專利名稱：甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體的分離與純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物原生質(zhì)體的分離與純化方法，具體涉及一種甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體的分離與純化方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物原生質(zhì)體克服了細(xì)胞壁這一屏障，是植物生理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、體細(xì)胞遺傳學(xué)等理論研究的理想材料，而且在基因工程及作物改良新品種培育方面有著重要應(yīng)用前景。近年來，隨著植物分子生物學(xué)發(fā)展，原生質(zhì)體作為一個單細(xì)胞系統(tǒng)廣泛地應(yīng)用在基因定位、基因表達(dá)調(diào)控、RNA沉默機理、細(xì)胞鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)節(jié)機制等方面的研究。甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體的研究始于上世紀(jì)70年代，原生質(zhì)體分離、培養(yǎng)和植株再生也獲得成功。但是，與模式植物煙草或擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體研究相比，甘蔗愈傷組織·原生質(zhì)體分離純化效果不盡理想，植株再生頻率很低，直至今日沒有長足發(fā)展。以甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體為受體材料，開展甘蔗轉(zhuǎn)基因瞬時表達(dá)未見報道。本發(fā)明建立高效、快速的甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體的分離和純化方法，獲得高質(zhì)量、高產(chǎn)量的原生質(zhì)體可作為外源基因表達(dá)、啟動子分析、基因沉默等轉(zhuǎn)基因瞬時表達(dá)研究的受體材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速、高效、簡便的甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體的分離與純化方法，克服現(xiàn)有甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體分離和純化方法存在質(zhì)量和數(shù)量上的不足的問題，為甘蔗外源基因表達(dá)、啟動子分析、基因沉默等轉(zhuǎn)基因瞬時表達(dá)研究提供高質(zhì)量、高產(chǎn)量的甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體。本發(fā)明的目的是通過以下方法實現(xiàn)的。本發(fā)明的甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體的分離與純化方法，包括甘蔗愈傷組織培養(yǎng)、甘蔗懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、甘蔗原生質(zhì)體的分離和甘蔗原生質(zhì)體的純化；其特征在于操作步驟如下
1、甘蔗愈傷組織培養(yǎng)
取消毒后的甘蔗心葉組織，無菌條件下切成1-2 Cm厚的薄片，在MS3固體培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)1-2個月，每隔2周繼代I次；所述MS3固體培養(yǎng)基為MS+0. 5 g/L水解酪蛋白+3mg/L 2, 4-D+30 g/L 鹿糖 +6. O g/L 瓊脂粉；MS 培養(yǎng)基為 1962 年,Murashige 和 Skoog 公開的MS培養(yǎng)基(下同)；
2、甘蔗懸浮細(xì)胞培養(yǎng)
將甘蔗胚性愈傷組織搗碎后，在MS3液體培養(yǎng)基中，28 V暗培養(yǎng)2周，紗布過濾，濾液靜置10-15 min,吸取底部胚性愈傷組織培養(yǎng)液，于恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/秒，28°C暗培養(yǎng)1-2月，每隔I周繼代I次，直至懸浮細(xì)胞系出現(xiàn)；所述MS3液體培養(yǎng)基:MS+0. 5g/L水解酪蛋白+3 mg/L 2, 4-D+30 g/L蔗糖，去離子水補足I升；
3、甘蔗原生質(zhì)體的分離取步驟2的新鮮懸浮細(xì)胞分裝到50 mL離心管，100 g離心2 min ;棄上清液，用酶解緩沖液清洗懸浮細(xì)胞后，100 g離心2 min ;棄上清液，取懸浮細(xì)胞2-3克加入6孔的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，用3 mL酶解反應(yīng)液酶解過夜，分離出甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體；所述酶解緩沖液0. 02mol/L MES+0. 4 mo I/L甘露醇+0. 02 mo I/L氯化鉀，pH 5. 7 ;所述酶解反應(yīng)液2 %纖維素酶+0.1 %果膠酶+0.01 mol/L氯化鈣+0. I %牛血清蛋白，溶解于酶解緩沖液；在酶解反應(yīng)液中，各原料所占的百分比為各原料與酶解緩沖液的重量百分比；
