本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領域，具體涉及一種marc-145細胞培養(yǎng)液及其制備方法、使用方法。
背景技術(shù)：
marc-145細胞為上皮樣細胞，來源于恒河猴腎細胞，從母細胞ma-104克隆而得，可連續(xù)傳代培養(yǎng)，此細胞主要用于病毒的培養(yǎng)，特別是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(prrsv)對此細胞尤為敏感。
豬繁殖與呼吸綜合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，prrs)是一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。目前控制豬繁殖與呼吸綜合征病毒(prrsv)的主要方法是使用疫苗進行免疫防控，疫苗的質(zhì)量和安全性在很大程度上取決于疫苗的生產(chǎn)方式和過程，豬繁殖與呼吸綜合征疫苗通常是大規(guī)模培養(yǎng)細胞收獲病毒液，但目前多采用含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，血清組分的復雜性和不確定性，以及其中存在病毒等病原微生物污染的潛在風險，影響著病毒疫苗的生產(chǎn)工藝和疫苗質(zhì)量。從病毒疫苗生產(chǎn)工藝角度考慮，血清組分的復雜性和批次間的質(zhì)量差異增加了病毒疫苗生產(chǎn)的不穩(wěn)定性和產(chǎn)品質(zhì)量控制的難度；從病毒疫苗的安全性角度考慮，血清中潛在的病原微生物，給疫苗的使用帶來了不容忽視的安全隱患。
由使用血清所造成的細胞培養(yǎng)過程和細胞表達產(chǎn)物安全性的不確定因素增加的現(xiàn)實問題，成為動物細胞無血清培養(yǎng)技術(shù)研究和應用的發(fā)展動因。無血清培養(yǎng)液具有諸多優(yōu)勢：簡化下游目的產(chǎn)物的分離純化、節(jié)約成本；避免血清批次間的差異性，提高細胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性及結(jié)果的可靠性；避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染；無血清培養(yǎng)液由于添加成分相對確定，可用于研究細胞生長、增殖、分化、代謝及基因調(diào)控等研究。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明目的在于設計提供一種marc-145細胞培養(yǎng)液及其制備方法、使用方法的技術(shù)方案。
所述的一種marc-145細胞培養(yǎng)液，其特征在于每1000ml去離子水中含有以下組分：dmem粉末9-12g、胰島素生長因子1-20ug、甘氨酸鋅0.1-2g、亞硒酸鈉40-50umol、碳酸氫鈉1.5-3g、轉(zhuǎn)鐵蛋白5-15mg、人參皂苷0.1-0.2g、淫羊藿多糖10-20mg。
所述的一種marc-145細胞培養(yǎng)液，其特征在于每1000ml去離子水中含有以下組分：dmem粉末10-12g、胰島素生長因子5-15ug、甘氨酸鋅0.5-1.5g、亞硒酸鈉42-48umol、碳酸氫鈉1.8-2.6g、轉(zhuǎn)鐵蛋白8-12mg、人參皂苷0.1-0.2g、淫羊藿多糖12-18mg。
所述的一種marc-145細胞培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于包括以下步驟：取所述重量的組分，加入到去離子水中，邊加邊攪拌，直至完全溶解，然后補去離子水定量1000ml，并經(jīng)過0.22um細菌濾器進行過濾除菌，之后進行分裝備用。
所述的一種marc-145細胞培養(yǎng)液的使用方法，其特征在于包括以下步驟：marc-145細胞采用微載體懸浮培養(yǎng)方式進行培養(yǎng)，在500ml攪拌瓶中加入50-80ml細胞培養(yǎng)液按3-5g/l加入微載體用量，按3×105-5×105個/ml初始細胞密度接種，以25-50r/min的攪拌速度進行攪拌，置于37℃下培養(yǎng)72-80h，按1:3-1:5進行傳代培養(yǎng)。
所述的一種marc-145細胞培養(yǎng)液的使用方法，其特征在于將prrsv接入到marc-145細胞微載體培養(yǎng)物，以25-50r/min的攪拌速度進行攪拌，置于37℃下培養(yǎng)48-56h后進行收獲病毒液。
本發(fā)明中各組分均為現(xiàn)有產(chǎn)品，其中dmem粉末、胰島素生長因子購買于sigma；轉(zhuǎn)鐵蛋白購買于上海源葉生物科技有限公司；人參皂苷購買于武漢福鑫化工有限公司；淫羊藿多糖購買于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。
本發(fā)明具有以下有益效果：
1、本發(fā)明所制備的marc-145細胞培養(yǎng)液，為無添加血清培養(yǎng)液，既可以大幅度降低生產(chǎn)成本，又保證了疫苗的質(zhì)量和安全性。
