專利名稱：五葉地錦胚乳原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及五葉地錦胚乳愈傷組織誘導(dǎo)、原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)技術(shù)。具體講涉及以五葉地錦幼果種子胚乳為外植體，誘導(dǎo)出愈傷組織，然后對(duì)所獲得愈傷進(jìn)行原生質(zhì)體分離，并成功培養(yǎng)的技術(shù)體系。屬于植物細(xì)胞工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
五葉地錦為葡萄科(Vitaceae)地錦屬(Parthenocissus)，是落葉藤本植物，有強(qiáng)大的吸附和攀緣能力。五葉地錦是具有良好觀賞效果的園林、城市垂直綠化、美化植物。聯(lián)合國(guó)生物圈和環(huán)境組織提出“城市綠地面積達(dá)到60m2/人時(shí)為最佳居住環(huán)境”，人類視野中綠色占25％以上時(shí)視覺(jué)感覺(jué)最舒服。但我國(guó)城市人均綠地面積不到5m2，與發(fā)達(dá)國(guó)家水平相距甚遠(yuǎn)，綠化用地缺乏是主要問(wèn)題之一，而絕大多數(shù)城市建筑墻面未加以充分利用，荒漠、石質(zhì)山地的植被恢復(fù)，新建公路、鐵路創(chuàng)傷面及護(hù)坡的植被建設(shè)均需要特殊功能植物。五葉地錦是解決上述問(wèn)題的優(yōu)選植物種類之一。
在城市綠化中五葉地錦適應(yīng)墻面輻射的高溫，對(duì)氯氣抗性強(qiáng)，夏季地錦爬滿墻壁對(duì)墻面有顯著的降溫增濕效果，減少墻壁熱輻射的面積，有效地消除部分熱污染源，并且地錦種植在建筑物墻根處，占用綠化土地面積小，既達(dá)到了綠化效果，又彌補(bǔ)了城市綠地不足。地錦增加了城市中植物光合作用的面積，提高了光合效率，從而吸收、固定了溫室氣體，從根本上減弱了“熱島效應(yīng)”，同時(shí)五葉地錦具有一定的耐蔭性，可在高架路下立柱等較蔭處作為垂直綠化材料。
五葉地錦適應(yīng)性強(qiáng)，對(duì)土質(zhì)要求不嚴(yán)，無(wú)論是種子繁殖、插條、分株都容易成活；生長(zhǎng)迅速，一年生苗株高可達(dá)1.5-2.0m，莖長(zhǎng)20-50m；耐瘠薄，一般無(wú)病蟲(chóng)害。同屬的地錦、異葉爬山虎、綠爬山虎和美國(guó)爬山虎都有較好的綠化山體斷面的效果，其自然生境多為山坡、溝邊灌叢或疏林中以及攀援樹(shù)上、巖石上，生長(zhǎng)地海拔最低為140m，最高可達(dá)1760m。地錦屬植物較強(qiáng)的適應(yīng)性，使其成為綠化荒漠的先鋒植物。隨著國(guó)家對(duì)生態(tài)環(huán)境建設(shè)的日益重視，地錦屬植物大量用于荒山綠化、固土護(hù)坡，防止水土流失以及干旱地區(qū)地面覆蓋和植被恢復(fù)。五葉地錦在土石荒山與石質(zhì)荒山、黃土高原、風(fēng)沙地、長(zhǎng)江流域紅、黃壤水土流失區(qū)綠化中已經(jīng)應(yīng)用。
然而地錦在冬季落葉，缺乏綠意，在降雨400mm以下，就難生存，限制了其綠化效果和范圍，因此通過(guò)育種手段培育綠期長(zhǎng)、耐干旱的地錦新品種可顯著增強(qiáng)其綠化價(jià)值。同時(shí)地錦的優(yōu)良特性并不是都存在于每一個(gè)種中，以原產(chǎn)中國(guó)的地錦(Parthenocissus tricuspidata)和原產(chǎn)美國(guó)的五葉地錦(P.quinquefolia)所含優(yōu)良特性為多。地錦吸盤(pán)發(fā)達(dá)，附著力強(qiáng)，但生長(zhǎng)較慢，五葉地錦生長(zhǎng)快、抗性強(qiáng)，但吸盤(pán)不發(fā)達(dá)，附著力弱，這些性狀限制嚴(yán)重影響了地錦的推廣應(yīng)用，培育兼具兩者優(yōu)點(diǎn)的新品種將擺脫這一限制。但到目前為止對(duì)地錦的利用還處于自然式的隨機(jī)應(yīng)用狀態(tài)，有目標(biāo)的育種工作尚未開(kāi)展。通過(guò)原生質(zhì)體進(jìn)行體細(xì)胞融合，可獲得兼具二者優(yōu)良性狀的再生植株。
原生質(zhì)體再生植株于1970年獲得成功到現(xiàn)在的30多年中，由于在原生質(zhì)體分離、培養(yǎng)、融合和轉(zhuǎn)化等的研究中所取得的迅速進(jìn)展，己使植物原生質(zhì)體研究成為植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)中最為活躍的研究領(lǐng)域之一。根據(jù)許智宏和衛(wèi)志明的報(bào)道3，已有46科的160多屬360多種植物(包括亞種、變種)的原生質(zhì)體培養(yǎng)，成功地獲得了再生植株。早期原生質(zhì)體培養(yǎng)主要集中于茄科的煙草屬、曼陀羅屬、矮牽牛屬等，以及傘形科、十字花科和蕓香科的植物。二十世紀(jì)八十年代以來(lái)，一些經(jīng)濟(jì)作物如大豆、棉花、油菜等已被成功地從原生質(zhì)體再生植株。特別是一直以為難以培養(yǎng)的禾谷類如水稻玉米、小麥以及谷子等原生質(zhì)體培養(yǎng)也相繼突破，木本植物、蔬菜作物，藥用植物及果樹(shù)的原生質(zhì)體培養(yǎng)也有明顯進(jìn)展。