4、甘蔗原生質(zhì)體的純化
用無菌水清洗70 ym孔徑的尼龍網(wǎng)，然后用W5溶液潤洗，取步驟3獲得的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，100 g離心2 min ;棄上清液，冰浴的W5溶液懸浮原生質(zhì)體，100 g離心I min ;棄上清液后即為純化的甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體，在電子顯微鏡下觀察，形態(tài)正常的原生質(zhì)體量達(dá)IO6個/mL ;所述W5溶液2 mmol/L MES+154 mmol/L氯化納+125 mmol/L氯化韓+5 mmol/L氯化鉀，pH 5. I0本發(fā)明還保護利用上述方法分離與純化的甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體在甘蔗轉(zhuǎn)基因 瞬時表達(dá)中的應(yīng)用。本發(fā)明使用的所有化學(xué)試劑為分析純。本發(fā)明的優(yōu)點是，快速從甘蔗胚性愈傷組織培養(yǎng)獲得懸浮細(xì)胞系，并通過酶消解后分離純化獲得質(zhì)量高、數(shù)量足、均一性好的完整原生質(zhì)體，為甘蔗外源基因表達(dá)、啟動子分析、基因沉默等轉(zhuǎn)基因瞬時表達(dá)研究提供理想的實驗材料。


圖I是分離純化后的甘蔗原生質(zhì)體，標(biāo)尺為0. 2 μ m。圖2是pUbi-EYFP-Nos和pUbi-P19_Nos (P19是番茄叢矮病毒編碼的RNA沉默抑制子)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，EYFP基因在原生質(zhì)體上的瞬時表達(dá)，標(biāo)尺為0. 2 _。圖3是pUbi-EYFP-Nos和pUbi- Y b-Nos ( Y b是大麥條紋花葉病毒編碼的RNA沉默抑制子)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，EYFP基因在原生質(zhì)體上的瞬時表達(dá)，標(biāo)尺為0. 2 mm。圖4是pUbi-EYFP-Nos和pUbi_Nos (不含任何沉默抑制子的空載體)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，EYFP基因在原生質(zhì)體上的瞬時表達(dá)，標(biāo)尺為0. 2 mm。圖5是不同啟動子質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后GUS的瞬時表達(dá)活性，其中，A為pPr4-GUS-Nos,B 為 pUbi-GUS-Nos，C 為 p35S-GUS_Nos，D 為 pUbi-Nos (空載體)質(zhì)粒；左側(cè)的標(biāo)尺表示⑶S活性值,單位為pmol 4-MU/ μ g protein · min,圖中誤差線為標(biāo)準(zhǔn)誤。
具體實施例方式為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明，以下結(jié)合實施例加以說明。實施例I :一種甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體的分離與純化方法，包括以下步驟
1、甘蔗愈傷組織培養(yǎng)選取生長正常且無病蟲害的甘蔗梢部，去除外圍的老葉直至最高可見肥厚帶葉和頂部長出的多余葉片，保留25 Cm長的心葉組織；用體積比為75 %的酒精溶液進(jìn)行表面擦洗消毒后，在無菌超凈工作臺里，將甘蔗心葉組織切成I. 5 cm厚的薄片，在MS3固體培養(yǎng)基上，28 °C暗培養(yǎng)I. 5個月，每隔2周繼代I次；
2、甘蔗懸浮細(xì)胞培養(yǎng)挑選致密、金黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織5克，搗碎后，移入100 mL MS3液體培養(yǎng)基，28°C暗培養(yǎng)2周后，將胚性愈傷組織培養(yǎng)液紗布過濾，濾液靜置12min，用移液管吸取底部10 mL細(xì)小胚性愈傷組織培養(yǎng)液，用100 mL MS3液體培養(yǎng)基在恒溫?fù)u床里震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/秒，28°C暗培養(yǎng)1-2月，每隔I周繼代I次，直至細(xì)小、均一的懸浮細(xì)胞系出現(xiàn)。3、取步驟2的新鮮懸浮細(xì)胞分裝到50 mL離心管，或者將步驟2的懸浮細(xì)胞繼代培養(yǎng)3天后，分裝到50 mL離心管；100 g離心2 min ;棄上清液，加入40 mL酶解緩沖液清洗懸浮細(xì)胞，100 g離心2 min ;棄上清液，取懸浮細(xì)胞2-3克加入6孔的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，用3 mL酶解反應(yīng)液酶解過夜，分離出甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體；
