一種基于硅膠基質(zhì)的原生質(zhì)體固定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種原生質(zhì)體的固定化方法。本發(fā)明所提供的原生質(zhì)體固定化方法，包括如下步驟：（1）將原生質(zhì)體進(jìn)行海藻酸鈣包埋，得到包被有所述原生質(zhì)體的海藻酸鈣珠；（2）利用硅膠基質(zhì)通過硅膠溶膠-凝膠法將步驟（1）所得的海藻酸鈣珠進(jìn)行包埋，得到包埋后的硅膠凝膠；（3）將步驟（2）所得的硅膠凝膠置于可溶性檸檬酸鹽溶液中，溶解所述硅膠凝膠中的海藻酸鈣成分，得到硅膠包埋的原生質(zhì)體。實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明所提供的原生質(zhì)體固定化方法得到的硅膠包被的原生質(zhì)體，具有相對較強(qiáng)的活力。本發(fā)明的方法可用于固定病毒侵染的原生質(zhì)體，從而觀察病毒對植物生長的影響，也可以先將原生質(zhì)體進(jìn)行固定然后再導(dǎo)入病毒，研究病毒的侵染機(jī)理。
【專利說明】一種基于硅膠基質(zhì)的原生質(zhì)體固定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種原生質(zhì)體的固定化方法，特別涉及一種基于硅膠基質(zhì)的原生質(zhì)體固定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]植物原生質(zhì)體是指去除細(xì)胞壁被質(zhì)膜所包圍的、具有生命力的細(xì)胞,其結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)(包括各種細(xì)胞器、細(xì)胞骨架系統(tǒng)及胞基質(zhì))和細(xì)胞核等部分。雖然原生質(zhì)體失去了細(xì)胞壁這一屏障，使其成為植物生理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、體細(xì)胞遺傳學(xué)和植物病毒研究等的理想材料，但由于失去細(xì)胞壁的保護(hù)，原生質(zhì)體在清洗、分離、載體轉(zhuǎn)染等操作中容易破裂，不穩(wěn)定。固定化后，由于載體的保護(hù)作用，穩(wěn)定性提高。固定化原生質(zhì)體去除了細(xì)胞壁的擴(kuò)散障礙，有利于氧的傳遞，營養(yǎng)成分的吸收和胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌。固定化后利于對單個(gè)原生質(zhì)體的定位觀察。
[0003]通常使用的多聚甲醛、戊二醛等醛類固定劑，碳化二亞胺，二甲基乙酰胺等非醛類固定劑，以及丙酮及醇類固定劑，都不能維持細(xì)胞的活性。瓊脂凝膠、角叉菜膠、明膠等天然凝膠包埋條件溫和，不影響固定細(xì)胞的活性，但是強(qiáng)度差。海藻酸鈣凝膠由于其具有強(qiáng)度較好、價(jià)格低廉、無毒易操作等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用，但仍然由于其機(jī)械性不夠，不能很好的起到保護(hù)包埋細(xì)胞的作用。硅膠具有反應(yīng)條件溫和、生物相容性好、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度高、孔徑可控及多樣性的優(yōu)點(diǎn)，是細(xì)胞固定的熱門材料。但是單一使用硅膠，在合成無機(jī)基質(zhì)的過程中，細(xì)胞暴露在非天然的環(huán)境中，甚至包埋細(xì)胞與凝膠的硅醇基結(jié)合，會(huì)使細(xì)胞生物活性降低。同時(shí)也由于空間限制，不利于細(xì)胞分裂，而使用大孔徑支架方法會(huì)導(dǎo)致污染物進(jìn)入。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種原生質(zhì)體固定化方法。
[0005]本發(fā)明所提供的原生質(zhì)體固定化方法，可包括如下步驟:
[0006](I)將原生質(zhì)體進(jìn)行海藻酸鈣包埋，得到包被有所述原生質(zhì)體的海藻酸鈣珠；
