專利名稱：龍須菜原生質(zhì)體的分離純化及再生成植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶法分離純化原生質(zhì)體及再生成植株的方法，是關(guān)于龍須菜酶離營養(yǎng)細(xì)胞成苗技術(shù)，具體地說是龍須菜原生質(zhì)體的分離純化及再生成植株的方法。
背景技術(shù)：
原生質(zhì)體是去除了細(xì)胞壁的裸露的細(xì)胞，由于原生質(zhì)體沒有細(xì)胞壁，則可以在很多方面在人工控制下進(jìn)行處理，如細(xì)胞融合、細(xì)胞雜交、基因控制、遺傳轉(zhuǎn)化等，而且，對于經(jīng)濟(jì)物種來說，由原生質(zhì)體再生植株也是一條經(jīng)濟(jì)、合理的種苗來源途徑。
1960年Cocking用酶法首次分離出有活性的原生質(zhì)體，1971年Takebe等首次從煙草葉片分離原生質(zhì)體，經(jīng)培養(yǎng)獲得再生植株開始，原生質(zhì)體的研究和應(yīng)用已經(jīng)進(jìn)入了一個新階段。目前，在高等植物中，有關(guān)原生質(zhì)體分離及植株再生的研究報道已有很多，其技術(shù)方法也比較成熟，而關(guān)于海洋藻類，這方面的報道相對較少，雖然也有一些關(guān)于原生質(zhì)體分離及形成多細(xì)胞海藻的報道，但其中大部分是有關(guān)綠藻和褐藻的，紅藻的原生質(zhì)體分離及再生的相關(guān)研究主要是關(guān)于紫菜的，如中國專利CN1153212A，介紹了酶法解離紫菜葉狀體細(xì)胞育苗的方法，而江蘺屬植物沒有相關(guān)報道。江蘺屬植物藻膠含量特別高，壁物質(zhì)比較難去除，以往對于紅藻原生質(zhì)體制備的最主要的工具酶為瓊膠酶，其價格比較昂貴，因此江蘺屬植物原生質(zhì)體制備受到限制，相關(guān)研究也比較困難。
龍須菜是紅藻門江蘺屬植物，在中國山東半島沿海分布比較普遍，其藻膠含量達(dá)20％～25％，而且膠的強(qiáng)度也比較大，與石花菜相比還有生長快、容易采集和可以在海區(qū)大面積人工養(yǎng)殖的優(yōu)點，所以，近年來龍須菜逐漸發(fā)展為瓊膠工業(yè)的主要原料。除此之外，它還在食品、醫(yī)藥以及水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種成本低的龍須菜原生質(zhì)體分離及植株再生的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用海螺酶對龍須菜孢子體營養(yǎng)枝細(xì)胞壁進(jìn)行消化酶解，酶解后用350-400目篩絹進(jìn)行揉搓、過濾收集原生質(zhì)體，將分離得到的原生質(zhì)體培養(yǎng)在固體液體雙層培養(yǎng)基中，固體為“F/2”培養(yǎng)基，上層為消毒海水，將分離得到的原生質(zhì)體滴加于上層的液體培養(yǎng)基中，于22℃-24℃，光強(qiáng)400lux～1000lux，光周期為12L:12D的條件下培養(yǎng)；一段時間后連培養(yǎng)皿一起放入到大體積的培養(yǎng)液中充氣培養(yǎng)。
龍須菜原生質(zhì)體的分離純化及再生成植株的方法，1)將藻體洗凈，去除雜藻和其他附屬生物；2)取清洗過的藻體，剪取嫩枝部分，將其剪成約1-2mm長，清洗，加入酶液淹沒藻體，黑暗中酶解，然后去除酶液，用350-400目篩絹經(jīng)揉搓過濾收集原生質(zhì)體，獲得龍須菜單細(xì)胞；3)將酶解獲得的龍須菜單細(xì)胞培育再生成植株。
龍須菜單細(xì)胞培育再生成植株的培養(yǎng)方法為將收集到的原生質(zhì)體懸浮液滴加到已配制好的雙層培養(yǎng)基的上層培養(yǎng)液中，雙層培養(yǎng)基中的固體培養(yǎng)基為“F/2”，用過濾海水配制；將滴加在固體培養(yǎng)基上的原生質(zhì)體培養(yǎng)在溫度22℃-24℃，光強(qiáng)400-1000lux，光周期為12L:12D的條件下；培養(yǎng)一段時間后放入到大體積的培養(yǎng)液中充氣培養(yǎng)，培養(yǎng)液為消毒后的天然海水，培養(yǎng)條件同上，生成新的植株。