2、本發(fā)明所制備的marc-145細胞培養(yǎng)液，可以大大提高細胞的生長速度。
3、本發(fā)明所制備的marc-145細胞培養(yǎng)液，可以促進prrsv對marc-145細胞的感染敏感性，提高其病毒含量，從而提高豬繁殖與呼吸綜合癥疫苗的免疫原性。
4、本發(fā)明所制備的marc-145細胞培養(yǎng)液，對于marc-145細胞和prrsv均采用懸浮培養(yǎng)方式進行培養(yǎng)、增殖，大大提高繁殖效率。
具體實施方式
為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按常規(guī)實驗方法進行。
實施例1：培養(yǎng)液的制備
dmem粉末：9g(購買于：sigma)
胰島素生長因子:1g(購買于：sigma)
甘氨酸鋅：0.1g（購買于：上海勤聯(lián)化工有限公司）
亞硒酸鈉：40umol（購買于：亞厚化工貿(mào)易有限公司）
碳酸氫鈉：1.5g（購買于：昆山優(yōu)凈環(huán)保材料有限公司）
轉(zhuǎn)鐵蛋白：5mg（購買于：上海源葉生物科技有限公司）
人參皂苷:0.1g（購買于：武漢福鑫化工有限公司）
淫羊藿多糖:10mg（購買于：上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）
將以上各種成分充分混合，加入到去離子水中，邊加邊攪拌，直至完全溶解，然后補去離子水定量1000ml，并經(jīng)過0.22um細菌濾器進行過濾除菌，之后進行分裝備用。
實施例2：培養(yǎng)液的制備
dmem粉末：10g(購買于：sigma)
胰島素生長因子：5ug(購買于：sigma)
甘氨酸鋅：0.5g（購買于：上海勤聯(lián)化工有限公司）
亞硒酸鈉：42umol（購買于：亞厚化工貿(mào)易有限公司）
碳酸氫鈉：1.8g（購買于：昆山優(yōu)凈環(huán)保材料有限公司）
轉(zhuǎn)鐵蛋白：8mg（購買于：上海源葉生物科技有限公司）
人參皂苷:0.1g（購買于：武漢福鑫化工有限公司）
淫羊藿多糖:12mg（購買于：上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）
將以上各種成分充分混合，加入到去離子水中，邊加邊攪拌，直至完全溶解，然后補去離子水定量1000ml，并經(jīng)過0.22um細菌濾器進行過濾除菌，之后進行分裝備用。
實施例3：培養(yǎng)液的制備
dmem粉末：12g(購買于：sigma)
胰島素生長因子：20ug(購買于：sigma)
甘氨酸鋅：2g（購買于：上海勤聯(lián)化工有限公司）
亞硒酸鈉：50umol（購買于：亞厚化工貿(mào)易有限公司）
碳酸氫鈉：3g（購買于：昆山優(yōu)凈環(huán)保材料有限公司）
轉(zhuǎn)鐵蛋白：15mg（購買于：上海源葉生物科技有限公司）
人參皂苷:0.2g（購買于：武漢福鑫化工有限公司）
淫羊藿多糖:20mg（購買于：上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）
將以上各種成分充分混合，加入到去離子水中，邊加邊攪拌，直至完全溶解，然后補去離子水定量1000ml，并經(jīng)過0.22um細菌濾器進行過濾除菌，之后進行分裝備用。
試驗例本發(fā)明培養(yǎng)液的應用
1材料
1.1marc-145細胞培養(yǎng)液
按本發(fā)明實施例1-3制得
1.2dmem基礎培養(yǎng)液、胎牛血清購于gibco公司，
硫乙醇酸鹽培養(yǎng)液(tg)、胰酪蛋白胨培養(yǎng)液（tsb）購于北京中海生物科技有限公司
1.3marc-145細胞購于atcc，由浙江美保龍生物技術(shù)有限公司保存
1.4豬繁殖與呼吸綜合征病毒，購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
1.5試驗用豬28日齡健康斷奶仔豬，elisa檢測prrsv抗體均為陰性
2方法
2.1培養(yǎng)液檢驗
2.1.1無菌檢驗
將實施例1-3制備的marc-145細胞培養(yǎng)液，各取3個不同批次進行無菌檢驗，每個批次分別取1ml接種于2支50mltg大管中，1支置于35-37℃培養(yǎng)，1支置于23-25℃培養(yǎng)，3d后各吸取培養(yǎng)物分別接種于10個tg小管，再分別置于35-37℃和23-25℃培養(yǎng)，另外每個批次分別取0.2ml接種于tsb小管內(nèi)，置于23-25℃培養(yǎng)，同時做陰性對照，均培養(yǎng)7日，觀察結(jié)果。
2.1.2內(nèi)毒素測定
將實施例1-3制備的marc-145細胞培養(yǎng)液，各取3個不同批次進行內(nèi)毒素檢驗，每個批次分別取1.7ml用鱟試劑盒分別進行檢測，用酶標儀選擇波長405nm測其od值，同時做陰性對照。
2.2細胞培養(yǎng)及生長速度的測定
