本發(fā)明屬于原生質(zhì)體技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種蘋果果肉原生質(zhì)體的提取方法。

背景技術(shù)：

植物細(xì)胞主要由細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核組成。原生質(zhì)體由于去掉了細(xì)胞壁，細(xì)胞膜成為細(xì)胞活物質(zhì)與外界環(huán)境的唯一屏障。原生質(zhì)體可以用來(lái)觀察各種細(xì)胞過(guò)程和活動(dòng)，如在細(xì)胞壁的合成，細(xì)胞分裂，再生組織的分化，ca²⁺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控，在不同種類植物中響應(yīng)光、脅迫、激素等因素的離子通道的調(diào)控等研究領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用。cocking自1960年首次用酶法制備番茄根原生質(zhì)體獲得成功之后，植物原生質(zhì)體的研究才逐漸變得活躍起來(lái)，原生質(zhì)體已經(jīng)成為細(xì)胞壁再生、細(xì)胞分裂、胚的生成、分化及植物病毒研究的有效工具，經(jīng)過(guò)許多研究者的不斷努力，已建立起了酶解分離出原生質(zhì)體的基本程序。但幾乎所有的研究都表明，由于植物本身存在差異性，不同的種類，甚至同種植物不同的供試組織，其原生質(zhì)體分離所需的條件都存在著很大差異。

蘋果作為世界上栽培面積最大的四大水果之一，也是我國(guó)重要的栽培樹(shù)種。目前生產(chǎn)上的主要問(wèn)題是是品質(zhì)差，投入效益低，這些問(wèn)題限制了蘋果產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。由于蘋果有性雜交育種周期長(zhǎng)，遺傳上高度雜合，難以篩選出集父母優(yōu)良性狀與一體的植株，因此采用生物技術(shù)方法充分利用資源優(yōu)良性狀是其遺傳改良及種質(zhì)創(chuàng)新的重要內(nèi)容。而原生質(zhì)體的提取是現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域中重要的一部分。

目前關(guān)于蘋果分離原生質(zhì)體的來(lái)源主要是花藥愈傷組織、胚珠愈傷組織、葉片和花粉等，至今尚未有以蘋果果肉中原生質(zhì)體的提取的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種蘋果果肉原生質(zhì)體的提取方法，本發(fā)明方法可有效的保持原生質(zhì)體的活性以及完整性，其蘋果果肉原生質(zhì)體的分離率可達(dá)15.63％。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：一種蘋果果肉原生質(zhì)體的提取方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、取蘋果果肉薄片置于酶液中，得到混合物；

b、將步驟a中得到的混合物加入離心管中，在25-30℃黑暗環(huán)境中靜置酶解，得到酶解初級(jí)產(chǎn)物；

c、將步驟b中得到的酶解產(chǎn)物過(guò)篩，過(guò)篩收集篩出物得到已酶解的蘋果果肉汁，再加入甘露醇cpw溶液，經(jīng)過(guò)離心、洗滌、沉淀得到蘋果果肉原生質(zhì)體。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明方法可有效的保持原生質(zhì)體的活性以及完整性，其蘋果果肉原生質(zhì)體的分離率可達(dá)15.63％。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。

作為本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選方案，在步驟a中，所述酶液的配置方法：以甘露醇cpw溶液為溶劑，加入mes0.1％(w/v)，bsa0.1％(w/v)，pvp1％(w/v)，離析酶r-101％(w/v)混合均勻即可，其ph值控制在5.6，其中mes0.1％(w/v)表示100ml的酶液中含有0.1gmes，bsa0.1％(w/v)表示100ml的酶液中含有0.1gbsa，pvp1％(w/v)表示100ml的酶液中含有1gpvp，離析酶r-101％(w/v)表示100ml的酶液中含有1g離析酶r-10；

所述甘露醇cpw溶液的配置方法：以水為溶劑，加入101.0mg/lkno3，27.2mg/lkh2po4，246.0mg/lmgso4·7h2o，1480.0mg/lcacl2·2h2o，0.16mg/lki，0.025mg/lcuso4·5h2o，0.7mol/l甘露醇，混合均勻即可。

作為本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選方案，在步驟a中，所述蘋果果肉厚度為0.2cm，其蘋果果肉薄片的質(zhì)量與酶液的體積比為1:3。

作為本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選方案，在步驟b中，所述酶解時(shí)間控制在20-30min。

作為本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選方案，在步驟c中，所述過(guò)篩目數(shù)為320目。