4、用無菌水清洗70 μ m孔徑的尼龍網(wǎng)，然后用W5溶液潤洗，將步驟3酶解過夜的甘蔗懸浮細(xì)胞通過尼龍網(wǎng)過濾，取5 mL濾液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，100 g離心2 min ;棄上清液，I mL冰浴的W5溶液懸浮原生質(zhì)體，100 g離心I min ;棄上清液后即為純化的甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體?！?br> 取I mL冰浴的W5溶液再次懸浮原生質(zhì)體；用血球計數(shù)板在100倍顯微鏡下計算原生質(zhì)體數(shù)量，完整的原生質(zhì)體如圖I所示，低溫貯藏備用。實施例2 :利用從甘蔗品種CP72-1210心葉愈傷組織分離、純化的原生質(zhì)體，研究不同植物病毒編碼的沉默抑制子的活性。I、PEG遺傳轉(zhuǎn)化
1.1將制備好的甘蔗CP72-1210愈傷組織原生質(zhì)體冰浴30 min，去除W5溶液，用1_2mL MMG溶液懸浮原生質(zhì)體濃度至每毫升2 X IO5個。I. 2 分別取 5 μ L 的 pUbi-EYFP-Nos 和 pUbi-P19_Nos 質(zhì)粒 DNA (I μ g/μ 1),5μ L 的 pUbi-EYFP-Nos 和 pUbi- y b-Nos 質(zhì)粒 DNA (I μ g/ μ I )，5 μ L 的 pUbi-EYFP - Nos和 pUbi-Nos 質(zhì)粒 DNA (I μ g/ μ I)到 2 mL 離心管。1.3加入100 μ L甘蔗CP72-1210原生質(zhì)體，混合后，加入110 yL 40%聚乙二醇溶液(PEG-4000)，混勻，室溫溫浴5-15 min。1.4加入440 uL W5溶液，混勻，終止遺傳轉(zhuǎn)化，100 g離心2 min。棄上清液，I mLWI溶液懸浮原生質(zhì)體，然后移入6孔的細(xì)胞培養(yǎng)板，室溫放置24 h。MMG 溶液4 mmol/L MES+0. 4 mol/L 甘露醇 +15 mmol/L 氯化鎂，pH 5. 7。WI 溶液4 mmol/L MES+0. 5 mol/L 甘露醇 +20 mmol/L 氯化鉀，pH 5· 7。聚乙二醇轉(zhuǎn)化液40%(W/V)聚乙二醇(PEG4000)+0. 2 mol/L 甘露醇+100 mmol/L氯化鈣。2、在熒光顯微鏡下(YFP熒光濾片)觀察表達(dá)EYFP原生質(zhì)體數(shù)目，如圖2、圖3和圖4所示，不同植物病毒編碼的沉默抑制子的活性，表現(xiàn)為P19和Yb沉默抑制子可以提高外源基因EYFP表達(dá)水平，平均增幅分別達(dá)63%和56%。實例3 :利用從甘蔗品種CP72-1210心葉愈傷組織分離、純化的原生質(zhì)體，研究不同啟動子的活性。I、轉(zhuǎn)基因瞬時表達(dá)
1.1將制備好的甘蔗CP72-1210愈傷組織原生質(zhì)體冰浴30 min，去除W5溶液，用1_2mL MMG溶液懸浮原生質(zhì)體濃度至每毫升2 X IO5個。I. 2 分別取 10 μ L 質(zhì)粒 DNA (pPr4-GUS-N0S、pUbi-GUS-NOS、p35S-GUS-N0S，10μ g)到2 mL離心管中，設(shè)空載體(pUbi-NOS)、水為空白對照。1.3加入100 μ L原生質(zhì)體，混合后，加入110 μ L 40 %聚乙二醇轉(zhuǎn)化液，混勻，室溫溫浴5-15 min。1.4加入440 μ L W5溶液輕輕混勻，終止遺傳轉(zhuǎn)化，100 g離心2 min。棄上清液，I mL WI溶液懸浮原生質(zhì)體，然后移入6孔的細(xì)胞培養(yǎng)板，室溫放置24 h。2、⑶S活性測定
2.1將甘蔗CP72-1210愈傷組織原生質(zhì)體裝入I. 5 mL離心管，100 g離心2 min，棄上清液，取25 μ L等量原生質(zhì)體分裝到I. 5 mL離心管。2.2加入25 μ L MUG底物反應(yīng)液，37 °C反應(yīng)60 min。
2.3加入950 μ L碳酸鈉溶液(O. 2 mol/L)終止反應(yīng)。2.4用熒光分光光度計測定熒光強度。2. 5原生質(zhì)質(zhì)體總蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)。2.6 4-MU標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
在O. 2 mol/L碳酸鈉溶液的終止液中加入4-MU，配成不同4-MU濃度的溶液，然后利用熒光分光光度計測其產(chǎn)生的熒光(激發(fā)光365 nm,發(fā)射光455 nm)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2. 7⑶S活性計算
