本發(fā)明屬于獸用生物制品技術領域，具體涉及一種df-1細胞培養(yǎng)液添加劑及其制備方法、使用方法。
背景技術：
df-1細胞來源于ell雞胚胎，是一種可傳代的雞成纖維細胞系，該細胞無禽白血病病毒，肉瘤病毒內源性基因，同時在形態(tài)上呈纖維狀。df-1細胞系還是一種穩(wěn)定的、無腫瘤基因、自發(fā)無限增殖的細胞系。目前已被廣泛用于動物病毒研究、疫苗研制、癌癥研究等諸多領域，是生命科學領域重要的病毒轉染、培養(yǎng)生物材料。
在傳統(tǒng)的df-1細胞培養(yǎng)中，胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)一直被作為細胞培養(yǎng)基添加劑，但其在使用中存在諸多缺點：具有批間差異、成分不明確、有抑制生長的成分、不利于疫苗和單克隆抗體等目的產(chǎn)品的分離純化、容易被病毒和支原體感染；價格昂貴，需要大量驗證工作、使用不方便、貨源緊張，來源不穩(wěn)定等問題，還有隨著來自動物保護組織的壓力，因此，胎牛血清將逐步被無血清培養(yǎng)基取代，無血清培養(yǎng)基是加入成分明確的血清替代成分，既能滿足細胞的培養(yǎng)要求，又能有效避免因使用血清帶來的諸多不利因素，因而無血清培養(yǎng)基得到了越來越普遍的應用。
無血清培養(yǎng)基是以合成培養(yǎng)基為基礎加入不同劑量的生長因子、結合蛋白、激素、低分子量營養(yǎng)物質（維生素、微量元素、脂類等），起到替代動物血清支持細胞正常生長代謝的作用。
技術實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明目的在于設計提供一種df-1細胞培養(yǎng)液添加劑及其制備方法、使用方法的技術方案。
所述的一種df-1細胞培養(yǎng)液添加劑，其特征在于每1000mlpbs溶液中含有以下組分：紅芪多糖10-30mg、柚皮素5-15mg、黃芪皂苷5-15mg、菟絲子提取物10-20mg、腐胺1-10mg和谷胱甘肽5-20mg。
所述的一種df-1細胞培養(yǎng)液添加劑，其特征在于每1000mlpbs溶液中含有以下組分：紅芪多糖15-25mg、柚皮素8-12mg、黃芪皂苷8-12mg、菟絲子提取物12-18mg、腐胺2-8mg和谷胱甘肽12-18mg。
所述的一種df-1細胞培養(yǎng)液添加劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟：將所述重量份的組分混合后，加入到盛有pbs溶液中，邊加邊攪拌，直至完全溶解，補pbs溶液至1000ml，即得。
所述的df-1細胞培養(yǎng)液添加劑的使用方法，其特征在于按照藥物混合液：dmem/f12重量比=1:1~1:2將兩者充分混合后使用。
本發(fā)明中中紅芪多糖購買于：西安天瑞生物技術有限公司；柚皮素購買于：武漢易泰科技有限公司；黃芪皂苷購買于：海佰世凱化學科技有限公司；菟絲子提取物購買于：西安原生植物工程技術有限公司；腐胺購買于：sigma；谷胱甘肽mg購買于：sigma。
本發(fā)明具有以下有益效果：
1、本發(fā)明所制備的df-1細胞培養(yǎng)液添加劑，可替代血清，大幅度降低生產(chǎn)成本，保證了疫苗的質量和安全性。
2、本發(fā)明所制備的df-1細胞培養(yǎng)液添加劑，可以大大提高細胞的生長速度。
3、本發(fā)明所制備的df-1細胞培養(yǎng)液添加劑，可以促進雞傳染性法氏囊病毒對df-1細胞的感染敏感性，提高其病毒含量，從而提高雞傳染性法氏囊活疫苗的免疫原性。
具體實施方式
為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按常規(guī)實驗方法進行。
實施例1：培養(yǎng)液添加劑的制備
紅芪多糖：10mg（購買于：西安天瑞生物技術有限公司）
柚皮素：5mg（購買于：武漢易泰科技有限公司）
黃芪皂苷：5mg（購買于：海佰世凱化學科技有限公司）
菟絲子提取物:10mg（購買于：西安原生植物工程技術有限公司）
腐胺：1mg（購買于：sigma）
谷胱甘肽:5mg（購買于：sigma）
將以上各種成分混合后，加入到盛有一定量的pbs溶液中，邊加邊攪拌，直至完全溶解，補pbs溶液至1000ml，按照藥物混合液：dmem/f12=1:1制備一種df-1細胞培養(yǎng)液添加劑，兩者充分混合，并經(jīng)過0.22um細菌濾器進行過濾除菌，之后進行分裝備用。
