本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)液，具體是一種在體外環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞（包括腫瘤細(xì)胞系、永生化細(xì)胞系和正常細(xì)胞系等），可誘導(dǎo)細(xì)胞連續(xù)不斷產(chǎn)生大量干細(xì)胞小球（spheroids）的干細(xì)胞小球誘導(dǎo)培養(yǎng)液。

背景技術(shù)：
干細(xì)胞—尤其是腫瘤干細(xì)胞的研究已成為全球腫瘤研究的熱點(diǎn)。目前，干細(xì)胞的分選基本上均利用流式細(xì)胞儀結(jié)合干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志物來進(jìn)行的，但干細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境下極容易分化。在體外培養(yǎng)環(huán)境下，干細(xì)胞比較明確的特點(diǎn)是表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物，并能形成干細(xì)胞小球。干細(xì)胞小球是由一個(gè)異質(zhì)化的細(xì)胞群組成：包括原始干細(xì)胞、祖細(xì)胞及部分已經(jīng)分化的細(xì)胞。干細(xì)胞小球是具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)展現(xiàn)的一種表型。迄今為止，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道使用培養(yǎng)液在體外培養(yǎng)環(huán)境下誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生干細(xì)胞小球。缺氧與干細(xì)胞的關(guān)系非常密切。缺氧微環(huán)境可促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞表型，維持干細(xì)胞于一定數(shù)目并抑制干細(xì)胞的分化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明就是為了解決使用培養(yǎng)液在體外培養(yǎng)環(huán)境下，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生干細(xì)胞小球的題，而提供一種干細(xì)胞小球誘導(dǎo)培養(yǎng)液及干細(xì)胞小球培養(yǎng)方法。本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。一種干細(xì)胞小球誘導(dǎo)培養(yǎng)液，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液是將氯化鈷（Cobaltchloride，CoCl2）142.758-285.516mg，紫杉醇2.135-4.27μg，胎牛血清100-200ml，雙抗生素10ml,室溫下混合于EMEM培養(yǎng)基中至1000ml，經(jīng)0.2μ的過濾器過濾、滅菌制成。所述干細(xì)胞小球誘導(dǎo)培養(yǎng)液，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液是將氯化鈷氯化鈷214.137mg，紫杉醇2.989μg，胎牛血清100ml，雙抗生素10ml,室溫下混合于EMEM培養(yǎng)基中至1000ml，經(jīng)0.2μ的過濾器過濾、滅菌制成。一種干細(xì)胞小球培養(yǎng)方法，其是按以下步驟進(jìn)行的：a.體外原培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞生長至融合度達(dá)到90%，改用混合培養(yǎng)液培養(yǎng)，并在二氧化碳培養(yǎng)箱中第一次缺氧培養(yǎng)12-96小時(shí)，直至90%的細(xì)胞發(fā)生死亡；所述混合培養(yǎng)液是按原培養(yǎng)液:干細(xì)胞小球誘導(dǎo)培養(yǎng)液為2:1的混合而成；b.待貼壁的培養(yǎng)細(xì)胞約只剩下10%時(shí)，去除含有死亡細(xì)胞的培養(yǎng)液，貼壁細(xì)胞經(jīng)1×PBS洗滌2次，加入原培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3-10天，使剩下的貼壁細(xì)胞重新增殖，待增殖的細(xì)胞密度達(dá)到90%后，重新更換混合培養(yǎng)液，并進(jìn)行第二次缺氧培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞洗滌后，原培養(yǎng)液中再次增殖，細(xì)胞密度達(dá)到90%，收集懸浮的干細(xì)胞小球。