將揉搓過的藻體再加入之前吸出的酶解液中，酶解后再采用350-400目篩絹經(jīng)揉搓過濾收集原生質(zhì)體，重復(fù)如上過程，提高獲得龍須菜單細(xì)胞的收率。所述藻體剪切后的清洗過程是指將藻體剪成約1-2mm長后放入離心管中，加入消毒海水離心，棄去上層海水達(dá)到清洗的目的。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1)本發(fā)明采用海螺酶對龍須菜孢子體營養(yǎng)枝細(xì)胞壁進(jìn)行消化酶解，所用工具酶為海螺酶，為粗酶提取液，成本較低，但對于龍須菜的細(xì)胞壁的消化能力極好。
2)本發(fā)明采用固體液體相結(jié)合的雙層培養(yǎng)法，這是目前廣泛應(yīng)用的培養(yǎng)方法之一。固體培養(yǎng)基為F/2培養(yǎng)基，F(xiàn)/2為藻類常用培養(yǎng)基，其中附加有養(yǎng)分，養(yǎng)分可以逐漸地向上層液體培養(yǎng)液中釋放，這樣有利于原生質(zhì)體在培養(yǎng)基中長時間的培養(yǎng)，同時，固體培養(yǎng)基可以使發(fā)育的幼苗有固著的地方。培養(yǎng)一周后，將培養(yǎng)的原生質(zhì)體連同培養(yǎng)皿一同放入到大體積的水體中充氣培養(yǎng)，一周的時間可以使具有生長活力的原生質(zhì)體完全從上層的液體培養(yǎng)基中逐漸下沉至固體培養(yǎng)基表面，同時生成細(xì)胞壁，發(fā)育并固著于固體培養(yǎng)基上，這樣在進(jìn)行充氣培養(yǎng)的時候就不至使原生質(zhì)體沖離培養(yǎng)皿。實驗的過程均在無菌條件下操作，但是藻體本身攜帶的菌很難全部去除，這也是藻類原生質(zhì)體培養(yǎng)所面臨的一個難題，在培養(yǎng)一周后將原生質(zhì)體連同培養(yǎng)皿一同轉(zhuǎn)入大體水體中充氣培養(yǎng)，這樣除了給生長的藻體提供充足的氧氣外還可以造成水體的流動，就不至于在培養(yǎng)基表面形成菌膜而影響原生質(zhì)體的生長。


圖1為實施例1原生質(zhì)體培養(yǎng)12天左右形成大于10個細(xì)胞的小幼苗(a為可見光，b為綠光激發(fā)的熒光照片)(×100)；圖2為實施例3原生質(zhì)體培養(yǎng)12天左右形成大于10個細(xì)胞的小幼苗(a為可見光，b為綠光激發(fā)的熒光照片)(×100)；圖3為實施例1原生質(zhì)體培養(yǎng)25天從小幼苗上開始出現(xiàn)分枝，長至4mm左右，肉眼隱約可見(×60)。
具體實施例方式
按文獻(xiàn)中給出的常規(guī)方法提取海螺酶取采集的新鮮海螺約1000g，洗去雜質(zhì)，于充足的海水中饑餓2-3d，用蒸餾水洗滌后放于-20℃下冷凍24h，破殼，取其消化道，消化腺，加人8倍(w/V)的冷凝水，用勻漿器勻漿。勻漿液置于4℃下油提過夜，抽提液用2mol/L的HCl調(diào)PH至4.6，冷凍離心(1000r/min)30miM棄去沉淀。上清液調(diào)PH至7.0，加入-30℃預(yù)冷的丙酮至10％濃度，離心棄去沉淀。上清液再加入冷丙酮至35％為濃度，離心收集沉淀。以上操作均在0℃以下進(jìn)行。沉淀物真空冷凍干燥后，得干粉。干粉溶于pH6.5的水溶液中，離心棄去沉淀，上清液再冷凍干燥得到干粉。
