專利名稱：一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法，具體地說，涉及一種應(yīng)用毛細(xì)管電泳檢測原生質(zhì)體與單鏈DNA(single-stranded DNA, ssDNA)或藥物的相互作用，實現(xiàn)ssDNA或藥物對原生質(zhì)體的識別，進(jìn)而實現(xiàn)對細(xì)菌的檢測，屬于生物分析領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，微生物檢測分析的方法主要有生理生化鑒定、氣相色譜、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、傅里葉變換紅外光譜、三維熒光光譜以及毛細(xì)管電泳等方法。其中，毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE),又稱高效毛細(xì)管電泳 (highperformance capillary electrophoresis, HPCE),是一類以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，以樣品的多種特性，如電荷、大小、等電點、極性、親和行為以及相分配特性等為根據(jù)的液相微分離分析技術(shù)。毛細(xì)管電泳的工作原理為某物質(zhì)在受到其它物質(zhì)的各種作用，包括化學(xué)、物理和生物的作用后，該物質(zhì)自身的荷電情況、幾何尺寸、構(gòu)型及具有原性質(zhì)形態(tài)的濃度等性質(zhì)將發(fā)生改變。在毛細(xì)管電泳譜圖中，所述改變表現(xiàn)為該物質(zhì)的遷移時間、峰高、峰面積的改變。CE是分析科學(xué)中繼高效液相色譜之后的又一重大進(jìn)展，它使分析科學(xué)得以從微升水平加入納升水平，并使單細(xì)胞分析，乃至單分子分析成為可能，生物大分子如蛋白質(zhì)的分離分析也因此有了新的轉(zhuǎn)機。毛細(xì)管電泳具備以下優(yōu)點高效，自由溶液CE的效率在105 106理論塔板之間；快速，幾十秒至十幾分鐘完成分離；微量，進(jìn)樣所需的樣品體積可小到luL，試劑消耗體積在I 50nL ；多模式，僅需一臺儀器就可根據(jù)需要選用不同的分離模式；樣品對象廣，可從無機離子到整個細(xì)胞，具有很強的分析功能和潛力；自動，通常使用水溶液，對人對環(huán)境無害，實屬“綠色”分析技術(shù)。目前，CE已成為重要的分離技術(shù)，在生物、醫(yī)藥以及化工等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前
旦
-5^ O基于小分子與微生物的相互作用對微生物進(jìn)行檢測，目前已有關(guān)于核酸分子與微生物發(fā)生相互作用識別檢測微生物的報道，但能夠與核酸分子發(fā)生相互作用的微生物非常少，因為微生物的細(xì)胞壁具有強屏蔽作用，使微生物能與核酸分子相互作用的位點非常少， 即使有相互作用的位點，這些位點的相互作用力也非常微弱，所以大大限制了利用小分子與微生物的相互作用以識別檢測微生物的準(zhǔn)確率和應(yīng)用范圍。原生質(zhì)體指在人為條件下，去除原有細(xì)胞壁或抑制新生細(xì)胞壁后所得到的僅有一層細(xì)胞膜包裹著的圓球狀對滲透敏感的細(xì)菌?，F(xiàn)有技術(shù)中主要是通過酶法去掉細(xì)菌的細(xì)胞壁制備得到原生質(zhì)體，由不同細(xì)菌制備的原生質(zhì)體具有該細(xì)菌的特性，原生質(zhì)體在適宜條件下可生長繁殖形成與原細(xì)菌生物活性基本相同的細(xì)菌，因此對原生質(zhì)體的識別即等同于對原生質(zhì)體所屬細(xì)菌的識別。研究ssDNA或藥物對原生質(zhì)體的識別，進(jìn)而實現(xiàn)對相關(guān)細(xì)菌的檢測，具有重要的理論和應(yīng)用價值，目前還未見有關(guān)于應(yīng)用毛細(xì)管電泳檢測原生質(zhì)體與 ssDNA或藥物的相互作用實現(xiàn)對細(xì)菌檢測的方法的報道。