marc-145細胞采用微載體懸浮培養(yǎng)方式進行培養(yǎng)，在500ml攪拌瓶中分別加入50ml由實施例1-3制備的marc-145細胞培養(yǎng)液、含8%、10%fbs的完全培養(yǎng)液，按3g/l加入微載體用量，按3×105個/ml初始細胞密度接，以30r/min的攪拌速度進行攪拌，置于37℃下培養(yǎng)76h。
均勻吸取各微載體細胞培養(yǎng)樣品，按1000r/min離心去除培養(yǎng)上清后，用pbs清洗3次，經(jīng)0.25%胰酶溶液于37℃消化10min后獲得游離細胞。以臺盼藍染色法，用血球計數(shù)板分別計死、活細胞數(shù)，計算細胞密度及存活率。
2.3病毒培養(yǎng)
用dmem基礎培養(yǎng)液將prrsv稀釋成2000tcid50/ml，分別接種到由2.2培養(yǎng)的5種marc-145細胞微載體培養(yǎng)物中，以30r/min的攪拌速度進行攪拌，置于37℃下，培養(yǎng)培養(yǎng)50h后進行收毒。
2.4tcid50測定
分別將由實施例1-3制備的marc-145細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞、含8%、10%fbs的marc-145培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞，均稀釋成105～106個/ml，按0.2ml/孔轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，棄掉培養(yǎng)液上清，將2.3收獲的prrsv分別用dmem基礎培養(yǎng)液作連續(xù)10倍稀釋，按0.2ml/孔接種，置于37℃，5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d，每天觀察細胞病變并記錄，按reed-muench法計算tcid50。
2.5免疫原性測定
將2.3收獲的五種病毒液經(jīng)檢驗合格，經(jīng)滅活后制成疫苗測定疫苗的免疫原性。將60只28日齡的斷奶仔豬共分為6組，每組10只，第ⅰ組采用經(jīng)本發(fā)明實施例1制備的培養(yǎng)液，用于培養(yǎng)marc-145細胞繁殖prrsv，經(jīng)加工處理后制成的疫苗，按照1ml/頭，進行肌肉注射免疫；第ⅱ組采用經(jīng)本發(fā)明實施例2制備的培養(yǎng)液，用于培養(yǎng)marc-145細胞繁殖prrsv，經(jīng)加工處理后制成的疫苗，按照1ml/頭，進行肌肉注射免疫；第ⅲ組采用經(jīng)本發(fā)明實施例3制備的培養(yǎng)液，用于培養(yǎng)marc-145細胞繁殖prrsv，經(jīng)加工處理后制成的疫苗，按照1ml/頭，進行肌肉注射免疫；第ⅳ組采用含10%fbs培養(yǎng)液，用于培養(yǎng)marc-145細胞繁殖prrsv，經(jīng)加工處理后制成的疫苗，按照1ml/頭，進行肌肉注射免疫；第ⅴ組采用含8%fbs培養(yǎng)液，用于培養(yǎng)marc-145細胞繁殖prrsv，經(jīng)加工處理后制成的疫苗，按照1ml/頭，進行肌肉注射免疫。第ⅳ組，疫苗對照組，不進行免疫。各組均在首免第14d、21d、28d、42d、60d、90d、120d、180d采血并分離血清，用elisa方法進行測定各組的抗體水平。
3結(jié)果
3.1檢驗結(jié)果
表1無菌檢驗結(jié)果
表2內(nèi)毒素檢驗結(jié)果（405nm）
由表1、表2可以看出，由實施例1、2、3制備的不同批次的培養(yǎng)液均既無菌生長又不含內(nèi)毒素，該方法制備的培養(yǎng)液安全可靠。
3.2細胞密度及活力測定結(jié)果
表3細胞密度測定結(jié)果
由表3可以看出，由實施例1、2、3制備的培養(yǎng)液培養(yǎng)的marc-145細胞密度明顯大于含fbs培養(yǎng)液培養(yǎng)的marc-145細胞。
表4細胞活率測定結(jié)果
由表4可以看出，在相同的培養(yǎng)時間內(nèi)，由實施例1、2、3制備的培養(yǎng)液培養(yǎng)的marc-145細胞存活率明顯大于由含fbs培養(yǎng)液培養(yǎng)的marc-145細胞。
3.3tcid50測定結(jié)果
表5tcid50測定結(jié)果
由表5可以看出，由實施例1、2、3制備的培養(yǎng)液添加劑培養(yǎng)的marc-145細胞比由含fbs培養(yǎng)液培養(yǎng)的marc-145細胞更有利于prrsv的繁殖，敏感性更強。
3.4免疫原性測定結(jié)果
表6prrsv的抗體水平測定結(jié)果
由表6可以看出，ⅰ、ⅱ、ⅲ組的抗體水平明顯高于ⅳ、ⅴ組，由實施例1、2、3制備的培養(yǎng)液培養(yǎng)的prrsv的免疫原性高于含fbs培養(yǎng)液培養(yǎng)的prrsv。
4結(jié)論
綜上所述，、本發(fā)明所使用的marc-145細胞培養(yǎng)液，在可以大大提高細胞的生長速度的前提下，一方面能增強prrsv對marc-145細胞的敏感性，提高病毒含量，另一方面，還可以增強豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的免疫原性。