原生質(zhì)體的分離純化及再生成植株過程可按如下步驟操作1)將藻體用過濾海水清洗2遍，再用脫脂棉沾消毒海水擦拭兩遍，然后用脫脂棉沾70％酒精迅速擦拭藻體，最后用消毒海水漂洗3-5次，以去除雜藻和其他附屬生物；2)取清洗過的藻體，剪取幼嫩的分枝部分，用消毒過的剪刀將其剪成約1-2mm長，放入50ml離心管中，加入消毒海水至40ml，9000-10000×g離心5-10min，棄去上層海水，重復(fù)清洗兩次(洗去剪切的破碎細(xì)胞和組織)，加入酶液至剛剛淹沒藻體，黑暗中酶解過夜，然后用滴管吸去酶液，用消毒海水清洗去除殘余酶液，500-1000×g離心5-10min，重復(fù)3次，然后用消毒過的350-400目篩絹經(jīng)揉搓過濾收集原生質(zhì)體，然后將揉搓過的藻體再加入之前吸出的酶解液中，酶解5個小時后再采用上述辦法收集原生質(zhì)體，然后進(jìn)行重復(fù)，酶解3小時后再進(jìn)行收集，這樣使由剪口處向內(nèi)的細(xì)胞被逐層酶解和收集，使原生質(zhì)體的得率大大提高。將收集到的原生質(zhì)體懸浮液滴加到已配制好的雙層培養(yǎng)基的上層培養(yǎng)液中。
3)雙層培養(yǎng)基中的固體培養(yǎng)基為“F/2”，用過濾海水配制，其中瓊脂濃度為1％，121℃高溫滅菌20分鐘，在超凈工作臺中放置至溫度降到約50℃左右的時候倒在9cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿需預(yù)先在121℃高溫滅菌，每個培養(yǎng)皿中約含有這種固體培養(yǎng)基25ml，高度約4mm。
表1每升消毒海水中加入的營養(yǎng)鹽的含量

4)將滴加在固體培養(yǎng)基上的原生質(zhì)體培養(yǎng)在溫度22℃-24℃，光強(qiáng)400-1000lux，光周期為12L:12D的條件下。培養(yǎng)一周后連培養(yǎng)皿一起放入到大體積的培養(yǎng)液中充氣培養(yǎng)，體積約5L，培養(yǎng)液為消毒后的天然海水，每周更換一次，培養(yǎng)條件同上。
5)觀察到原生質(zhì)體未出現(xiàn)盤狀體而直接發(fā)育，首先由一個細(xì)胞分裂成兩個細(xì)胞，然后其中一個細(xì)胞繼續(xù)分裂，橫裂成四個細(xì)胞，而另一個細(xì)胞則逐漸伸長，形成細(xì)絲狀，起固著作用，固著于固體培養(yǎng)基上；上端由一個細(xì)胞分裂成的四個細(xì)胞靠基部的兩個細(xì)胞首先開始縱裂，然后上端的兩個細(xì)胞也開始縱裂。培養(yǎng)12天左右形成大于10個細(xì)胞的小幼苗(圖1、2)，培養(yǎng)25天后從小幼苗上開始出現(xiàn)分枝，長至4mm左右，肉眼隱約可見(圖3)，此時將小藻體從固體培養(yǎng)基上挑出，于附加N、P的消毒過的天然海水中培養(yǎng)，溫度22℃-24℃，光強(qiáng)1000lx左右，光周期為12L:12D，培養(yǎng)液2～3天更換一次。35天之后從長長的分枝上再開始出現(xiàn)分枝，總長度約為5mm，肉眼可見。
表2每升海水中附加N、P的量

實施例1材料來自福建養(yǎng)殖品種，全部為孢子體營養(yǎng)枝，取藻體1.5g，用過濾海水清洗2遍，再用脫脂棉沾消毒海水擦拭兩遍，然后用脫脂棉沾70％酒精迅速擦拭藻體，最后用消毒海水漂洗3-5次。用消毒過的剪刀將其剪成約0.2mm長，放入50ml離心管中，加入消毒海水至40ml，9000×g離心5min，棄去上層海水，重復(fù)清洗兩次，加入酶液2ml，黑暗中酶解5小時，然后用滴管吸去酶液，用消毒海水(消毒海水是將海水進(jìn)行沉淀，砂濾，抽氧，然后再用脫脂棉過濾后100℃下煮沸兩分鐘以上，自然冷卻即可)清洗去除殘余酶液，500×g離心10min，重復(fù)3次，然后用消毒過的350目篩絹經(jīng)揉搓過濾收集原生質(zhì)體。將收集到的原生質(zhì)體懸浮液滴加到已配制好的雙層培養(yǎng)基的上層培養(yǎng)液中。培養(yǎng)在溫度22℃-24℃，光強(qiáng)1000lux左右，光周期為12L:12D的條件下。培養(yǎng)一周后連培養(yǎng)皿一起放入到大體積的培養(yǎng)液中充氣培養(yǎng)，體積約5升，培養(yǎng)液為消毒后的天然海水，每周更換一次，培養(yǎng)條件同上。
實施例2前面的步驟與實施例1相同，與實施例1不同之處是酶解過程加入1ml酶液，然后再加入1ml消毒海水酶解9小時，350目篩絹揉搓過濾收集，然后將揉搓過的藻體再加入之前吸出的酶解液中，酶解5個小時后再采用上述辦法收集原生質(zhì)體，然后進(jìn)行重復(fù)，酶解3小時后再進(jìn)行收集，這樣使由剪口處向內(nèi)的細(xì)胞被逐層酶解和收集，提高原生質(zhì)體得率。