發(fā)明內(nèi)容
為實現(xiàn)準(zhǔn)確、快速、簡便、低成本地檢測細(xì)菌，本發(fā)明的目的在于提供一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法，所述方法應(yīng)用毛細(xì)管電泳檢測原生質(zhì)體與ssDNA 或藥物的相互作用，實現(xiàn)ssDNA或藥物對原生質(zhì)體的識別，進(jìn)而實現(xiàn)對細(xì)菌的檢測；可克服現(xiàn)有核酸分子與微生物發(fā)生相互作用識別檢測微生物的方法中存在的相互作用位點少以及相互作用力弱的缺陷，具有準(zhǔn)確、快速、簡便以及成本低特點。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法，所述方法步驟如下(I)制備原生質(zhì)體采用生物領(lǐng)域中制備細(xì)菌原生質(zhì)體的常規(guī)技術(shù)手段進(jìn)行制備。(2)毛細(xì)管電泳檢測用樣品配制將待檢測的細(xì)菌原生質(zhì)體和與所述原生質(zhì)體相互作用的ssDNA或藥物采用毛細(xì)管電泳緩沖液配制成樣品，樣品中，原生質(zhì)體懸液的濃度為IO5 109CFU/mL，ssDNA溶液的濃度為2 20 μ M,藥物溶液的濃度為O. 5 10mmol/L。(3)毛細(xì)管電泳檢測樣品將步驟(2)制備得到的樣品進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，所述毛細(xì)管電泳為常規(guī)毛細(xì)管電泳技術(shù)。其中，當(dāng)毛細(xì)管電泳為毛細(xì)管區(qū)帶電泳時，原生質(zhì)體懸液的濃度為IO7 IO9CFU/ mL ；ssDNA溶液的濃度為2 20 μ M ;藥物溶液的濃度為O. 5 lOmmol/L ;將所述原生質(zhì)體懸液和ssDNA溶液混合或?qū)⒃|(zhì)體懸液和藥物溶液混合得到毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測用樣品。檢測時，將樣品轉(zhuǎn)移至毛細(xì)管區(qū)帶電泳進(jìn)樣瓶中，采用壓力進(jìn)樣或電進(jìn)樣，使樣品進(jìn)入毛細(xì)管一端；然后加電壓進(jìn)行電泳，使樣品在毛細(xì)管內(nèi)移動并通過紫外檢測器或熒光檢測器；此時，在選定的波長下檢測原生質(zhì)體與ssDNA或藥物的相互作用，可檢測到明顯復(fù)合物的產(chǎn)生，游離分子濃度降低，實現(xiàn)ssDNA或藥物對原生質(zhì)體的識別。當(dāng)毛細(xì)管電泳為親和毛細(xì)管電泳時，原生質(zhì)體懸液的濃度為IO6 109CFU/mL ； ssDNA溶液的濃度為2 20 μ M ;藥物溶液的濃度為O. 5 10mmol/L ；檢測時，預(yù)先將原生質(zhì)體懸液充滿毛細(xì)管；采用壓力進(jìn)樣，使ssDNA溶液或藥物溶液進(jìn)入毛細(xì)管一端；然后加電壓進(jìn)行電泳，在電泳的過程中ssDNA或藥物會與原生質(zhì)體發(fā)生相互作用；通過紫外檢測器或熒光檢測器可檢測隨著原生質(zhì)體濃度的增大，ssDNA或藥物出峰時間逐漸向后偏移，說明原生質(zhì)體與ssDNA或藥物發(fā)生了相互作用，偏移越大，作用越強；實現(xiàn)了 ssDNA或藥物分子對原生質(zhì)體的識別。紫外檢測器檢測時采用的紫外波長范圍為180 600nm。激光誘導(dǎo)熒光檢測器 (LIF)的激發(fā)波長為488nm或635nm，發(fā)射波長為520nm。當(dāng)待檢測的細(xì)菌原生質(zhì)體為大腸桿菌原生質(zhì)體或嗜酸乳桿菌的原生質(zhì)體時，優(yōu)選毛細(xì)管電泳緩沖液由硼酸根離子濃度為50mM，pH = 8. 