一種利用原生質(zhì)體技術(shù)純化食用菌菌種的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用原生質(zhì)體技術(shù)純化食用菌菌種的方法。本發(fā)明提供的食用菌菌種純化方法，依次包括如下步驟：(1)取食用菌的出發(fā)菌株，制備原生質(zhì)體；(2)進(jìn)行原生質(zhì)體再生，得到原生質(zhì)體再生菌；(3)進(jìn)行如下(a)和/或(b)：(a)檢測(cè)各個(gè)原生質(zhì)體再生菌的菌絲生長(zhǎng)速率，菌絲生長(zhǎng)速率的一致性高的原生質(zhì)體再生菌即為純化后的菌種；(b)檢測(cè)各個(gè)原生質(zhì)體再生菌的子實(shí)體產(chǎn)量，子實(shí)體產(chǎn)量的一致性高的原生質(zhì)體再生菌即為純化后的菌種。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于食用菌栽培工廠和專業(yè)的食用菌菌種生產(chǎn)和銷售公司。
【專利說明】一種利用原生質(zhì)體技術(shù)純化食用菌菌種的方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及一種利用原生質(zhì)體技術(shù)純化食用菌菌種的方法。 【背景技術(shù)】
[0002] 目前，隨著食用菌產(chǎn)業(yè)規(guī)模的日益擴(kuò)大，對(duì)食用菌菌種質(zhì)量的要求也日益提高。 "菌種純度"是影響菌種質(zhì)量的一個(gè)關(guān)鍵因素。
[0003] 食用菌菌種是指生長(zhǎng)在適宜培養(yǎng)基質(zhì)上具有結(jié)實(shí)性的菌絲培養(yǎng)物，菌絲一般為多 細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因此菌種是由許多菌絲細(xì)胞組成的細(xì)胞群體。
[0004] 食用菌菌種在繼代培養(yǎng)和保藏過程中，由于其自身的堿基突變、轉(zhuǎn)座子、準(zhǔn)性生殖 等生物學(xué)機(jī)制，會(huì)導(dǎo)致菌種中各個(gè)細(xì)胞在遺傳和表型上的不一致性，也就是說菌種純度降 低，或菌種不純。
[0005] 不純的菌種在生產(chǎn)上會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)不一致、出菇不整齊、子實(shí)體商品性狀雜亂、產(chǎn)量 降低、栽培周期延長(zhǎng)等諸多問題，這些問題在工廠化栽培中表現(xiàn)尤為嚴(yán)重。
[0006] 為了恢復(fù)或提高菌種的純度，目前生產(chǎn)中通常利用子實(shí)體組織分離技術(shù)、孢子分 離雜交、繼代培養(yǎng)篩選等方法。子實(shí)體組織分離技術(shù)和繼代培養(yǎng)篩選獲得的菌種仍然來源 于多細(xì)胞群體，只能是在一定程度上提高菌種純度，仍然不純。孢子分離技術(shù)雖然能獲得純 菌種，但是有性孢子形成過程中經(jīng)歷一次染色體重組，其性狀會(huì)發(fā)生較大的變異。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種食用菌菌種純化方法。
[0008] 本發(fā)明提供的食用菌菌種純化方法，依次包括如下步驟：
[0009] (1)取食用菌的出發(fā)菌株，制備原生質(zhì)體；
[0010] (2)進(jìn)行原生質(zhì)體再生，得到原生質(zhì)體再生菌；
[0011] ⑶進(jìn)行如下（a)和/或（b):
[0012] (a)檢測(cè)各個(gè)原生質(zhì)體再生菌的培養(yǎng)特性，菌絲生長(zhǎng)速率的一致性高的原生質(zhì)體 再生菌即為純化后的菌種；
[0013] (b)檢測(cè)各個(gè)原生質(zhì)體再生菌的出菇特性，子實(shí)體產(chǎn)量的一致性高的原生質(zhì)體再 生菌即為純化后的菌種。
[0014] 所述（a)具體可為：檢測(cè)各個(gè)原生質(zhì)體再生菌的菌絲生長(zhǎng)速率，菌絲生長(zhǎng)速率的 一致性高于所述出發(fā)菌株的原生質(zhì)體再生菌即為純化后的菌種；
[0015] 所述（b)具體可為：檢測(cè)各個(gè)原生質(zhì)體再生菌的子實(shí)體產(chǎn)量，子實(shí)體產(chǎn)量的一致 性高于所述出發(fā)菌株的原生質(zhì)體再生菌即為純化后的菌種。