[0007](2)利用硅膠基質(zhì)通過硅膠溶膠-凝膠法將步驟(1)所得的海藻酸鈣珠進(jìn)行包埋，得到包埋后的硅膠凝膠；
[0008](3)將步驟(2)所得的硅膠凝膠置于可溶性檸檬酸鹽溶液中，溶解所述硅膠凝膠中的海藻酸鈣成分，得到硅膠包埋的原生質(zhì)體。
[0009]上述方法步驟(2)中所述硅膠基質(zhì)的制備方法為如下(a)或(b):
[0010](a)以硅酸酯為前體的二步水解法:將硅酸酯在鹽酸催化下水解，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去水解產(chǎn)生的醇和部分水后，再和Wl溶液以體積比1:2混合，加入甘油作致孔劑，5102最終濃度為1.3M，使用前加氫氧化鈉或Tris緩沖溶液調(diào)pH至6~7，得到所述硅膠基質(zhì)；
[0011](b)酸化硅酸鈉水溶液法:為了得到介孔(孔徑在2到50納米之間稱為介孔)硅膠，將二氧化硅含量為0.41:2.6的硅酸鈉水溶液和膠體二氧化硅水溶液等體積混合，用鹽酸調(diào)節(jié)混合溶液pH至6~7，得到硅膠基質(zhì)；[0012]所述Wl溶液的溶質(zhì)為甘露醇、2-嗎啉乙磺酸和KC1，溶劑為水，所述甘露醇在所述Wl溶液的終濃度為0.4^0.5M，如0.5M，所述2-嗎啉乙磺酸在所述Wl溶液的終濃度為4mM，所述KCl在所述Wl溶液的終濃度為20mM。所述膠體二氧化硅水溶液是直徑為I~5nm的二氧化硅粒子分散在水中所形成的溶液。
[0013]在本發(fā)明中，所述娃酸酯可為娃酸四甲酯(Tetramethyl orthosilicate)或娃酸四乙酯(Tetraethyl orthosilicate)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述娃酸鈉為商品化的硅酸鈉溶液，其中以SiO2計(jì)的濃度為4.5M ;所述二氧化硅為商品化的膠體二氧化硅LUDOXk' IIS-40，其中SiO2的濃度為6.7M。所述硅酸鈉和所述二氧化硅在使用前均先用二次去離子滅菌水稀釋，稀釋后所得硅酸鈉溶液中SiO2的濃度為0.41M，稀釋后所得膠體二氧化硅(所述膠體二氧化硅中二氧化硅粒子的直徑為I~5nm)溶液中SiO2的濃度為2.6M。
[0014]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，調(diào)節(jié)所述混合溶液的pH值所采用的鹽酸的濃度具體為3.0M，在實(shí)際操作中，也可大于3.0M,以減少酸溶液對所調(diào)節(jié)溶液的稀釋。[0015]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所得硅膠基質(zhì)的孔徑大小為10_50nm。
[0016]所述檸檬酸鹽溶液以Wl溶液為溶劑，所述檸檬酸鹽在所述檸檬酸鹽溶液中的終濃度為1%~2% (1-2.0g/100ml)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述檸檬酸鹽具體為檸檬酸鉀。
[0017]在上述方法中，所述溶解去除所述凝膠珠中的海藻酸鈣成分中，溶解時(shí)間可為45-90分鐘，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，具體為60分鐘。
[0018]在上述方法中，所述溶解所述凝膠珠中的海藻酸鈣成分中，溶解溫度具體為20-25。。。
[0019]在上述方法中，所述原生質(zhì)體均為植物原生質(zhì)體。在本發(fā)明中，具體為煙草原生質(zhì)體。
[0020]在上述方法中，所述將原生質(zhì)體進(jìn)行海藻酸鈣包埋，具體可為將所述原生質(zhì)體加入到海藻酸鈉的Wl溶液中混勻，獲得混合溶液；再采用滴入法，將所得混合溶液滴入CaCl2的Wl溶液中成珠，得到包被有所述原生質(zhì)體的海藻酸鈣珠。
[0021]所述海藻酸鈉的Wl溶液中海藻酸鈉的濃度可為0.3%-2.0%,即(0.3-1.0)g/1OOmL ;所述CaCl2的Wl溶液中CaCl2的濃度可為(0.02-0.1) M。
[0022]本發(fā)明采用改進(jìn)的海藻酸鈉和硅膠混合材料固定原生質(zhì)體，不僅可長時(shí)間保持原生質(zhì)體的活性，而且由于硅膠材料的光學(xué)透明性，硅膠固定的原生質(zhì)體有利于采用熒光顯微鏡等儀器觀察細(xì)胞內(nèi)的生理活動(dòng)。
