)加入該培養(yǎng)液中并用NaOH將pH調(diào)節(jié)至6.0。將由1.65升培養(yǎng)物所制得的液體樣品加載到用緩沖液2[20mM Na-MES緩沖液(pH6.0)、0.5mM CaCl2和1.0mM MgSO4]進(jìn)行了平衡的DEAE Sepharose Fast Flow柱(100ml內(nèi)徑4.4×6.6cm)上。在用緩沖液2洗滌后，用NaCl的線性梯度(0-0.45M，在緩沖液2中)對(duì)酶進(jìn)行洗脫。將該步驟重復(fù)四次以對(duì)6.6升培養(yǎng)物進(jìn)行處理。將四次色譜運(yùn)行的活性級(jí)分合并并用緩沖液3[20mM醋酸鈉緩沖液(pH3.0)、0.5mM CaCl2和1.0mM MgSO4]對(duì)其進(jìn)行透析。將進(jìn)行了透析的樣品加載到用緩沖液3平衡的SP Sepharose Fast Flow柱(80ml內(nèi)徑4.4×5.3cm，AmershamPharmacia Biotech UK)上。在用緩沖液3進(jìn)行洗滌后，用NaCl的線性梯度(0-0.6M，在緩沖液3中)對(duì)酶進(jìn)行洗脫。收集活性成分。在用緩沖液2進(jìn)行透析后，將該酶樣品加載到用緩沖液2平衡的Q Sepharose Fast Flow柱(30ml內(nèi)徑2.5×6.2cm，Amersham Pharmacia Biotech UK)上。在用緩沖液2洗滌后，用NaCl的線性梯度(0-0.8M，在緩沖液2中)對(duì)酶進(jìn)行洗脫。收集活性級(jí)分并用Centriplus YM-30(Millipore Co.，USA)將其濃縮至3.5ml。用緩沖液4[20mM Na-MES緩沖液(pH6.0)、0.5mM CaCl2、1.0mMMgSO4和0.15M NaCl]使?jié)饪s了的樣品通過(guò)HiPrep Sephacryl S-300 HRl6/60(Amersham Pharmacia Biotech UK)。得到9ml包含具有α-淀粉酶活性的酶的級(jí)分。用緩沖液5[20mM Na-MES緩沖液(pH6.0)、0.5mM CaCl2、1.0mM MgSO4和50mM NaCl]對(duì)該酶樣品進(jìn)行透析并通過(guò)濃縮器用Centricon YM-30(Millipore Co.，USA)反復(fù)進(jìn)行濃縮/稀釋將其濃縮至0.1lml。在SDS-PAGE上，純化了的酶主要表現(xiàn)出約160kDa的分子量。最后，獲得0.47mg純度為約80％的具有α-淀粉酶活性的酶。
實(shí)施例3酸熱脂環(huán)酸桿菌的具有α-淀粉酶活性的酶進(jìn)行的2-酮基-L-古洛糖酸向L-抗壞血酸的轉(zhuǎn)化對(duì)實(shí)施例2中由酸熱脂環(huán)酸桿菌純化得到的具有α-淀粉酶活性的酶進(jìn)行的2-酮基-L-古洛糖酸向L-抗壞血酸的轉(zhuǎn)化進(jìn)行了試驗(yàn)。該反應(yīng)混合物在20μl中包含10％2-酮基-L-古洛糖酸鈉單水合物(用HCl將pH調(diào)至2.5)和酶(100或200μg/ml)。將該反應(yīng)在厭氧條件下在80℃下進(jìn)行24小時(shí)。用實(shí)施例1中所描述的方法對(duì)L-抗壞血酸進(jìn)行分析。通過(guò)由含和不含酶的反應(yīng)液所獲得的結(jié)果之間的差異來(lái)測(cè)定生物學(xué)產(chǎn)生的L-抗壞血酸的量。100μg/ml酶產(chǎn)生3.90g/l L-抗壞血酸，200μg/ml酶產(chǎn)生4.22g/l L-抗壞血酸。
實(shí)施例4由解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌以及豬胰腺的α-淀粉酶進(jìn)行的2-酮基-D-葡糖酸向D-異抗壞血酸的轉(zhuǎn)化對(duì)實(shí)施例1所述的解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌以及豬胰腺的α-淀粉酶進(jìn)行的2-酮基-D-葡糖酸向D-異抗壞血酸的轉(zhuǎn)化進(jìn)行了試驗(yàn)。用溶解于緩沖液1中的α-淀粉酶來(lái)進(jìn)行該轉(zhuǎn)化反應(yīng)。該反應(yīng)混合物在50μl100mM緩沖液中包含5％2-酮基-D-葡糖酸半鈣鹽(Sigma-Aldrich)、4mMCaCl2和400μg/ml的α-淀粉酶。各反應(yīng)混合物中的緩沖液如表2所示。將該反應(yīng)在厭氧條件下在70℃下進(jìn)行20小時(shí)。用與分析L-抗壞血酸所用的方法(如實(shí)施例1所述)相同的方法來(lái)對(duì)D-異抗壞血酸進(jìn)行分析。通過(guò)由含和不含α-淀粉酶的反應(yīng)液所獲得的結(jié)果之間的差異來(lái)測(cè)定生物學(xué)產(chǎn)生的D-異抗壞血酸的量。將所產(chǎn)生的D-異抗壞血酸的量概括地列于表2中。