7的硼酸-硼砂緩沖液與lmol/L的蔗糖溶液以體積比為I : I混合而成；ssDNA的核苷酸序列為人工合成的核苷酸序列5’-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG- (40N) -CCT ATGCGT GCT ACC GTG M-3’，即核苷酸序列表中數(shù)字標(biāo)識符〈210〉所表示的序列標(biāo)識符I所述的核苷酸序列，即核苷酸序列表中SEQ ID No. I ； 藥物為表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)或二苯乙烯苷。優(yōu)選毛細(xì)管電泳所用毛細(xì)管的長度為30 100cm，內(nèi)徑為10 100 μ m。采用壓力進(jìn)樣時的壓力為500 25000Pa，進(jìn)樣3 30s ;采用電進(jìn)樣方式時，電進(jìn)樣條件為500 30KV，3 30s。加電壓時的電泳電壓O 30KV。有益效果I.本發(fā)明提供了一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法，所述方法采用細(xì)菌的原生質(zhì)體用于與ssDNA或藥物相互作用，通過毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測，提供了一種簡單、實用、快速和低成本檢測細(xì)菌的新方法；2.本發(fā)明提供了一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法，所述方法中采用細(xì)菌的原生質(zhì)體作為檢測對象，原生質(zhì)體制備操作簡單、成熟可靠且不需要復(fù)雜的前處理，由不同的細(xì)菌制備的原生質(zhì)體具有專一的特性，對原生質(zhì)體的識別即等同于對所述細(xì)菌的識別；采用原生質(zhì)體作為檢測對象可以克服用細(xì)菌作為檢測對象時細(xì)胞壁的強屏蔽作用、作用位點少和作用強度弱等不利因素，原生質(zhì)體暴露了細(xì)菌細(xì)胞膜上的各種酶及蛋白，大大增加了與ssDNA或藥物相互作用的結(jié)合位點，ssDNA或藥物更易與原生質(zhì)體相互作用形成復(fù)合物，使檢測的準(zhǔn)確率更高，適用對象范圍更廣；3.本發(fā)明提供了一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法，所述方法中選用與原生質(zhì)體特異性結(jié)合的ssDNA或藥物對原生質(zhì)體進(jìn)行識別檢測，對原生質(zhì)體具有很強的相互作用，且具有專一性；4.本發(fā)明提供了一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法，所述方法中通過毛細(xì)管電泳檢測原生質(zhì)體與ssDNA或藥物發(fā)生的相互作用，具有毛細(xì)管電泳在儀器成本、實驗成本、操作技術(shù)和試劑消耗量少等方面的優(yōu)勢；5.本發(fā)明提供了一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法，所述方法中的原生質(zhì)體電泳后仍具有生物活性，在適宜條件下可恢復(fù)其細(xì)胞壁，生長繁殖形成菌落恢復(fù)到細(xì)菌狀態(tài)，進(jìn)一步證明可通過ssDNA或藥物對原生質(zhì)體的識別進(jìn)而識別細(xì)菌；6.本發(fā)明提供了一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法，所述方法可用特定的小分子、藥物或原生質(zhì)體的適配體對原生質(zhì)體進(jìn)行檢測，進(jìn)而篩選出特定的細(xì)菌。


圖I為實施例2通過激光誘導(dǎo)熒光檢測器檢測到的毛細(xì)管區(qū)帶電泳譜圖。圖2為實施例2中大腸桿菌原生質(zhì)體電泳后平板培養(yǎng)所拍的照片。圖3為實施例3通過激光誘導(dǎo)熒光檢測器檢測到的毛細(xì)管區(qū)帶電泳譜圖。圖4為實施例3中嗜酸乳桿菌原生質(zhì)體電泳后平板培養(yǎng)所拍的照片。圖5為實施例4通過紫外檢測器檢測到的親和毛細(xì)管電泳譜圖。圖6為實施例5通過紫外檢測器檢測到的親和毛細(xì)管電泳譜圖。圖7為實施例6通過紫外檢測器檢測到的親和毛細(xì)管電泳譜圖。