作為本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選方案，在步驟c中，所述甘露醇cpw溶液的配置方法：以水為溶劑，加入101.0mg/lkno3，27.2mg/lkh2po4，246.0mg/lmgso4·7h2o，1480.0mg/lcacl2·2h2o，0.16mg/lki，0.025mg/lcuso4·5h2o，0.7mol/l甘露醇，混合均勻即可，其中101.0mg/lkno3，27.2mg/lkh2po4，246.0mg/lmgso4·7h2o，1480.0mg/lcacl2·2h2o，0.16mg/lki，0.025mg/lcuso4·5h2o，0.7mol/l甘露醇表示每升甘露醇cpw溶液中分別含有101.0mgkno3，27.2mgkh2po4，246.0mgmgso4·7h2o，1480.0mgcacl2·2h2o，0.16ki，0.025cuso4·5h2o，0.7mol甘露醇。

作為本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選方案，在步驟c中，所述甘露醇cpw溶液與已酶解蘋果果肉混合時(shí)溫度控制在20-25℃。

作為本發(fā)明所用到的材料其化學(xué)式與中文對(duì)比如下：

kno3(硝酸鉀)；

kh2po4(磷酸二氫鉀)；

mgso4·7h2o(七水硫酸鎂)；

cacl2·2h2o(二水氯化鈣)；

ki(碘化鉀)；

cuso4·5h2o(五水硫酸銅)；

mes(2-(n-嗎啡啉)乙磺酸：c6h13no4s)；

bsa(牛血清靜蛋白)；

pvp(聚乙烯吡咯烷酮)；

離析酶r-10(酶的型號(hào))。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明提取的蘋果果肉原生質(zhì)體電鏡圖；

圖2為本發(fā)明提取的蘋果果肉原生質(zhì)體經(jīng)fda染色的電鏡圖。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

a、先用蒸餾水沖洗蘋果數(shù)次，將其果皮下的果肉用手術(shù)刀切下0.5cm×0.5cm的小方塊，再徒手將其切成1mm×1mm，厚度為0.2cm的薄片，將蘋果果肉薄片置于酶液中，得到混合物；

b、將步驟a中得到的混合物加入離心管中，在25℃黑暗環(huán)境中靜置酶解20min，中間每5min取出來(lái)，輕輕搖勻，得到酶解初級(jí)產(chǎn)物；

c、將步驟b中得到的酶解產(chǎn)物過(guò)篩，過(guò)篩收集篩出物得到已酶解的蘋果果肉汁，再加入甘露醇cpw溶液，經(jīng)過(guò)2000r/min離心、洗滌3次，棄除上清液，去除酶液沉淀得到蘋果果肉原生質(zhì)體。

原生質(zhì)體的計(jì)數(shù)

輕輕搖勻沉淀的原生質(zhì)體，用移液槍吸取20μl滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察原生質(zhì)體，并拍照，統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體分離率(視野中的原生質(zhì)體數(shù)/視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù))，每次取10個(gè)視野，3次重復(fù)。果肉原生質(zhì)體的分離率可達(dá)15.63％。

在步驟a中，所述酶液的配置方法：以甘露醇cpw溶液為溶劑，加入mes0.1％(w/v)，bsa0.1％(w/v)，pvp1％(w/v)，離析酶r-101％(w/v)混合均勻即可，其ph值控制在5.6；

所述甘露醇cpw溶液的配置方法：以水為溶劑，加入101.0mg/lkno3，27.2mg/lkh2po4，246.0mg/lmgso4·7h2o，1480.0mg/lcacl2·2h2o，0.16mg/lki，0.025mg/lcuso4·5h2o，0.7mol/l甘露醇，混合均勻即可。

在步驟a中，其蘋果果肉薄片的質(zhì)量與酶液的體積比為1:3。

在步驟c中，所述過(guò)篩目數(shù)為300目。

在步驟c中，所述甘露醇cpw溶液的配置方法：以水為溶劑，加入101.0mg/lkno3，27.2mg/lkh2po4，246.0mg/lmgso4·7h2o，1480.0mg/lcacl2·2h2o，0.16mg/lki，0.025mg/lcuso4·5h2o，0.7mol/l甘露醇，混合均勻即可。

在步驟c中，所述甘露醇cpw溶液與已酶解蘋果果肉混合時(shí)溫度控制在20℃。

實(shí)施例2

a、先用蒸餾水沖洗蘋果數(shù)次，將其果皮下的果肉用手術(shù)刀切下0.5cm×0.5cm的小方塊，再徒手將其切成1mm×1mm，厚度為0.2cm的薄片，將蘋果果肉薄片置于酶液中，得到混合物；

b、將步驟a中得到的混合物加入離心管中，在28℃黑暗環(huán)境中靜置酶解25min，中間每5min取出來(lái)，輕輕搖勻，得到酶解初級(jí)產(chǎn)物；

c、將步驟b中得到的酶解產(chǎn)物過(guò)篩，過(guò)篩收集篩出物得到已酶解的蘋果果肉汁，再加入甘露醇cpw溶液，經(jīng)過(guò)2000r/min離心、洗滌3次，棄除上清液，去除酶液沉淀得到蘋果果肉原生質(zhì)體。