[0016] 所述"制備原生質(zhì)體"的方法具體包括如下步驟：①將所述出發(fā)菌株接種到PDB培 養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)5-10d ;②完成步驟①后，收集菌絲體，用0. 6M甘露醇水溶液洗滌，然后用無 菌濾紙吸干菌絲體表面的溶液；③取0. lg步驟②得到的菌絲體，加入0. 8ml溶壁酶溶液， 30°C反應(yīng)4h ;④完成步驟③后，在無菌條件下用無菌脫脂棉濾芯過濾，收集濾液，即為含有 原生質(zhì)體的溶液。所述PDB培養(yǎng)基的組成具體如下：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、水1000ml， 自然pH。所述溶壁酶溶液的制備方法具體如下：將0. 4g溶壁酶（廣東省微生物菌種保藏 中心，http://www. gimcc. net/prolist. asp)溶于 10ml0· 6M 甘露醇水溶液，用 0· 22 μ m 無 菌過濾器過濾除菌。
[0017] 所述"進(jìn)行原生質(zhì)體再生"的方法包括如下步驟：①取原生質(zhì)體溶液，涂布到再生 培養(yǎng)基，25 °C培養(yǎng)5-6天；②完成步驟①后，挑取菌落，接種至PDA試管培養(yǎng)基，25 °C培養(yǎng) 6-10天（如6-7天或8-10天）；③完成步驟②后，取雙核菌株，即為原生質(zhì)體再生菌。所述 原生質(zhì)體溶液具體可為原生質(zhì)體濃度為1〇 6個(gè)/ml的原生質(zhì)體溶液。所述再生培養(yǎng)基的組 成具體如下：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、甘露醇109g、水1000ml，自然pH。
[0018] 所述食用菌可為杏鮑菇或平菇，具體可為杏鮑菇ACCC52627或平菇ACCC50838。
[〇〇19] 本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述方法在食用菌生產(chǎn)中的應(yīng)用。所述應(yīng)用中，選擇菌絲 生長(zhǎng)速率高于所述出發(fā)菌株的原生質(zhì)體再生菌和/或子實(shí)體產(chǎn)量高于所述出發(fā)菌株的原 生質(zhì)體再生菌進(jìn)行生產(chǎn)。
[0020] 食用菌菌種是多細(xì)胞的菌絲組成的。利用原生質(zhì)體制備可以分離獲得單細(xì)胞，單 細(xì)胞的原生質(zhì)體再生可以重新萌發(fā)形成菌種。原生質(zhì)體再生菌種的所有細(xì)胞都起源于同一 個(gè)原生質(zhì)體細(xì)胞，所以這些細(xì)胞的遺傳和表型一致，也就是說單細(xì)胞原生質(zhì)體再生獲得的 菌株是遺傳上高度一致的純菌種。另外，利用原生質(zhì)體純化菌種的過程中未經(jīng)歷有性過程 和染色體重組，所以最大程度上保留了菌種原有的農(nóng)藝性狀和商品性狀。
[0021] 食用菌菌種純度是影響菌種質(zhì)量的一個(gè)關(guān)鍵因素。食用菌菌種是由多細(xì)胞的菌絲 組成的，在長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)和保藏過程中，由于自身的生物學(xué)特性，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞之間遺傳和表 型上的差異。本發(fā)明提供了一種新的食用菌菌種純化方法，即利用原生質(zhì)體技術(shù)純化食用 菌菌種，包括如下步驟：①原生質(zhì)體的制備；②原生質(zhì)體再生；③菌種性狀的評(píng)價(jià)和篩選。 利用本發(fā)明的方法可以獲得遺傳上高度一致的純菌種。在生產(chǎn)中使用純菌種可以顯著提高 菌絲生長(zhǎng)的整齊度，子實(shí)體商品性狀的一致性。另外，通過性狀的評(píng)價(jià)和篩選還能獲得產(chǎn)量 超過原始菌株的菌種。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于食用菌栽培工廠和專業(yè)的食用菌菌種生產(chǎn)和銷 售公司。 【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。本發(fā)明中的菌種純度，也稱為菌種的一致性，是指菌種中各個(gè)細(xì)胞在遺傳和表型上 的一致性，而不是指由于雜菌污染而導(dǎo)致的菌種不純。ACCC的全稱為中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種 保藏管理中心（Agricultural Culture Collection of China, ACCC)，網(wǎng)址：http://www. accc. org. cn〇