圖8為實施例7通過紫外檢測器檢測到的親和毛細(xì)管電泳譜圖。圖9為實施例8通過紫外檢測器檢測到的親和毛細(xì)管電泳譜圖。圖10為實施例9通過紫外檢測器檢測到的親和毛細(xì)管電泳譜圖。
具體實施例方式為了充分說明本發(fā)明的特性以及實施本發(fā)明的方式，下面給出實施例。以下實施例I 9中，硼酸-硼砂緩沖液為硼酸根離子濃度為50mM，pH = 8. 7的硼酸-硼砂緩沖液；溶菌酶為20000U/g，購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；電泳緩沖液由硼酸根離子濃度為50mM，pH = 8. 7的硼酸-硼砂緩沖液與lmol/L 的蔗糖溶液以體積比為I:I混合而成；ssDNA的核苷酸序列為人工合成的核苷酸序列5’-AGC AGC ACA GAGGTC AGA TG- (40N) -CCT ATG CGT GCT ACC GTG AA-3’，即核苷酸序列表中 SEQ ID No. I ；毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測使用的毛細(xì)管電泳儀為美國Beckman公司生產(chǎn)的Beckman P/ACETM MDQ毛細(xì)管電泳儀；親和毛細(xì)管電泳檢測使用的毛細(xì)管電泳儀為美國Agilent公司的 AgilentTechnologoies 7100 毛細(xì)管電泳儀；激光誘導(dǎo)熒光檢測器(LIF)購自美國Beckman公司；藥物表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和二苯乙烯苷均購自北京市理化分析測試中心。在實施例4 9中，中性標(biāo)記物二甲基亞砜(DMSO)添加量(體積)非常少,對樣品ssDNA和藥物的濃度影響忽略不計。實施例I培養(yǎng)細(xì)菌(I)在超凈工作臺上接種大腸桿菌，從平板上挑取大腸桿菌單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)12h，溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，得到培養(yǎng)好的大腸桿菌。(2)在超凈工作臺上接種嗜酸乳桿菌，從平板上挑取嗜酸乳桿菌單菌落，接種于 MRS液體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)48h，溫度為37°C，得到培養(yǎng)好的嗜酸乳桿菌。實施例2(I)取實施例I培養(yǎng)好的大腸桿菌ImL,在3000r/min下離心5min,棄上清得到沉淀，將沉淀用硼酸-硼砂緩沖液離心洗滌3次，向洗滌后的沉淀中加入已在37°C預(yù)熱5min 的濃度為12g/L的溶菌酶100 μ L、硼酸-硼砂緩沖液50 μ L和2mol/L的蔗糖溶液50 μ L， 得到混合溶液1，將混合溶液I置于離心管中放入37°C的水浴鍋中水浴25min，再向混合溶液I中加入O. 05mol/L的乙二胺四乙酸(EDTA) 50 μ L，得到混合溶液2，其中EDTA的濃度為 O. Olmol/L，混合溶液2繼續(xù)在37°C下水浴15min，得到大腸桿菌的原生質(zhì)體混合溶液；將所述大腸桿菌的原生質(zhì)體混合溶液在3000r/min離心5min,棄上清,沉淀用電泳緩沖液離心洗滌3次，得到的沉淀為大腸桿菌的原生質(zhì)體，將所述原生質(zhì)體加入200μ L的電泳緩沖液中懸浮備用。(2)用電泳緩沖液配制濃度為109CFU/mL的大腸桿菌原生質(zhì)體懸液和濃度為4 μ M的ssDNA溶液，并將它們按體積比為I : I的比例充分混合均勻，得到樣品。(3)將內(nèi)徑為75m、柱長為50. 2cm的熔融石英毛細(xì)管用O. IM的NaOH溶液沖洗 6min,然后用三蒸水沖洗3min,再用電泳緩沖液沖洗4min。采用毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳，檢測ssDNA與原生質(zhì)體的相互作用。