原生質(zhì)體的計(jì)數(shù)

輕輕搖勻沉淀的原生質(zhì)體，用移液槍吸取20μl滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察原生質(zhì)體，并拍照，統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體分離率(視野中的原生質(zhì)體數(shù)/視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù))，每次取10個(gè)視野，3次重復(fù)。果肉原生質(zhì)體的分離率可達(dá)15.53％。

在步驟a中，所述酶液的配置方法：以甘露醇cpw溶液為溶劑，加入mes0.1％(w/v)，bsa0.1％(w/v)，pvp1％(w/v)，離析酶r-101％(w/v)混合均勻即可，其ph值控制在5.6；

所述甘露醇cpw溶液的配置方法：以水為溶劑，加入101.0mg/lkno3，27.2mg/lkh2po4，246.0mg/lmgso4·7h2o，1480.0mg/lcacl2·2h2o，0.16mg/lki，0.025mg/lcuso4·5h2o，0.7mol/l甘露醇，混合均勻即可。

在步驟a中，其蘋果果肉薄片的質(zhì)量與酶液的體積比為1:3。

在步驟c中，所述過(guò)篩目數(shù)為320目。

在步驟c中，所述甘露醇cpw溶液的配置方法：以水為溶劑，加入101.0mg/lkno3，27.2mg/lkh2po4，246.0mg/lmgso4·7h2o，1480.0mg/lcacl2·2h2o，0.16mg/lki，0.025mg/lcuso4·5h2o，0.7mol/l甘露醇，混合均勻即可。

在步驟c中，所述甘露醇cpw溶液與已酶解蘋果果肉混合時(shí)溫度控制在22℃。

實(shí)施例3

a、先用蒸餾水沖洗蘋果數(shù)次，將其果皮下的果肉用手術(shù)刀切下0.5cm×0.5cm的小方塊，再徒手將其切成1mm×1mm，厚度為0.2cm的薄片，將蘋果果肉薄片置于酶液中，得到混合物；

b、將步驟a中得到的混合物加入離心管中，在30℃黑暗環(huán)境中靜置酶解30min，中間每5min取出來(lái)，輕輕搖勻，得到酶解初級(jí)產(chǎn)物；

c、將步驟b中得到的酶解產(chǎn)物過(guò)篩，過(guò)篩收集篩出物得到已酶解的蘋果果肉汁，再加入甘露醇cpw溶液，經(jīng)過(guò)2000r/min離心、洗滌3次，棄除上清液，去除酶液沉淀得到蘋果果肉原生質(zhì)體。

原生質(zhì)體的計(jì)數(shù)

輕輕搖勻沉淀的原生質(zhì)體，用移液槍吸取20μl滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察原生質(zhì)體，并拍照，統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體分離率(視野中的原生質(zhì)體數(shù)/視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù))，每次取10個(gè)視野，3次重復(fù)。果肉原生質(zhì)體的分離率可達(dá)15.56％。

在步驟a中，所述酶液的配置方法：以甘露醇cpw溶液為溶劑，加入mes0.1％(w/v)，bsa0.1％(w/v)，pvp1％(w/v)，離析酶r-101％(w/v)混合均勻即可，其ph值控制在5.6；

所述甘露醇cpw溶液的配置方法：以水為溶劑，加入101.0mg/lkno3，27.2mg/lkh2po4，246.0mg/lmgso4·7h2o，1480.0mg/lcacl2·2h2o，0.16mg/lki，0.025mg/lcuso4·5h2o，0.7mol/l甘露醇，混合均勻即可。

在步驟a中，其蘋果果肉薄片的質(zhì)量與酶液的體積比為1:3。

在步驟c中，所述過(guò)篩目數(shù)為350目。

在步驟c中，所述甘露醇cpw溶液的配置方法：以水為溶劑，加入101.0mg/lkno3，27.2mg/lkh2po4，246.0mg/lmgso4·7h2o，1480.0mg/lcacl2·2h2o，0.16mg/lki，0.025mg/lcuso4·5h2o，0.7mol/l甘露醇，混合均勻即可。

在步驟c中，所述甘露醇cpw溶液與已酶解蘋果果肉混合時(shí)溫度控制在25℃。

附圖1與附圖2為本發(fā)明實(shí)施例2提取得到的蘋果果肉原生質(zhì)體，由附圖1所示，蘋果果肉脫去了全部的細(xì)胞壁，而呈現(xiàn)為球形狀，其提取得到的蘋果果肉原生質(zhì)體保持了相對(duì)的完整性；附圖2是將提取得到的原生質(zhì)體經(jīng)fda(熒光素二乙酸)染色，在熒光顯微鏡用藍(lán)色光激發(fā)下(495nm)觀察，其原生質(zhì)體具有綠色熒光，說(shuō)明獲得的原生質(zhì)體保持了活性。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。