地錦屬原生質(zhì)體培養(yǎng)尚無(wú)成功報(bào)道，在地錦短期原生質(zhì)體培養(yǎng)的研究中，發(fā)現(xiàn)分離的原生質(zhì)體分裂能力較差。在葡萄原生質(zhì)體培養(yǎng)中，研究者發(fā)現(xiàn)在附加不同激素的B5效果較好，1995年Reustle G等利用葉片發(fā)生的胚和胚狀體游離出原生質(zhì)體，并成功再生了植株；宋錫全等用花絲培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞分離原生質(zhì)體并再生了植株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立以五葉地錦胚乳愈傷進(jìn)行原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)的技術(shù)體系。
本發(fā)明是以五葉地錦花后35-45天幼果種子內(nèi)胚乳為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，以此誘導(dǎo)出胚乳愈傷組織，通過(guò)酶解法獲得原生質(zhì)體后，進(jìn)行固體培養(yǎng)。
本發(fā)明通過(guò)離體培養(yǎng)五葉地錦幼胚愈傷分離原生質(zhì)體，并經(jīng)培養(yǎng)再生細(xì)胞壁，重新獲得繼代生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織，為下一步地錦細(xì)胞融合工作開(kāi)展奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題的方案分以下五個(gè)步驟完成一、五葉地錦幼果胚乳誘導(dǎo)愈傷組織以改良B5培養(yǎng)基(表1)附加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 1.0-3.0mg/l，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 0.5-2.0mg/l，pH5.8-6.2，25±1℃黑暗條件下誘導(dǎo)幼果胚乳愈傷發(fā)生，50天左右誘發(fā)出愈傷組織。
二、胚乳愈傷組織繼代培養(yǎng)以改良B5培養(yǎng)基附加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 0.5-2.0mg/l，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 0.5-2.0mg/l，pH5.8-6.2，25±1℃黑暗條件下進(jìn)行愈傷組織繼代培養(yǎng)，30天繼代1次，經(jīng)2次繼代后，去掉白色，糊狀，無(wú)粘性的愈傷組織，獲得無(wú)色至淡灰白色，松軟，易散，細(xì)胞圓形，胞質(zhì)濃。
三、愈傷組織酶解分離原生質(zhì)體以纖維素酶(cellulase R-10)0.3％-1.0％，果膠酶(Pectolyase Y23)0.3％-1.0％，甘露醇0.2-0.6M，酶解4-12小時(shí)。五葉地錦胚乳愈傷原生質(zhì)體得率為1.18×106個(gè)/g。
四、原生質(zhì)體培養(yǎng)再生細(xì)胞壁，形成細(xì)胞團(tuán)獲得原生質(zhì)體經(jīng)液體淺層培養(yǎng)、固液結(jié)合培養(yǎng)、固體培養(yǎng)三種培養(yǎng)方式，胚乳愈傷組織來(lái)源的原生質(zhì)體形成了新的愈傷組織，新愈傷組織轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基中。
原生質(zhì)體培養(yǎng)液改良B5基本培養(yǎng)基附加水解酪蛋白100-500mg/l，谷氨酰胺100-200mg/l，甘氨酸10-50mg/l，天冬氨酸10-50mg/l，甘露醇0.2-1.0M，CaCl2.2H2O 1-5mmol/l，6-BA 1-3mg/l，2，4-D 0.1-1.0mg/l，葡萄糖0.1-1.0mmol/l，蔗糖1％；固體培養(yǎng)基添加瓊脂1.2％。
五、所獲得細(xì)胞團(tuán)繼代培養(yǎng)。
以改良B5培養(yǎng)基附加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 0.1-1.0mg/l，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 0.1-1.0mg/l，pH5.8-6.2，25±1℃黑暗條件下進(jìn)行愈傷組織繼代培養(yǎng)，30天繼代1次，繼代10個(gè)月后仍生長(zhǎng)旺盛。
本發(fā)明方法的創(chuàng)新點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)在于1.以盛花后35-45天幼果胚乳為培養(yǎng)物誘導(dǎo)愈傷組織，為胚乳培養(yǎng)獲得三倍體再生植株奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
2.篩選出了分離胚乳愈傷原生質(zhì)體的酶液組合和最佳的酶解時(shí)間，原生質(zhì)體得率達(dá)到1.18×106個(gè)/g。
3.通過(guò)液體淺層、固液結(jié)合及固體三種方式培養(yǎng)，首次得到五葉地錦再生細(xì)胞團(tuán)，并能旺盛繼代生長(zhǎng)。