[0023]本發(fā)明結(jié)合海藻酸鈣和硅膠的優(yōu)點(diǎn)來固定原生質(zhì)體，既保持原生質(zhì)體的活性，又提高固定材料的機(jī)械強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明所提供的原生質(zhì)體固定化方法得到的硅膠包被的原生質(zhì)體，具有相對較強(qiáng)的活力。本發(fā)明的方法可用于固定病毒侵染的原生質(zhì)體，從而觀察病毒對植物生長的影響，也可以先將原生質(zhì)體進(jìn)行固定然后再導(dǎo)入病毒，研究病毒的侵染機(jī)理。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為兩種純化方法的純化效果比較。其中，A1-A4為沉降法純化結(jié)果為界面法純化結(jié)果。Al和BI均為488nm激光激發(fā)，F(xiàn)DA在有活力的原生質(zhì)體中發(fā)出的綠色熒光，A2和B2均為488nm激光激發(fā)，原生質(zhì)體葉綠體的自發(fā)紅色熒光，A3和B3均為明場圖像，A4和B4均為1、2、3圖像重疊的結(jié)果，顯示黃綠色的原生質(zhì)體有活力，只顯示紅色的原生質(zhì)體無活力。
[0025]圖2為原生質(zhì)體的活力檢測圖。其中，A為原生質(zhì)體提取后在不同時(shí)間下的活力圖，黃綠色表示原生質(zhì)體有活力，紅色表示原生質(zhì)體無活力為原生質(zhì)體在提取后在不同時(shí)間下的活力率。[0026]圖3為不同濃度的海藻酸鈉與不同濃度的CaCl2組合形成海藻酸鈣珠的情況。其中，I中CaCl2的濃度為0.025M，海藻酸鈉的濃度為0.3% ；2中CaCl2的濃度為0.05M，海藻酸鈉的濃度為0.3% ；3中CaCl2的濃度為0.1M，海藻酸鈉的濃度為0.3% ；4中CaCl2的濃度為0.025M，海藻酸鈉的濃度為0.5% ；5中CaCl2的濃度為0.05M，海藻酸鈉的濃度為0.5% ；6中CaCl2的濃度為0.1M，海藻酸鈉的濃度為0.5% ；7中CaCl2的濃度為0.025M。海藻酸鈉的濃度為1% ;8中CaCl2的濃度為0.05M，海藻酸鈉的濃度為1.0% ；9中CaCl2的濃度為0.1M，海藻酸鈉的濃度為1.0% ；10中CaCl2的濃度為0.01M，海藻酸鈉的濃度為0.1%。CaCl2的濃度小于0.01M或者海藻酸鈉的濃度小于0.1%，都不能形成海藻酸鈣珠。
[0027]圖4為原生質(zhì)體在海藻酸鈉的Wl溶液中的活力觀測結(jié)果。其中，A1-A4為IOX目鏡下觀察的原生質(zhì)體的活力，B1-B4為20X目鏡下觀察的原生質(zhì)體的活力。Al和BI均為488nm激光激發(fā)，F(xiàn)DA在有活力的原生質(zhì)體中發(fā)出的綠色熒光，A2和B2均為488nm激光激發(fā)，原生質(zhì)體葉綠體的自發(fā)紅色熒光，A3和B3均為明場圖像，A4和B4均為1、2、3場圖像重疊，顯示黃綠色的原生質(zhì)體有活力，只顯示紅色的原生質(zhì)體無活力。
[0028]圖5為先用海藻酸鈣固定，再包覆于硅膠中的原生質(zhì)體活力檢測結(jié)果。其中，A1-A4為IOX目鏡下觀察的原生質(zhì)體的活力；B1-B4為20X目鏡下觀察的原生質(zhì)體的活力。Al和BI為488nm激光激發(fā)，F(xiàn)DA在有活力的原生質(zhì)體中發(fā)出的綠色熒光，A2和B2為488nm激光激發(fā)，原生質(zhì)體葉綠體的自發(fā)紅色熒光，A3和B3為明場圖像，A4和B4均為1、2場圖像重疊，顯示黃綠色的原生質(zhì)體有活力，只顯示紅色的原生質(zhì)體無活力。
[0029]圖6為單獨(dú)用海藻酸鈣或單獨(dú)用硅膠包埋原生質(zhì)體的活力檢測結(jié)果。其中，A1-A4為單獨(dú)用海藻酸鈣包埋原生質(zhì)體的活力檢測結(jié)果為單獨(dú)用硅膠包埋原生質(zhì)體的活力檢測結(jié)果。Al和BI為488nm激光激發(fā)，F(xiàn)DA在有活力的原生質(zhì)體中發(fā)出的綠色熒光，A2和B2為488nm激光激發(fā)，原生質(zhì)體葉綠體的自發(fā)紅色熒光，A3和B3為明場圖像，A4和B4為1、2、3場圖像重疊，顯示黃綠色的原生質(zhì)體有活力，只顯示紅色的原生質(zhì)體無活力。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0031]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0032]MES (2-嗎啉乙磺酸)母液:即0.2M MES溶液，取3.904g MES干粉(Sigma，M2933-25G)用滅菌超純水配成IOOmL0.2MMES母液，用1.0M的HCl或1.0M Tris溶液調(diào)pH為 5.7。