實施例2：培養(yǎng)液添加劑的制備
紅芪多糖：12mg（購買于：西安天瑞生物技術有限公司）
柚皮素：8mg（購買于：武漢易泰科技有限公司）
黃芪皂苷：6mg（購買于：海佰世凱化學科技有限公司）
菟絲子提取物:12mg（購買于：西安原生植物工程技術有限公司）
腐胺：5mg（購買于：sigma）
谷胱甘肽：8mg（購買于：sigma）
將以上各種成分混合后，加入到盛有一定量的pbs溶液中，邊加邊攪拌，直至完全溶解，補pbs溶液至1000ml，按照藥物混合液：dmem/f12=1:1.5制備一種df-1細胞培養(yǎng)液添加劑，兩者充分混合，并經(jīng)過0.22um細菌濾器進行過濾除菌，之后進行分裝備用。
實施例3：培養(yǎng)液添加劑的制備
紅芪多糖：30mg（購買于：西安天瑞生物技術有限公司）
柚皮素：15mg（購買于：武漢易泰科技有限公司）
黃芪皂苷：15mg（購買于：海佰世凱化學科技有限公司）
菟絲子提取物：20mg（購買于：西安原生植物工程技術有限公司）
腐胺：10mg（購買于：sigma）
谷胱甘肽:20mg（購買于：sigma）
將以上各種成分混合后，加入到盛有一定量的pbs溶液中，邊加邊攪拌，直至完全溶解，補pbs溶液至1000ml，按照藥物混合液：dmem/f12=1:2制備一種df-1細胞培養(yǎng)液添加劑，兩者充分混合，并經(jīng)過0.22um細菌濾器進行過濾除菌，之后進行分裝備用。
試驗例1本發(fā)明培養(yǎng)液添加劑的應用
1材料
1.1df-1細胞培養(yǎng)液添加劑
按本發(fā)明實施例1-3制得
1.2dmem/f12基礎培養(yǎng)基、胎牛血清購于gibco公司，
硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(tg)、胰酪蛋白胨培養(yǎng)基（tsb）購于北京中海生物科技有限公司
1.3df-1細胞購于atcc，由浙江美保龍生物技術有限公司保存
1.4雞傳染性法氏囊病毒（d78株/b87株），購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
1.5試驗雞14日齡spf雞60只，購于青島易邦生物技術有限公司實驗動物中心
2方法
2.1培養(yǎng)基檢驗
2.1.1無菌檢驗
將實施例1-3制備的df-1細胞培養(yǎng)液添加劑，各取3個不同批次進行無菌檢驗，每個批次分別取1ml接種于2支50mltg大管中，1支置于35-37℃培養(yǎng)，1支置于23-25℃培養(yǎng)，3d后各吸取培養(yǎng)物分別接種于10個tg小管，再分別置于35-37℃和23-25℃培養(yǎng)，另外每個批次分別取0.2ml接種于tsb小管內，置于23-25℃培養(yǎng)，同時做陰性對照，均培養(yǎng)7日，觀察結果。
2.1.2內毒素測定
將實施例1-3制備的df-1細胞培養(yǎng)液添加劑，各取3個不同批次進行內毒素檢驗，每個批次分別取1.7ml用鱟試劑盒分別進行檢測，用酶標儀選擇波長405nm測其od值，同時做陰性對照。
2.2細胞生長速度測定
由實施例1-3使用的df-1細胞培養(yǎng)液添加劑，以及含8%、10%胎牛血清的dmem/f12完全培養(yǎng)液分別將已消化好的df-1細胞，稀釋成3*104個/ml的細胞密度接種于24孔培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)液體積為2ml，每種培養(yǎng)基接種1塊24孔培養(yǎng)板，置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d后，用0.25%(w/v)的胰蛋白酶溶液消化用不同培養(yǎng)液培養(yǎng)的df-1細胞細胞各4個培養(yǎng)孔，用cedexas-20細胞密度和活力自動分析儀計數(shù)細胞密度和活力。
2.3病毒培養(yǎng)
用dmem/f12基礎培養(yǎng)基將雞傳染性法氏囊病毒（d78株/b87株）稀釋成1500tcid50/ml，分別接種于由2.2培養(yǎng)的5種細胞中，分別置于37℃、5%co2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90h之后進行收毒。
2.4tcid50測定