具體實(shí)施例方式在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步說(shuō)明了本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1本試驗(yàn)采田間五葉地錦盛花期后40天幼果，流水沖洗30min，70％酒精2min，無(wú)菌水洗3次，0.1％HgCl2 10min，無(wú)菌水洗5次，放于鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)吸干表面水分。剝?nèi)スぜ胺N皮，取胚乳(0.3mm左右薄塊)接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基為改良B5附加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 2.0mg.l-1，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1.0mg.l-1，蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L。用1mol/LNaOH或HCl調(diào)pH值為5.8～6.2，高壓蒸汽滅菌20min，培養(yǎng)溫度±1℃黑暗條件下，空氣相對(duì)濕度60％-70％。
胚乳7～10左右變褐，50左右才開(kāi)始出現(xiàn)愈傷，愈傷誘導(dǎo)率為12％，生長(zhǎng)較為緩慢。
誘導(dǎo)出的愈傷組織(白色，糊狀，無(wú)粘性的愈傷組織)，繼代培養(yǎng)基為改良了B5附加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 2.0mg.l-1，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1.0mg.l-1，蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L。獲得愈傷組織為無(wú)色至淡灰白色，松軟，易散，細(xì)胞圓形，胞質(zhì)濃。
將獲得的愈傷組織以纖維素酶(cellulase R-10)0.5％，果膠酶(Pectolyase Y23)0.3％％，甘露醇0.4M，酶解8小時(shí)。五葉地錦胚乳愈傷原生質(zhì)體得率為1.18×106個(gè)/g。
用培養(yǎng)液將原生質(zhì)體密度調(diào)為1～2×105個(gè)/ml，以6mm培養(yǎng)皿進(jìn)行固體培養(yǎng)，每皿加入原生質(zhì)體2ml，置于生物培養(yǎng)箱中25℃暗培養(yǎng)。
培養(yǎng)液為改良B5基本培養(yǎng)基附加水解酪蛋白300mg/l，谷氨酰胺150mg/l，甘氨酸20mg/l，天冬氨酸20mg/l，葡萄糖0.5mmol/l，蔗糖1％，甘露醇0.6M，CaCl2.2H2O 5mmol/l，6-BA 2mg/l，2，4-D 0.5mg/l。固體培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)液添加1.2％瓊脂。
形成愈傷組織后轉(zhuǎn)至改良B5+6-BA1.0+2，4-D0.5的固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，每30天繼代1次，獲得生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織。
實(shí)施例2培養(yǎng)程序均按實(shí)施例1進(jìn)行，所不同之處在于所取幼果為盛花期后45天，第一步在附加附加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 2.5mg.l-1，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1.5mg.l-1，第二步所用繼代培養(yǎng)基為附加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 1.5mg.l-1，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1.0mg.l-1，第三步所用酶液組合為纖維素酶(cellulase R-10)0.5％，果膠酶(Pectolyase Y23)0.6％％，甘露醇0.6M。獲得的原生質(zhì)體所用培養(yǎng)方式為液體淺層培養(yǎng)。
實(shí)施例3培養(yǎng)程序均按實(shí)施例1進(jìn)行，所不同之處在于所取幼果為盛花期后35天，第一步在附加附加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 3.0mg.l-1，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1.5mg.l-1，第二步所用繼代培養(yǎng)基為附加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 2.0mg.l-1，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1.0mg.l-1，第三步所用酶液組合為纖維素酶(cellulase R-10)0.8％，果膠酶(Pectolyase Y23)0.4％％，甘露醇0.4M。獲得的原生質(zhì)體所用培養(yǎng)方式為固液結(jié)合培養(yǎng)。
實(shí)施例4培養(yǎng)程序均按實(shí)施例1進(jìn)行，所不同之處在于所取幼果為盛花期后45天，第一步在附加附加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 1.8mg.l-1，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 0.9mg.l-1，第二步所用繼代培養(yǎng)基為附加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 1.2mg.l-1，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 0.8mg.l-1，第三步所用酶液組合為纖維素酶(cellulase R-10)0.3％，果膠酶(Pectolyase Y23)0.3％％，甘露醇0.3M。獲得的原生質(zhì)體所用培養(yǎng)方式為液體淺層培養(yǎng)。