[0033]實(shí)施例1、原生質(zhì)體的固定化
[0034]一、原生質(zhì)體的提取
[0035]1、酶液的配制
[0036]稱取0.15g纖維素酶R-10，0.075g離心酶R-10，1.3664g甘露醇，量取375 μ L濃度為0.2M的MES母液(pH5.7)，溶于滅菌超純水中，并稀釋到15mL，在55°C水浴10分鐘，經(jīng)0.45 μ m混合纖維素微孔濾膜過濾除菌，得到棕色透明的酶液，置于IOOmL三角燒瓶中，室溫備用。所述酶液中含1.0% (l.0g/lOOmL)纖維素酶R-10，0.5%(m/v) (0.5g/100mL)離心酶 R-1O，0.5M 甘露醇，5mM MES。
[0037]2、Wl溶液配制
[0038]稱取18.217g甘露醇，量取4mL濃度為0.2M的MES母液(pH5.7)，20mL濃度為0.2M的KCl溶液，溶于滅菌二次水中，并用滅菌二次水稀釋到200mL，得到含0.5M甘露醇、4mMMES 和 20mM KCl 的 Wl 溶液。
[0039]3、葉片處理
[0040] 供試材料為煙草(Nicotiana tabacum.)品種白肋煙(可從種子公司獲得)的溫室苗，取生長40-60天的煙草植株，從上中部摘取充分展開的葉片(盡量選取肉質(zhì)較厚且生長狀態(tài)相似的葉片)。用肥皂水洗滌后，用流水沖洗干凈，濾紙吸干水分。去掉葉片較大的葉脈，并取葉片中部切絲，寬度約為0.5-1.0mm (切葉片使用的刀片不能重復(fù)使用)。
[0041]4、酶解
[0042]15mL酶液約對應(yīng)1.0-1.5g葉片，將經(jīng)步驟3處理后得到的葉片置于步驟I配制所得的酶液中，于26°C暗條件下酶解約3-3.5h。
[0043]5、純化
[0044]有兩種方法用于原生質(zhì)體純化:
[0045](I)界面法:酶解結(jié)束后，將原生質(zhì)體連同酶液經(jīng)不銹鋼篩網(wǎng)過濾，濾液經(jīng)79g離心4分鐘,棄上清,加入5mL步驟2配制的Wl溶液懸浮，79g離心4分鐘,棄上清,加入3mLWl溶液懸浮原生質(zhì)體沉淀，并用5mL移液槍向離心管底部緩緩注入23% (23g/100mL)蔗糖溶液5mL，79g離心4分鐘，用200 μ L移液槍取位于Wl溶液和蔗糖溶液間的純化的原生質(zhì)體(注意不要吸到下層蔗糖溶液)，加入5mL Wl溶液懸浮，79g離心4分鐘，棄上清，得到純化后的原生質(zhì)體沉淀。
[0046](2)沉降法:酶解結(jié)束后，將原生質(zhì)體連同酶液經(jīng)不銹鋼篩網(wǎng)過濾，濾液經(jīng)79g離心4分鐘，棄上清，加入5mL步驟2配制的Wl溶液懸浮，79g離心4分鐘，棄上清，Wl溶液懸浮離心重復(fù)2次，得到純化后的原生質(zhì)體沉淀。
[0047]兩種方法得到的原生質(zhì)體均用2mL步驟2配制的Wl溶液懸浮，得到原生質(zhì)體懸浮液。將FDA儲(chǔ)備液(取0.1g FDA溶于20mL丙酮中，配成0.5% (w/v) FDA儲(chǔ)備液，4°C儲(chǔ)存)用Wl溶液稀釋成0.01% (0.01g/100mL)的濃度，加入盛有原生質(zhì)體懸浮液的培養(yǎng)皿中，放置40分鐘后，于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察純化效果，在488nm激光激發(fā)下，既發(fā)綠色熒光又發(fā)紅色熒光的表明原生質(zhì)體有活性，只發(fā)紅色熒光的表明無活性。
[0048]結(jié)果如圖1所示，由圖可知，與界面法純化得到的原生質(zhì)體相比，沉降法得到的原生質(zhì)體雜質(zhì)較多，活力較低，使用界面法純化原生質(zhì)體的效果較好。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用界面法純化原生質(zhì)體。