[0023] PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000ml，自然pH。PDB培養(yǎng)基： 馬鈴薯200g、葡萄糖20g、水1000ml，自然pH。溶壁酶溶液：將0.4g溶壁酶（廣東省微生 物菌種保藏中心， http://www.gimcc.net/prolist.asp)溶于10ml0.6M甘露醇水溶液，用 0. 22 μ m無菌過濾器過濾除菌。再生培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、甘露醇 109g、水 1000ml，自然 pH。
[0024] 實(shí)施例1、杏鮑菇ACCC52627的純化
[0025] 實(shí)施例1中所采用的杏鮑菇為獲自ACCC的編號(hào)為52627的杏鮑菇，因此稱為杏鮑 ? ACCC52627。
[0026] 一、原生質(zhì)體的制備
[0027] 1、菌種活化，將杏鮑菇ACCC52627接種到新鮮的PDA培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)7-10d。
[0028] 2、完成步驟1后，將活化后的菌株接種到PDB培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)5-10d。
[0029] 3、完成步驟2后，收集菌絲體，用0. 6M甘露醇水溶液洗滌兩次，然后用無菌濾紙吸 干菌絲體表面的溶液。
[0030] 4、取0. lg步驟3得到的菌絲體，放于2. 0ml離心管中，加入0. 8ml溶壁酶溶液， 30°C反應(yīng)4h (每隔lOmin顛倒離心管混勻一次）。
[0031] 5、完成步驟4后，在無菌條件下用無菌脫脂棉濾芯過濾，收集濾液。
[0032] 6、取步驟5得到的濾液，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板檢查計(jì)算原生質(zhì)體的純度和數(shù) 量，結(jié)果表明，濾液中沒有菌絲，只有球形原生質(zhì)體，原生質(zhì)體的濃度為6. 40X 107/ml。
[0033] 7、取步驟5得到的濾液，用0. 6M甘露醇水溶液調(diào)節(jié)原生質(zhì)體濃度，得到原生質(zhì)體 濃度為1〇6個(gè)/ml的原生質(zhì)體溶液。
[0034] 二、原生質(zhì)體的再生
[0035] 1、取100 μ 1步驟一的7得到的原生質(zhì)體溶液，涂布到再生培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)5-6 天（菌落萌發(fā)，可以觀察到肉眼可見的菌落）。
[0036] 2、完成步驟1后，挑取菌落，接種至PDA試管培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)8-10天（培養(yǎng)基表 面長(zhǎng)滿菌落）。
[0037] 3、完成步驟2后，采用插片法制片（將待觀察的菌株接種到PDA平板培養(yǎng)基的中 間，在接種塊的周圍約2cm的位置，斜插入無菌蓋玻片，25°C倒置培養(yǎng)，當(dāng)菌落前沿的菌絲 附著到蓋玻片時(shí)，用鑷子取出蓋玻片，放在載玻片上），然后在顯微鏡下觀察，根據(jù)鎖狀聯(lián)合 的有無確定是雙核菌株還是單核菌株（對(duì)于平菇和杏鮑菇來說：菌絲相對(duì)較粗，具有鎖狀 聯(lián)合的菌株為雙核菌株，又稱異核菌株；菌絲相對(duì)較細(xì)，無鎖狀聯(lián)合的菌株為單核菌株，又 稱同核菌株）。
[0038] 三、菌種篩選
[0039] 完成步驟二后，隨機(jī)選擇3個(gè)雙核菌株（杏鮑菇ACCC52627-2、杏鮑菇 ACCC52627-7、杏鮑菇ACCC52627-9)，以步驟一的1活化后的杏鮑菇ACCC52627 (原始菌株） 作為對(duì)照，進(jìn)行性狀評(píng)價(jià)（包括農(nóng)藝栽培性狀鑒定和子實(shí)體的商品性狀鑒定），選擇性狀好 的菌株用于生產(chǎn)。對(duì)于單核菌株，可以選擇不同交配類型的單核菌株雜交，重新獲得雙核菌 株，然后進(jìn)行性狀評(píng)價(jià)。
[0040] 1、菌絲生長(zhǎng)速率以及菌絲生長(zhǎng)速率的一致性
[0041] 將杏鮑菇ACCC52627、杏鮑菇ACCC52627-2、杏鮑菇ACCC52627-7和杏鮑菇 ACCC52627-9分別接種到新鮮的PDA培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)7d。