實(shí)施例5培養(yǎng)程序均按實(shí)施例1進(jìn)行，所不同之處在于所取幼果為盛花期后45天，第一步在附加附加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 1.5mg.l-1，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 0.8mg.l-1，第二步所用繼代培養(yǎng)基為附加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 1.2mg.l-1，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1.2mg.l-1，第三步所用酶液組合為纖維素酶(cellulase R-10)0.5％，果膠酶(Pectolyase Y23)0.4％％，甘露醇0.6M。獲得的原生質(zhì)體所用培養(yǎng)方式為固液結(jié)合培養(yǎng)。
實(shí)施例6
培養(yǎng)程序均按實(shí)施例1進(jìn)行，所不同之處在于所取幼果為盛花期后35天，第一步在附加附加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 2.0mg.l-1，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1.2mg.l-1，第二步所用繼代培養(yǎng)基為附加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 1.6mg.l-1，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 0.5mg.l-1，第三步所用酶液組合為纖維素酶(cellulase R-10)0.6％，果膠酶(Pectolyase Y23)0.8％％，甘露醇0.8M。獲得的原生質(zhì)體所用培養(yǎng)方式為固液結(jié)合培養(yǎng)。
表一B5基本培養(yǎng)基(Gamborg等，1968)成分

權(quán)利要求
1.五葉地錦胚乳原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)技術(shù)，其特征在于以盛花期35-45天后五葉地錦幼果胚乳愈傷，進(jìn)行原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述方法包括五個(gè)階段(1)五葉地錦幼果胚乳誘導(dǎo)愈傷組織(2)胚乳愈傷組織繼代培養(yǎng)(3)愈傷組織酶解分離原生質(zhì)體。(4)原生質(zhì)體培養(yǎng)再生細(xì)胞壁，形成細(xì)胞團(tuán)(5)所獲得細(xì)胞團(tuán)繼代培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于本發(fā)明第(1)、(2)、(5)三個(gè)階段的基本培養(yǎng)基均是改良B5培養(yǎng)基(表一)，pH5.8-6.2。在第(1)步附加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 1.0-3.0mg/l，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 0.5-2.0mg/l；在第(2)步的培養(yǎng)基中所用激素為6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 0.5-2.0mg/l，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 0.5-2.0mg/l；在第(5)步的培養(yǎng)基中所用激素為6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 0.1-1.0mg/l，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 0.1-1.0mg/l。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于第(3)階段酶解原生質(zhì)體所用酶液組合為纖維素酶(cellulase R-10)0.3％-1.0％，果膠酶(Pectolyase Y23)0.3％-1.0％，甘露醇0.2-0.6M，酶解4-12小時(shí)。在第(4)階段原生質(zhì)體培養(yǎng)所用培養(yǎng)方式為液體淺層培養(yǎng)、固液結(jié)合培養(yǎng)、固體培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于第(3)階段酶解原生質(zhì)體所用酶液組合及濃度配比為以下選其一A.纖維素酶(cellulase R-10)0.5％，果膠酶(PectolyaseY23)0.3％％，甘露醇0.4M；B.纖維素酶(cellulase R-10)0.5％，果膠酶(PectolyaseY23)0.6％％，甘露醇0.6M；C.纖維素酶(cellulase R-10)0.8％，果膠酶(PectolyaseY23)0.4％％，甘露醇0.4M；D.纖維素酶(cellulase R-10)0.3％，果膠酶(PectolyaseY23)0.3％％，甘露醇0.3M；E.