[0049]6、活力測定
[0050]用雙乙酰突光素(Fluorescein diacetate,FDA)突光檢測法檢測步驟5純化所得原生質(zhì)體的活力。取步驟5界面法純化后得到的原生質(zhì)體懸浮液0.1mL,加入2 μ LFDA儲(chǔ)備液(取0.1g FDA溶于20mL丙酮中，配成0.5% (w/v)FDA儲(chǔ)備液，4°C儲(chǔ)存)，使FDA的最終工作濃度為0.01% (0.01g/100mL),混勻。室溫放置5分鐘后，用熒光顯微鏡觀察。FDA在有活力的原生質(zhì)體中，被酶作用分解成熒光素，被488nm激光激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光，同時(shí)葉綠體自身發(fā)紅色熒光，兩種熒光圖像重疊顯示黃綠色，表明原生質(zhì)體有活力；只發(fā)紅色熒光的原生質(zhì)體無活力。20X目鏡下，取10個(gè)不同的視野計(jì)算活力平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取
平均值。
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種原生質(zhì)體固定化方法，包括如下步驟: (1)將原生質(zhì)體進(jìn)行海藻酸鈣包埋，得到包被有所述原生質(zhì)體的海藻酸鈣珠； (2)利用硅膠基質(zhì)通過硅膠溶膠-凝膠法將步驟(1)所得的海藻酸鈣珠進(jìn)行包埋，得到包埋后的硅膠凝膠； (3)將步驟(2)所得的硅膠凝膠置于可溶性檸檬酸鹽溶液中，溶解所述硅膠凝膠中的海藻酸鈣成分，得到硅膠包埋的原生質(zhì)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述硅膠基質(zhì)的制備方法為如下(a)或 (b): Ca)以硅酸酯為前體的二步水解法:將硅酸酯在鹽酸催化下水解，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去水解產(chǎn)生的醇和部分水后，再和Wl溶液以體積比1:2混合，加入甘油作致孔劑，使用前調(diào)pH至6~7，得到所述硅膠基質(zhì)； (b)酸化硅酸鈉水溶液法:將二氧化硅含量為0.41:2.6的硅酸鈉水溶液和膠體二氧化硅水溶液等體積混合，用鹽酸調(diào)節(jié)混合溶液pH至6~7，得到硅膠基質(zhì)； 所述Wl溶液的溶質(zhì)為甘露醇、2-嗎啉乙磺酸和KC1，溶劑為水，所述甘露醇在所述Wl溶液中的終濃度為0.4~0.5M，所述2-嗎啉乙磺酸在所述Wl溶液中的終濃度為4mM，所述KCl在所述Wl溶液中的終濃度為20mM ;所述膠體二氧化硅水溶液是直徑為I~5nm的二氧化硅粒子分散在水中所形成的溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述方法中，調(diào)節(jié)所述混合溶液pH值采用的鹽酸濃度為3.0M。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述可溶性檸檬酸鹽溶液為所述可溶性檸檬酸鹽的Wl溶液，其溶質(zhì)為所述可溶性檸檬酸鹽，溶劑為所述Wl溶液，所述可溶性檸檬酸鹽在所述可溶性檸檬酸鹽溶液中的終濃度為1-2.0g/100ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述溶解所述硅膠凝膠中的海藻酸鈣成分的溶解時(shí)間為45-90分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述溶解所述硅膠凝膠中的海藻酸鈣成分的溶解溫度為20-25°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于:所述原生質(zhì)體為植物原生質(zhì)體。
【文檔編號】C12N11/10GK103540583SQ201210246018
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月16日
【發(fā)明者】雷榮, 喬文婕, 蔣弘山, 王新一, 朱水芳 申請人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院