[0042] 結(jié)果見表1。從原始菌株（杏鮑菇ACCC52627)獲得的三個(gè)原生質(zhì)體再生菌株（杏 鮑菇ACCC52627-2、杏鮑菇ACCC52627-7、杏鮑菇ACCC52627-9)的菌絲生長(zhǎng)速率有顯著差 異，說明原始菌株各個(gè)細(xì)胞的遺傳型和表型存在差異。三個(gè)原生質(zhì)體再生菌株的菌絲生長(zhǎng) 速率的標(biāo)準(zhǔn)差低于原始菌株，說明原生質(zhì)體再生菌株的菌絲生長(zhǎng)速率的一致性要高于原始 菌株。根據(jù)步驟1的鑒定，應(yīng)選擇杏鮑菇ACCC52627-7和杏鮑菇ACCC52627-9進(jìn)行后續(xù)生 產(chǎn)。
[〇〇43] 表1原始菌株與其原生質(zhì)體再生菌株的菌絲生長(zhǎng)率
[0044]
[0045]
【權(quán)利要求】
1. 一種食用菌菌種純化方法，依次包括如下步驟： (1) 取食用菌的出發(fā)菌株，制備原生質(zhì)體； (2) 進(jìn)行原生質(zhì)體再生，得到原生質(zhì)體再生菌； (3) 進(jìn)行如下（a)和/或（b): (a) 檢測(cè)各個(gè)原生質(zhì)體再生菌的培養(yǎng)性狀，菌絲生長(zhǎng)速率的一致性高的原生質(zhì)體再生 菌即為純化后的菌種； (b) 檢測(cè)各個(gè)原生質(zhì)體再生菌的出菇特性，子實(shí)體產(chǎn)量的一致性高的原生質(zhì)體再生菌 即為純化后的菌種。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于： 所述（a)為：檢測(cè)各個(gè)原生質(zhì)體再生菌的菌絲生長(zhǎng)速率，菌絲生長(zhǎng)速率的一致性高于 所述出發(fā)菌株的原生質(zhì)體再生菌即為純化后的菌種； 所述（b)為：檢測(cè)各個(gè)原生質(zhì)體再生菌的子實(shí)體產(chǎn)量，子實(shí)體產(chǎn)量的一致性高于所述 出發(fā)菌株的原生質(zhì)體再生菌即為純化后的菌種。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于： 所述"制備原生質(zhì)體"的方法包括如下步驟： ① 將所述出發(fā)菌株接種到PDB培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)5-10d ; ② 完成步驟①后，收集菌絲體，用〇. 6M甘露醇水溶液洗滌，然后用無菌濾紙吸干菌絲 體表面的溶液； ③ 取〇. lg步驟②得到的菌絲體，加入〇. 8ml溶壁酶溶液，30°C反應(yīng)4h ; ④ 完成步驟③后，在無菌條件下用無菌脫脂棉濾芯過濾，收集濾液，即為含有原生質(zhì)體 的溶液。
4. 如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于： 所述"進(jìn)行原生質(zhì)體再生"的方法包括如下步驟： ① 取原生質(zhì)體溶液，涂布到再生培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)5-6天； ② 完成步驟①后，挑取菌落，接種至PDA試管培養(yǎng)基，25°C培養(yǎng)6-10天； ③ 完成步驟②后，取雙核菌株，即為原生質(zhì)體再生菌。 所述原生質(zhì)體溶液具體可為原生質(zhì)體濃度為1〇6個(gè)/ml的原生質(zhì)體溶液。
5. 如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述食用菌為杏鮑菇或平菇。
6. 權(quán)利要求1至5中任一所述方法在食用菌生產(chǎn)中的應(yīng)用。
7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：選擇菌絲生長(zhǎng)速率高于所述出發(fā)菌株的原 生質(zhì)體再生菌和/或子實(shí)體產(chǎn)量高于所述出發(fā)菌株的原生質(zhì)體再生菌進(jìn)行生產(chǎn)。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK104087518SQ201410320034
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月7日
【發(fā)明者】張瑞穎, 顧金剛, 張金霞 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所