實施例3材料來自連云港養(yǎng)殖品種，為孢子體營養(yǎng)枝側(cè)枝，取藻體3g，用過濾海水清洗2遍，再用脫脂棉沾消毒海水擦拭兩遍，然后用脫脂棉沾70％酒精迅速擦拭藻體，最后用消毒海水漂洗3-5次。用消毒過的剪刀將其剪成約0.2mm長，放入50ml離心管中，加入消毒海水至40ml，9000×g離心5min，棄去上層海水，重復(fù)清洗兩次，加入酶液2ml，消毒海水2ml，黑暗中酶解9小時，然后用滴管吸去酶液，用消毒海水清洗去除殘余酶液，500×g離心10min，重復(fù)3次，然后用消毒過的350目篩絹經(jīng)揉搓過濾收集原生質(zhì)體。將收集到的原生質(zhì)體懸浮液滴加到已配制好的雙層培養(yǎng)基的上層培養(yǎng)液中。培養(yǎng)條件同實施例1。
權(quán)利要求
1.龍須菜原生質(zhì)體的分離純化及再生成植株的方法，其特征在于1)將藻體洗凈，去除雜藻和其他附屬生物；2)取清洗過的藻體，剪取嫩枝部分，將其剪成約1-2mm長，清洗，加入酶液淹沒藻體，黑暗中酶解，然后去除酶液，用350-400目篩絹經(jīng)揉搓過濾收集原生質(zhì)體，獲得龍須菜單細(xì)胞；3)將酶解獲得的龍須菜單細(xì)胞培育再生成植株。
2.按照權(quán)利要求1所述龍須菜原生質(zhì)體的分離純化及再生成植株的方法，其特征在于龍須菜單細(xì)胞培育再生成植株的培養(yǎng)方法為，將收集到的原生質(zhì)體懸浮液滴加到已配制好的雙層培養(yǎng)基的上層培養(yǎng)液中，雙層培養(yǎng)基中的固體培養(yǎng)基為“F/2”，用過濾海水配制；將滴加在固體培養(yǎng)基上的原生質(zhì)體培養(yǎng)在溫度22℃-24℃，光強(qiáng)400-1000lux左右，光周期為12L∶12D的條件下；培養(yǎng)一段時間后放入到大體積的培養(yǎng)液中充氣培養(yǎng)，培養(yǎng)液為消毒后的天然海水，培養(yǎng)條件同上，生成新的植株。
3.按照權(quán)利要求1所述龍須菜原生質(zhì)體的分離純化及再生成植株的方法，其特征在于將揉搓過的藻體再加入之前吸出的酶解液中，酶解后再采用350-400目篩絹經(jīng)揉搓過濾收集原生質(zhì)體，重復(fù)如上過程，獲得龍須菜單細(xì)胞。
4.按照權(quán)利要求1所述龍須菜原生質(zhì)體的分離純化及再生成植株的方法，其特征在于所述原生質(zhì)體來源于龍須菜孢子體營養(yǎng)枝。
5.按照權(quán)利要求1所述龍須菜原生質(zhì)體的分離純化及再生成植株的方法，其特征在于藻體剪切后的清洗過程是指將藻體剪成約1-2mm長后放入離心管中，加入消毒海水離心，棄去上層海水達(dá)到清洗的目的。
全文摘要
本發(fā)明涉及酶法分離純化原生質(zhì)體及再生成植株的方法，是關(guān)于龍須菜酶離營養(yǎng)細(xì)胞成苗技術(shù)，具體地說是龍須菜原生質(zhì)體的分離純化及再生成植株的方法，1)將藻體洗凈，去除雜藻和其他附屬生物；2)取清洗過的藻體，剪取嫩枝部分，將其剪成約1－2mm長，清洗，加入酶液淹沒藻體，黑暗中酶解，然后去除酶液，用350－400目篩絹經(jīng)揉搓過濾收集原生質(zhì)體，獲得龍須菜單細(xì)胞；3)將酶解獲得的龍須菜單細(xì)胞培育再生成植株。發(fā)明采用海螺酶對龍須菜孢子體營養(yǎng)枝細(xì)胞壁進(jìn)行消化酶解，所用工具酶為海螺酶，為粗酶提取液，成本較低，但對于龍須菜的細(xì)胞壁的消化能力極好。
文檔編號A01H4/00GK1754426SQ20041005054
公開日2006年4月5日 申請日期2004年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月30日
發(fā)明者王廣策, 尤麗莉, 林祥志, 曾呈奎 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所