所述干細(xì)胞小球培養(yǎng)方法，其第二次缺氧培養(yǎng)后，貼壁細(xì)胞洗滌，原培養(yǎng)液中再次增殖，待細(xì)胞密度達(dá)到90%后，移去培養(yǎng)瓶中的原培養(yǎng)液，經(jīng)磷酸鹽緩沖溶液洗滌后，用0.5%-2.5%胰酶消化細(xì)胞，然后再加入不含血清的原培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞12小時(shí)，在培養(yǎng)瓶中收集懸浮的干細(xì)胞小球。這樣設(shè)計(jì)的本發(fā)明，在體外環(huán)境下誘導(dǎo)細(xì)胞連續(xù)不斷產(chǎn)生大量干細(xì)胞小球，這些干細(xì)胞小球能表達(dá)明確的干細(xì)胞標(biāo)志物：CD44，CD133，OCT3/4，Nanog，SOX-2和ABCG2等正?；蛘吣[瘤干細(xì)胞標(biāo)志物。附圖說明圖1是永生化細(xì)胞系NOF151hT細(xì)胞干細(xì)胞小球結(jié)構(gòu)圖；圖2是永生化細(xì)胞系NOF151p53ihT干細(xì)胞小球結(jié)構(gòu)圖；圖3是成纖維細(xì)胞系WI-38干細(xì)胞小球結(jié)構(gòu)圖；圖4是成纖維細(xì)胞系BJ干細(xì)胞小球結(jié)構(gòu)圖；圖5是乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞干細(xì)胞小球結(jié)構(gòu)圖；圖6是乳腺癌細(xì)胞系BT-549細(xì)胞干細(xì)胞小球結(jié)構(gòu)圖；圖7是卵巢癌細(xì)胞系HEY細(xì)胞干細(xì)胞小球結(jié)構(gòu)圖；圖8是懸浮生長的卵巢癌細(xì)胞系HEY干細(xì)胞小球結(jié)構(gòu)圖；圖9是卵巢癌細(xì)胞SKOv3細(xì)胞干細(xì)胞小球結(jié)構(gòu)圖；圖10是人造腫瘤細(xì)胞細(xì)胞系FTE187SV40hTHras細(xì)胞干細(xì)胞小球結(jié)構(gòu)圖；圖11是NOF151hT細(xì)胞干細(xì)胞小球染色圖；圖12是NOF151p53ihT細(xì)胞干細(xì)胞小球染色圖；圖13是BT-549干細(xì)胞小球干細(xì)胞CD44免疫組化染色圖；圖14是BT-549干細(xì)胞小球干細(xì)胞CD133免疫組化染色圖；圖15是BT-549干細(xì)胞小球干細(xì)胞SOX-2免疫組化染色圖；圖16是MDA-MB-231干細(xì)胞小球OCT3/4免疫熒光染色陽性圖；圖17是MDA-MB-231干細(xì)胞小球Nanog免疫熒光染色陽性圖；圖18是MDA-MB-231干細(xì)胞小球SOX-2免疫熒光染色陽性圖；圖19是MDA-MB-231干細(xì)胞小球ABCG2免疫熒光染色陽性圖；圖20是SKOv3干細(xì)胞小球OCT3/4免疫熒光染色陽性圖；圖21是SKOv3干細(xì)胞小球Nanog免疫熒光染色陽性圖；圖22是SKOv3干細(xì)胞小球SOX-2免疫熒光染色陽性圖；圖23是SKOv3干細(xì)胞小球ABCG2免疫熒光染色陽性圖；圖24是HEY干細(xì)胞小球干細(xì)胞CD44免疫組化染色圖；圖25是HEY干細(xì)胞小球干細(xì)胞CD133免疫組化染色圖；圖26是HEY干細(xì)胞小球干細(xì)胞OCT3/4免疫熒光染圖色；圖27是HEY干細(xì)胞小球干細(xì)胞Nanog免疫熒光染圖色；圖28是HEY干細(xì)胞小球干細(xì)胞.SOX-2免疫熒光染色圖；圖29是HEY干細(xì)胞小球干細(xì)胞ABCG2免疫熒光染色圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。一.一種干細(xì)胞小球誘導(dǎo)培養(yǎng)液，其是按以下配比的原料制成的，將氯化鈷（Cobaltchloride，CoCl2）142.758-285.516mg，紫杉醇2.135-4.27μg，胎牛血清100-200ml，雙抗生素10ml,室溫下混合于EMEM培養(yǎng)基中至1000ml，經(jīng)0.2μ的過濾器過濾、滅菌制成。所述干細(xì)胞小球誘導(dǎo)培養(yǎng)液，其是按以下配比的原料制成的，將氯化鈷氯化鈷214.137mg，紫杉醇2.989μg，胎牛血清100ml，雙抗生素10ml,室溫下混合于EMEM培養(yǎng)基中至1000ml，經(jīng)0.2μ的過濾器過濾、滅菌制成。二.干細(xì)胞小球的培養(yǎng)方法1.乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞干細(xì)胞小球或BT-549細(xì)胞干細(xì)胞小球的培養(yǎng)：體外正常培養(yǎng)環(huán)境下DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞，或BT-549細(xì)胞干細(xì)胞小球，待細(xì)胞生長至融合度達(dá)到90%；更換混合培養(yǎng)液，混合培養(yǎng)液是按照DMEM培養(yǎng)液:誘導(dǎo)培養(yǎng)液為2:1的比例配制，即DMEM培養(yǎng)液3.34ml，誘導(dǎo)培養(yǎng)液1.67ml；在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-96小時(shí)，直至90%左右的細(xì)胞發(fā)生死亡。