檢測時，將樣品轉(zhuǎn)移至毛細(xì)管區(qū)帶電泳進(jìn)樣瓶中，采用壓力進(jìn)樣，使樣品進(jìn)入熔融石英毛細(xì)管一端；然后加電壓進(jìn)行電泳，使樣品在熔融石英毛細(xì)管內(nèi)移動并通過激光誘導(dǎo)熒光檢測器；所述激光誘導(dǎo)熒光檢測器的激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為520nm ;其中，所述毛細(xì)管區(qū)帶電泳采用壓力進(jìn)樣時的壓力為 O. 5psi(lpsi = 6. 89X103Pa，即 3445Pa)，進(jìn)樣 5s,電泳電壓為 20KV，毛細(xì)管溫度為 25。。。相同毛細(xì)管區(qū)帶電泳條件下，還分別對大腸桿菌原生質(zhì)體懸液和ssDNA溶液單獨進(jìn)樣進(jìn)行了檢測。檢測完畢后的電泳圖譜如圖I所示，其中譜線I為大腸桿菌原生質(zhì)體懸液單獨進(jìn)樣時的檢測結(jié)果，因為大腸桿菌原生質(zhì)體的熒光強度很低，因此很難檢測到，未出現(xiàn)特征峰；其中譜線3為ssDNA溶液單獨進(jìn)樣時的檢測結(jié)果，因為ssDNA帶有熒光，可檢測到其熒光吸收，因此出現(xiàn)游離ssDNA的特征峰；譜線2為大腸桿菌原生質(zhì)體懸液與ssDNA溶液混合均勻后的樣品檢測結(jié)果，可明顯檢測到樣品具有多個相鄰的特征峰，且其中游離ssDNA的特征峰明顯降低，實現(xiàn)了 ssDNA對大腸桿菌原生質(zhì)體的識別，進(jìn)而實現(xiàn)了對大腸桿菌的檢測。收集熔融石英毛細(xì)管出口端樣品進(jìn)行平板培養(yǎng)，培養(yǎng)基為LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時間為12小時，從圖2中可以看出經(jīng)過電泳后的大腸桿菌原生質(zhì)體經(jīng)過培養(yǎng)可恢復(fù)其細(xì)胞壁，生長繁殖形成菌落，恢復(fù)到原大腸桿菌狀態(tài)。實施例3(I)取實施例I培養(yǎng)好的嗜酸乳桿菌2mL,在3000r/min下離心5min,棄上清得到沉淀，沉淀用硼酸-硼砂緩沖液離心洗滌3次，向洗滌后的沉淀中加入已在37°C預(yù)熱5min 的濃度為24g/L的溶菌酶100 μ L、硼酸-硼砂緩沖液50 μ L和2mol/L的蔗糖溶液50 μ L， 得到混合溶液1，將混合溶液I置于離心管中放入37°C的水浴鍋中水浴30min，再向混合溶液I中加入O. 05mol/L的EDTA 50 μ L，得到混合溶液2，其中EDTA的濃度為O. 01mol/L,混合溶液2繼續(xù)在37°C下水浴20min，得到嗜酸乳桿菌的原生質(zhì)體混合溶液；將所述嗜酸乳桿菌原生質(zhì)體混合溶液在3000r/min離心5min，棄上清，沉淀用電泳緩沖液離心洗滌3次，得到的沉淀為嗜酸乳桿菌原生質(zhì)體，將所述原生質(zhì)體加入200μ L的電泳緩沖液懸浮備用。(2)用電泳緩沖液配制濃度為109CFU/mL的嗜酸乳桿菌原生質(zhì)體懸液和濃度為 4 μ M的ssDNA溶液，并將它們按體積比I : I充分混合均勻，得到樣品。(3)將內(nèi)徑為75 μ m,柱長為50. 2cm的熔融石英毛細(xì)管用O. IM的NaOH溶液沖洗 6min,然后用三蒸水沖洗3min,再用電泳緩沖液沖洗4min。采用毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測ssDNA與嗜酸乳桿菌原生質(zhì)體的相互作用。檢測時，將樣品轉(zhuǎn)移至毛細(xì)管區(qū)帶電泳進(jìn)樣瓶中，采用壓力進(jìn)樣，使樣品進(jìn)入熔融石英毛細(xì)管一端；然后加電壓進(jìn)行電泳， 使樣品在熔融石英毛細(xì)管內(nèi)移動并通過激光誘導(dǎo)熒光檢測器；所述激光誘導(dǎo)熒光檢測器的激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為520nm。