纖維素酶(cellulase R-10)0.5％，果膠酶(PectolyaseY23)0.4％％，甘露醇0.6M；F.纖維素酶(cellulase R-10)0.6％，果膠酶(PectolyaseY23)0.8％％，甘露醇0.8M。最佳酶解時(shí)間均為8小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于第(4)階段原生質(zhì)體培養(yǎng)所用培養(yǎng)液為改良B5基本培養(yǎng)基附加水解酪蛋白100-500mg/l，谷氨酰胺100-200mg/l，甘氨酸10-50mg/l，天冬氨酸10-50mg/l，甘露醇0.2-1.0M，CaCl2.2H2O 1-5mmol/l，6-BA 1-3mg/l，2，4-D 0.1-1.0mg/l，葡萄糖0.1-1.0mmol/l，蔗糖1％；固體培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)液添加1.2％瓊脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于所述方法包括以下5個(gè)步驟(1)五葉地錦幼果胚乳切塊接種在改良B5培養(yǎng)基附加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 1.0-3.0mg/l，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 0.5-2.0mg/l，pH5.8-6.2，25±1℃黑暗培養(yǎng)，50天左右誘發(fā)出愈傷組織。(2)得到的愈傷組織2次繼代培養(yǎng)在改良B5培養(yǎng)基附加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 0.5-2.0mg/l，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 0.5-2.0mg/l，pH5.8-6.2，25±1℃黑暗條件，獲得無(wú)色至淡灰白色，松軟，易散，細(xì)胞圓形，胞質(zhì)濃的愈傷組織。(3)愈傷組織以纖維素酶(cellulase R-10)0.3％-1.0％，果膠酶(Pectolyase Y23)0.3％-1.0％，甘露醇0.2-0.6M，酶解4-12小時(shí)，獲得胚乳愈傷原生質(zhì)體為1.18×106個(gè)/g。(4)獲得的原生質(zhì)體在液體淺層培養(yǎng)、固液結(jié)合培養(yǎng)、固體培養(yǎng)三種培養(yǎng)方式(改良B5基本培養(yǎng)基附加水解酪蛋白100-500mg/l，谷氨酰胺100-200mg/l，甘氨酸10-50mg/l，天冬氨酸10-50mg/l，甘露醇0.2-1.0M，CaCl2.2H2O 1-5mmol/l，6-BA 1-3mg/l，2，4-D 0.1-1.0mg/l，葡萄糖0.1-1.0mmol/l，蔗糖1％；固體培養(yǎng)基添加瓊脂1.2％。)，原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁形成了新的愈傷組織，新愈傷組織轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基中。(5)所獲得細(xì)胞團(tuán)繼代培養(yǎng)在改良B5培養(yǎng)基附加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 0.1-1.0mg/l，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 0.1-1.0mg/l，pH5.8-6.2，25±1℃黑暗條件下進(jìn)行愈傷組織繼代培養(yǎng)，30天繼代1次，繼代10個(gè)月后仍生長(zhǎng)旺盛。
全文摘要
本發(fā)明涉及以五葉地錦胚乳原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)技術(shù)，包括五個(gè)培養(yǎng)階段(1)五葉地錦幼果胚乳切塊誘導(dǎo)愈傷組織。(2)得到的愈傷組織2次繼代培養(yǎng)獲得無(wú)色至淡灰白色，松軟，易散，細(xì)胞圓形，胞質(zhì)濃的愈傷組織。(3)愈傷組織以纖維素酶(cellulase R－10)、果膠酶(Pectolyase Y23)、甘露醇組合酶解8小時(shí)，獲得胚乳愈傷原生質(zhì)體為1.18×106個(gè)/g。(4)獲得的原生質(zhì)體經(jīng)液體淺層培養(yǎng)、固液結(jié)合培養(yǎng)、固體培養(yǎng)三種方式培養(yǎng)，原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁形成了新的愈傷組織，新愈傷組織轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基中。(5)所獲得細(xì)胞團(tuán)繼代培養(yǎng)，獲得生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織。
文檔編號(hào)C12N5/04GK1752206SQ20051009049
公開(kāi)日2006年3月29日 申請(qǐng)日期2005年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月17日
發(fā)明者孫振元, 李正紅, 江澤慧, 巨關(guān)升, 韓蕾, 楊學(xué)軍, 李云 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所