每隔6-12小時(shí)顯微鏡下觀察一次，待MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變時(shí)，利用移液管小心去除混合培養(yǎng)液，使用磷酸鹽緩沖溶液(1×PBS)洗滌2次，然后加入適量的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，隨后的1-2天內(nèi)將出現(xiàn)大量死亡而漂浮在培養(yǎng)液中；大約3-10天，剩下貼壁細(xì)胞重新增殖，待增殖的細(xì)胞密度達(dá)到90%后重新更換成混合培養(yǎng)液，按照上述方法重復(fù)處理一次。待第二次處理后的細(xì)胞密度達(dá)到90%后，此時(shí)MDA-MB-231細(xì)胞中即可見到數(shù)量不等的干細(xì)胞小球。如果培養(yǎng)瓶中未見干細(xì)胞小球，按照上述方法重復(fù)處理1-2次。如果難以見到明確的干細(xì)胞小球，則在第二次處理細(xì)胞后待細(xì)胞密度達(dá)到90%后，移去培養(yǎng)瓶中的混合培養(yǎng)液，1×PBS洗滌后使用2.5%胰酶1ml消化細(xì)胞，然后，再加入不含血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，12小時(shí)后可在培養(yǎng)瓶中見到大量懸浮的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞干細(xì)胞小球，或BT-549細(xì)胞干細(xì)胞小球。如圖5、6、13-19所示。2.卵巢癌細(xì)胞系HEY細(xì)胞干細(xì)胞小球、SKOv3細(xì)胞干細(xì)胞小球或人造腫瘤細(xì)胞細(xì)胞系FTE187SV40hTHras細(xì)胞干細(xì)胞小球的培養(yǎng)：體外正常培養(yǎng)環(huán)境下RPMI-16培養(yǎng)液培養(yǎng)HEY細(xì)胞，或SKOv3細(xì)胞，或FTE187SV40hTHras細(xì)胞，待細(xì)胞生長至融合度達(dá)到90%；更換混合培養(yǎng)液，混合培養(yǎng)液是按照RPMI-16培養(yǎng)液:誘導(dǎo)培養(yǎng)液為2:1的比例配制，即RPMI-16培養(yǎng)液3.34ml，誘導(dǎo)培養(yǎng)液1.67ml；在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-96小時(shí)，直至90%左右的細(xì)胞發(fā)生死亡。每隔6-12小時(shí)顯微鏡下觀察一次，待培養(yǎng)的HEY細(xì)胞，或SKOv3細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變時(shí)，利用移液管小心去除混合培養(yǎng)液，使用磷酸鹽緩沖溶液(1×PBS)洗滌2次，然后加入適量的RPMI-16培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，隨后的1-2天內(nèi)將出現(xiàn)大量死亡而漂浮在培養(yǎng)液中；大約3-10天，剩下貼壁細(xì)胞重新增殖，待增殖的細(xì)胞密度達(dá)到90%后重新更換成混合培養(yǎng)液，按照上述方法重復(fù)處理一次。待第二次處理后的細(xì)胞密度達(dá)到90%后，此時(shí)HEY細(xì)胞中即可見到數(shù)量不等的干細(xì)胞小球。如果培養(yǎng)瓶中未見干細(xì)胞小球，按照上述方法重復(fù)處理1-2次。如果難以見到明確的干細(xì)胞小球，則在第二次處理細(xì)胞后待細(xì)胞密度達(dá)到90%后，移去培養(yǎng)瓶中的混合培養(yǎng)液，1×PBS洗滌后使用2%胰酶2ml消化細(xì)胞，然后，再加入不含血清的RPMI-16培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，12小時(shí)后可在培養(yǎng)瓶中見到大量懸浮的卵巢癌細(xì)胞系HEY細(xì)胞干細(xì)胞小球，或SKOv3細(xì)胞干細(xì)胞小球，或FTE187SV40hTHras細(xì)胞干細(xì)胞小球。如圖7-10，20-29所示。3.永生化細(xì)胞系NOF151hT細(xì)胞干細(xì)胞小球和NOF151p53ihT細(xì)胞干細(xì)胞小球的培養(yǎng)：體外正常培養(yǎng)環(huán)境下Media199/MCDB205培養(yǎng)液培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞，待細(xì)胞生長至融合度達(dá)到90%；更換混合培養(yǎng)液，混合培養(yǎng)液按照Media199/MCDB205培養(yǎng)液:誘導(dǎo)培養(yǎng)液為2:1的比例配制，即Media199/MCDB205培養(yǎng)液3.34ml，誘導(dǎo)培養(yǎng)液1.67ml；在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-96小時(shí)，直至90%左右的細(xì)胞發(fā)生死亡。