GUS活性用每微克蛋白每分鐘形成的4-MU的pmol表示，計算公式為⑶S活性=MUG分解形成的4-MU (pmol) + [可溶解性蛋白(μ g) X反應(yīng)時間(min)]。實驗重復(fù)3次。GUS緩沖液50 mmol/L 磷酸緩沖液(pH 7.0),10 mmol/L β-巰基乙醇，10 mmol/L 乙二胺四乙酸(pH 8. 0),0. 1% (v/v) Triton X-IOO0 MUG底物反應(yīng)液2 mmol/L MUG溶解于⑶S緩沖液。 2.8不同啟動子活性差異如圖5所示，不同啟動子活性有所差異，啟動子活性依次為 Pr4、Ubi、35S，其驅(qū)使 GUS 活性分別為 40. 86、15. 71,4. 99 pmol 4-MU/ μ gprotein · min。
權(quán)利要求
1.一種甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體的分離與純化方法，包括甘蔗愈傷組織培養(yǎng)、甘蔗懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、甘蔗原生質(zhì)體的分離和甘蔗原生質(zhì)體的純化；其特征在于操作步驟如下 (1)甘蔗愈傷組織培養(yǎng) 取消毒后的甘蔗心葉組織，無菌條件下切成1-2 Cm厚的薄片，在MS3固體培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)1-2個月，每隔2周繼代I次；所述MS3固體培養(yǎng)基為MS+0.5 g/L水解酪蛋白+3mg/L 2, 4-D+30 g/L 鹿糖 +6. O g/L 瓊脂粉；MS 培養(yǎng)基為 1962 年,Murashige 和 Skoog 公開的MS培養(yǎng)基； (2)甘蔗懸浮細(xì)胞培養(yǎng) 將甘蔗胚性愈傷組織搗碎后，在MS3液體培養(yǎng)基中，28 0C暗培養(yǎng)2周，紗布過濾，濾液靜置10-15 min,吸取底部胚性愈傷組織培養(yǎng)液，于恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/秒，28 V暗培養(yǎng)1-2月，每隔I周繼代I次，直至懸浮細(xì)胞系出現(xiàn)；所述MS3液體培養(yǎng)基:MS+0. 5 g/L水解酪蛋白+3 mg/L 2, 4-D+30 g/L蔗糖，去離子水補足I升； (3)甘蔗原生質(zhì)體的分離 取步驟(2)的新鮮懸浮細(xì)胞分裝到50 mL離心管，100 g離心2 min;棄上清液，用酶解緩沖液清洗懸浮細(xì)胞后，100 g離心2 min ;棄上清液，取懸浮細(xì)胞2-3 g加入6孔的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，用3 mL酶解反應(yīng)液酶解過夜，分離出甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體；所述酶解緩沖液O.02 mol/L MES+0. 4 mol/L甘露醇+0. 02 mol/L氯化鉀，pH 5. 7 ;所述酶解反應(yīng)液2 %纖維素酶+0.1 %果膠酶+0.01 mol/L氯化鈣+0. I %牛血清蛋白，溶解于酶解緩沖液；在酶解反應(yīng)液中，各原料所占的百分比為各原料與酶解緩沖液的重量百分比； (4)甘蔗原生質(zhì)體的純化 用無菌水清洗70 μ m孔徑的尼龍網(wǎng)，然后用W5溶液潤洗，取步驟(3)獲得的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，100 g離心2 min ;棄上清液，冰浴的W5溶液懸浮原生質(zhì)體，100 g離心I min ;棄上清液后即為純化的甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體；所述W5溶液2 mmol/L MES+154mmol/L 氯化納+125 mmol/L 氯化|丐+5 mmol/L 氯化鉀，pH 5.7。
2.由權(quán)利要求I的方法分離與純化的甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體在甘蔗轉(zhuǎn)基因瞬時表達(dá)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種甘蔗愈傷組織原生質(zhì)體的分離與純化方法，包括甘蔗愈傷組織培養(yǎng)、甘蔗懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、甘蔗原生質(zhì)體的分離和甘蔗原生質(zhì)體的純化。利用本發(fā)明的方法可以快速從甘蔗胚性愈傷組織培養(yǎng)獲得懸浮細(xì)胞系，并通過酶消解后分離純化獲得質(zhì)量高、數(shù)量足、均一性好的完整原生質(zhì)體，為甘蔗外源基因表達(dá)、啟動子分析、基因沉默等轉(zhuǎn)基因瞬時表達(dá)研究提供理想的實驗材料。
文檔編號C12N5/04GK102899282SQ20121039187
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月16日
發(fā)明者高三基, 米爾科夫艾瑞克, 樸鐘元, 陳如凱, 傅華英, 付為林, 林藝華, 吳小斌 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)