表2
*產(chǎn)品號(hào)碼實(shí)施例5由酸熱脂環(huán)酸桿菌的具有α-淀粉酶活性的酶進(jìn)行的2-酮基-D-葡糖酸向D-異抗壞血酸的轉(zhuǎn)化對(duì)實(shí)施例2中由酸熱脂環(huán)酸桿菌純化得到的酶進(jìn)行的2-酮基-D-葡糖酸向D-異抗壞血酸的轉(zhuǎn)化進(jìn)行了試驗(yàn)。該反應(yīng)混合物在20μl中包含5％2-酮基-D-葡糖酸半鈣鹽(用HCl將pH調(diào)至2.5)和酶(0或200μg/ml)。將該反應(yīng)在厭氧條件下在70℃下進(jìn)行21小時(shí)。用實(shí)施例4所述的方法對(duì)D-異抗壞血酸進(jìn)行分析。通過(guò)由含和不含酶的反應(yīng)液所獲得的結(jié)果之間的差異來(lái)測(cè)定生物學(xué)產(chǎn)生的D-異抗壞血酸的量。含酶的反應(yīng)液產(chǎn)生了76.0mg/l的D-異抗壞血酸。
權(quán)利要求
1.一種由2-酮基-L-古洛糖酸制備L-抗壞血酸或由2-酮基-D-葡糖酸制備D-異抗壞血酸的方法，其包括分別將含有2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸的溶液與α-淀粉酶或具有α-淀粉酶活性的酶進(jìn)行接觸。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的溶劑是一種選自水、醇以及其混合物的水性溶劑。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在0℃至120℃的溫度范圍內(nèi)與酶進(jìn)行接觸的。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在20℃至100℃的溫度范圍內(nèi)與酶進(jìn)行接觸的。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在37℃至90℃的溫度范圍內(nèi)與酶進(jìn)行接觸的。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在1.5至12的pH范圍內(nèi)與酶進(jìn)行接觸的。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在1.5至8的pH范圍內(nèi)與酶進(jìn)行接觸的。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在2至7的pH范圍內(nèi)與酶進(jìn)行接觸的。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸選自游離酸和金屬鹽。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中2-酮基-L-古洛糖酸或2-酮基-D-葡糖酸是在37℃至90℃的溫度范圍內(nèi)和在2至7的pH范圍內(nèi)與具有α-淀粉酶活性的酶進(jìn)行接觸的。
全文摘要
一種通過(guò)分別將2－酮基－L－古洛糖酸或2－酮基－D－葡糖酸與具有α－淀粉酶活性的酶在溶液中進(jìn)行接觸來(lái)由2－酮基－L－古洛糖酸生產(chǎn)L－抗壞血酸或由2－酮基－D－葡糖酸生產(chǎn)D－異抗壞血酸的方法。用于這種反應(yīng)的溶劑可以是水、含水醇、有機(jī)溶劑或其混合物。在各種情況中，起始材料可以是游離酸、鈉鹽或鈣鹽的形式。
文檔編號(hào)C12P17/04GK1585824SQ02822259
公開(kāi)日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2002年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月9日
發(fā)明者星野立夫, 達(dá)也喜安, 真城正子 申請(qǐng)人:Dsm Ip 資產(chǎn)有限公司