其中，所述毛細(xì)管區(qū)帶電泳采用壓力進(jìn)樣時的壓力為O. 5psi，進(jìn)樣5s，電泳電壓為20KV，毛細(xì)管溫度為25°C。相同毛細(xì)管區(qū)帶電泳條件下，還分別對嗜酸乳桿菌原生質(zhì)體懸液和ssDNA溶液單獨進(jìn)樣進(jìn)行了檢測。檢測完畢后的電泳圖譜如圖3所示，其中譜線I為嗜酸乳桿菌原生質(zhì)體懸液單獨進(jìn)樣時的檢測結(jié)果，因為嗜酸乳桿菌原生質(zhì)體的熒光強度很低，因此很難檢測到，未出現(xiàn)特征峰；其中譜線3為ssDNA溶液單獨進(jìn)樣時的檢測結(jié)果，因為ssDNA帶有熒光，可檢測到其熒光吸收，因此出現(xiàn)游離ssDNA的特征峰；譜線2為嗜酸乳桿菌原生質(zhì)體懸液與ssDNA溶液混合均勻后的樣品檢測結(jié)果，可明顯檢測到樣品具有多個相鄰的特征峰，且其中游離ssDNA 的特征峰明顯降低，實現(xiàn)了 ssDNA對嗜酸乳桿菌原生質(zhì)體的識別，進(jìn)而實現(xiàn)了對嗜酸乳桿菌的檢測。收集熔融石英毛細(xì)管出口端樣品進(jìn)行平板培養(yǎng)，培養(yǎng)基為MRS固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時間為36小時，從圖4中可以看出經(jīng)過電泳后的嗜酸乳桿菌原生質(zhì)體經(jīng)過培養(yǎng)可恢復(fù)其細(xì)胞壁，生長繁殖形成菌落，恢復(fù)到原嗜酸乳桿菌狀態(tài)。實施例4(I)同實施例I步驟(I)。(2)用電泳緩沖液分別配置不同濃度的大腸桿菌原生質(zhì)體懸液，如表I所示，用電泳緩沖液配置濃度為10 μ M的ssDNA溶液，所述ssDNA溶液中添加有中性標(biāo)記物DMS0。(3)對不同濃度的大腸桿菌原生質(zhì)體懸液與ssDNA溶液之間的相互作用分別采用毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行親和毛細(xì)管電泳檢測如下將內(nèi)徑為75 μ m,柱長為48. 5cm的熔融石英毛細(xì)管用O. IM的NaOH溶液沖洗6min, 然后用三蒸水沖洗3min，再用電泳緩沖液沖洗4min。檢測時，預(yù)先將大腸桿菌原生質(zhì)體懸液充滿熔融石英毛細(xì)管；采用壓力進(jìn)樣，使ssDNA溶液進(jìn)入熔融石英毛細(xì)管一端；然后加電壓進(jìn)行電泳，使用紫外檢測器進(jìn)行檢測，檢測波長為195nm。在電泳的過程中ssDNA會與大腸桿菌原生質(zhì)體發(fā)生相互作用。其中，所述親和毛細(xì)管電泳采用壓力進(jìn)樣時的壓力為50mbar(lmbar = IOOPaJP 5000Pa)，進(jìn)樣5s，電泳電壓為20KV，毛細(xì)管溫度為25°C。在進(jìn)行上述親和毛細(xì)管電泳時，電泳液還對ssDNA溶液單獨進(jìn)樣進(jìn)行了檢測。檢測完畢后的電泳圖譜如圖5所示，其中，譜線I是ssDNA溶液單獨進(jìn)樣時的檢測結(jié)果，出現(xiàn)兩個特征峰，前一個峰為中性標(biāo)記物DMSO的特征峰，后一個峰為ssDNA的特征峰；譜線2 8分別為不同濃度的大腸桿菌原生質(zhì)體懸液與ssDNA溶液之間的相互作用的檢測結(jié)果，每條譜線具體對應(yīng)的大腸桿菌原生質(zhì)體濃度如表I所示，其中大腸桿菌原生質(zhì)體的單位為CFU/mL。從譜線2 8中可以看出隨著電泳緩沖液中大腸桿菌原生質(zhì)體濃度的增加，ssDNA的特征峰的位置會逐漸向后偏移，說明大腸桿菌原生質(zhì)體與ssDNA發(fā)生了相互作用，偏移越大，作用越強，實現(xiàn)了 ssDNA對大腸桿菌原生質(zhì)體的識別，進(jìn)而實現(xiàn)了對大腸桿菌的檢測。表I
權(quán)利要求