分別將由實施例1-3制備的df-1細胞培養(yǎng)液添加劑培養(yǎng)的細胞、含8%、10%fbs的dmem/f12培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞，均稀釋成105～106個/ml，按0.2ml/孔轉入96孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，棄掉培養(yǎng)液上清，將2.3收獲的雞傳染性法氏囊病毒（d78株/b87株）分別用dmem/f12基礎培養(yǎng)基作連續(xù)的10倍稀釋，按0.2ml/孔接種，置于37℃，5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d，每天觀察細胞病變并記錄，按reed-muench法計算tcid50。
2.5免疫原性測定
將2.3收獲的五種病毒液經(jīng)檢驗合格，加入佐劑后制作成疫苗成品測定疫苗的免疫原性。將60只14日齡的spf雞共分為6組，每組10只，第ⅰ組采用經(jīng)本發(fā)明實施例1制備的培養(yǎng)液添加劑，用于培養(yǎng)df-1細胞繁殖雞傳染性法氏囊病毒，經(jīng)加工處理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，進行胸肌注射免疫；第ⅱ組采用經(jīng)本發(fā)明實施例2制備的培養(yǎng)液添加劑，用于培養(yǎng)df-1細胞繁殖雞傳染性法氏囊病毒，經(jīng)加工處理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，進行胸肌注射免疫；第ⅲ組采用經(jīng)本發(fā)明實施例3制備的培養(yǎng)液添加劑，用于培養(yǎng)df-1細胞繁殖雞傳染性法氏囊病毒，經(jīng)加工處理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，進行胸肌注射免疫；第ⅳ組采用含10%fbs培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)df-1細胞繁殖雞傳染性法氏囊病毒，經(jīng)加工處理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，進行胸肌注射免疫；第ⅴ組采用含8%fbs培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)df-1細胞繁殖雞傳染性法氏囊病毒，經(jīng)加工處理后制成的疫苗，按照0.2ml/只，進行胸肌注射免疫。第ⅳ組，疫苗對照組，不進行免疫。各組均在免疫后第7d、14d、21d、28d、35d、45d、49d分別翅靜脈采血并分離血清，用elisa方法進行測定ibdv的抗體水平。
3結果
3.1檢驗結果
表1無菌檢驗結果
表2內毒素檢驗結果（405nm）
由表1、表2可以看出，由實施例1、2、3制備的不同批次的培養(yǎng)基添加劑均既無菌生長又不含內毒素，該方法制備的培養(yǎng)基添加劑安全可靠。
3.2細胞密度及活力測定結果
表3細胞密度測定結果
由表3可以看出，由實施例1、2、3制備的培養(yǎng)基添加劑培養(yǎng)的df-1細胞密度明顯大于含fbs培養(yǎng)基培養(yǎng)的df-1細胞。
表4細胞活率測定結果
由表4可以看出，在相同的培養(yǎng)時間內，由實施例1、2、3制備的培養(yǎng)基添加劑培養(yǎng)的df-1細胞存活率明顯大于由含fbs培養(yǎng)基培養(yǎng)的df-1細胞。
3.3tcid50測定結果
表5tcid50測定結果
由表5可以看出，由實施例1、2、3制備的培養(yǎng)基添加劑培養(yǎng)的df-1細胞比由含fbs培養(yǎng)基培養(yǎng)的df-1細胞更有利于ibdv的繁殖，敏感性更強。
3.4免疫原性測定結果
表6ibdv的抗體水平測定結果
由表6可以看出，ⅰ、ⅱ、ⅲ組的抗體水平明顯高于ⅳ、ⅴ組，由實施例1、2、3制備的添加劑培養(yǎng)的ibdv的免疫原性高于含fbs培養(yǎng)基培養(yǎng)的ibdv。
4結論
綜上所述，本發(fā)明所使用的df-1細胞培養(yǎng)液添加劑，在可以大大提高細胞的生長速度的前提下，一方面能增強雞傳染性法氏囊病毒對df-1細胞的敏感性，提高病毒的tcid50含量；另一方面，還可以增強雞傳染性法氏囊病毒活疫苗的免疫原性。