培養(yǎng)時(shí)間長短取決于不同細(xì)胞系的耐受程度程度。培養(yǎng)的時(shí)間長短需要預(yù)實(shí)驗(yàn)判定，此外，通過增加誘導(dǎo)培養(yǎng)液的濃度可適當(dāng)縮短培養(yǎng)時(shí)間。每隔6-12小時(shí)顯微鏡下觀察一次，待培養(yǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變時(shí)，利用移液管小心去除混合培養(yǎng)液，使用1×PBS洗滌2次，然后加入適量的Media199/MCDB205培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，隨后的1-2天內(nèi)某些類型的細(xì)胞系將出現(xiàn)大量死亡而漂浮在培養(yǎng)液中；大約3-10天，剩下貼壁細(xì)胞重新增殖，待增殖的細(xì)胞密度達(dá)到90%后重新更換成混合培養(yǎng)液，按照上述方法重復(fù)處理一次。待第二次處理后的細(xì)胞密度達(dá)到90%后，此時(shí)可見到數(shù)量不等的NOF151hT細(xì)胞干細(xì)胞小球或NOF151p53ihT細(xì)胞干細(xì)胞小球。如果培養(yǎng)瓶中未見干細(xì)胞小球，按照上述方法重復(fù)處理1-2次。如果仍難以見到明確的干細(xì)胞小球，則在第二次處理細(xì)胞后待細(xì)胞密度達(dá)到90%后移去培養(yǎng)瓶中的混合培養(yǎng)基，1×PBS洗滌后使用2.5%胰酶1ml消化細(xì)胞，然后，再加入不含血清的Media199/MCDB205培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，12小時(shí)后可在培養(yǎng)瓶中見到大量懸浮的NOF151hT細(xì)胞干細(xì)胞小球，或NOF151p53ihT細(xì)胞干細(xì)胞小球。如圖1、2、11、12所示。4.成纖維細(xì)胞系WI-38干細(xì)胞小球或BJ干細(xì)胞小球的培養(yǎng)：體外正常培養(yǎng)環(huán)境下DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞系WI-38細(xì)胞，或成纖維細(xì)胞系BJ細(xì)胞，待細(xì)胞生長至融合度達(dá)到90%；更換混合培養(yǎng)液，混合培養(yǎng)液按照DMEM/F12培養(yǎng)液:誘導(dǎo)培養(yǎng)液為2:1的比例配制，即DMEM/F12培養(yǎng)液3.34ml，誘導(dǎo)培養(yǎng)液1.67ml；在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-96小時(shí)，直至90%左右的細(xì)胞發(fā)生死亡。每隔6-12小時(shí)顯微鏡下觀察一次，待培養(yǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變時(shí)，利用移液管小心去除混合培養(yǎng)液，使用1×PBS洗滌2次，然后加入適量的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，隨后的1-2天內(nèi)某些類型的細(xì)胞系將出現(xiàn)大量死亡而漂浮在培養(yǎng)液中；大約3-10天，剩下貼壁細(xì)胞重新增殖，待增殖的細(xì)胞密度達(dá)到90%后重新更換成混合培養(yǎng)液，按照上述方法重復(fù)處理一次。待第二次處理后的細(xì)胞密度達(dá)到90%后，此時(shí)可見到數(shù)量不等的WI-38細(xì)胞干細(xì)胞小球，或BJ細(xì)胞干細(xì)胞小球。如果培養(yǎng)瓶中未見干細(xì)胞小球，按照上述方法重復(fù)處理1-2次。如果仍難以見到明確的干細(xì)胞小球，則在第二次處理細(xì)胞后待細(xì)胞密度達(dá)到90%后移去培養(yǎng)瓶中的混合培養(yǎng)基，1×PBS洗滌后使用2.5%胰酶1ml消化細(xì)胞，然后，再加入不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，12小時(shí)后可在培養(yǎng)瓶中見到大量懸浮的WI-38細(xì)胞干細(xì)胞小球，或BJ細(xì)胞干細(xì)胞小球。如圖3、4所示。上述實(shí)施例中這些干細(xì)胞小球能表達(dá)明確的干細(xì)胞標(biāo)志物：CD44，CD133，OCT3/4，Nanog，SOX-2和ABCG2等正常或者腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物。