1.一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法其特征在于步驟(I)原生質(zhì)體；2)毛細(xì)管電泳檢測用樣品配制將檢測的原生質(zhì)體和與所述原生質(zhì)體相互作用的 ssDNA或藥物采用毛細(xì)管電泳緩沖液配制成樣品，樣品中，原生質(zhì)體懸液，ssDNA溶液的，藥物溶液的濃度為；(3)將步驟(2)制備得到的樣品進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法其特征在于當(dāng)毛細(xì)管電泳為毛細(xì)管區(qū)帶電泳時，原生質(zhì)體懸液的濃度為107109CFU/mL ;ssDNA溶液濃度為220 μ M ;藥物溶液濃度為O. 510mmol/L將所述原生質(zhì)體懸液和ssDNA混合或?qū)⒃|(zhì)體懸液和藥物溶液混合得到毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測用樣品，采用紫外檢測器或熒光檢測器對電泳結(jié)果進(jìn)行檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法其特征在于當(dāng)毛細(xì)管電泳為親和毛細(xì)管電泳時，原生質(zhì)體懸液的濃度為106109CFU/mL ;ssDNA溶液的濃度為220 μ M ;藥物溶液的濃度為O. 510mmol/L，采用紫外檢測器或熒光檢測器對電泳結(jié)果進(jìn)行檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法其特征在于紫外檢測器的紫外波長為180600nm ;熒光檢測器為激光誘導(dǎo)熒光檢測器，激發(fā)波長為488nm635nm,發(fā)射波長為520nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法其特征在于當(dāng)待檢測的以核苷酸，即核苷酸序列表中的SEQ ID No. I。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法其特征在于毛細(xì)管電泳所用毛細(xì)管的長度為30100cm,內(nèi)徑為10100 μ m。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法其特征在于毛細(xì)管電泳采用壓力進(jìn)樣，進(jìn)樣時的壓力為50025000，進(jìn)樣330s。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法其特征在于毛細(xì)管電泳采用電進(jìn)樣，電進(jìn)樣條件為50030KV，330s。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法其特征在于毛細(xì)管電泳的電泳電壓為030KV。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用原生質(zhì)體通過毛細(xì)管電泳檢測細(xì)菌的方法，所述方法如下(1)制備原生質(zhì)體；(2)將待檢測的細(xì)菌原生質(zhì)體和與所述原生質(zhì)體相互作用的ssDNA或藥物用毛細(xì)管電泳緩沖液配制成樣品，樣品中，原生質(zhì)體懸液的濃度為105～109CFU/mL，ssDNA溶液的濃度為2～20μM，藥物溶液的濃度為0.5～10mmol/L；(3)將步驟(2)制備得到的樣品進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。所述方法通過實現(xiàn)ssDNA或藥物對原生質(zhì)體的識別，進(jìn)而實現(xiàn)對細(xì)菌的檢測；可克服現(xiàn)有核酸分子與微生物發(fā)生相互作用識別檢測微生物的方法中存在的相互作用位點少以及相互作用力弱的缺陷，具有準(zhǔn)確、快速、簡便以及成本低特點。
文檔編號G01N21/33GK102590319SQ20121000942
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月12日
發(fā)明者古力, 孟朝陽, 屈鋒, 梅芳 申請人:北京理工大學(xué)