本發(fā)明涉及制備干細胞樣腫瘤細胞、其抗原組合物、負載該抗原樹突狀細胞的方法、使用所述方法的試劑盒、以及通過所述方法獲得的樹突細胞和疫苗特別地，本發(fā)明涉及制備干細胞樣肺癌細胞及其抗原組合物負載該抗原樹突狀細胞的方法、使用所述方法的試劑盒、以及通過所述方法獲得的樹突細胞疫苗。

背景技術：
目前，現(xiàn)有技術已經(jīng)在肺癌瘤中鑒定并分離到了具有干細胞/祖細胞特性的致瘤肺癌細胞。例如，“Sidepopulationinhumanlungcancercelllinesandtumorsisenrichedwithstem-likecancercells(人肺癌細胞系和腫瘤中亞群中富含干細胞樣腫瘤細胞)”，MariaM.Ho等人，CancerResearch(癌癥研究)，第67卷第10期，第4827-4833頁，2007年5月15日中公開了，其發(fā)現(xiàn)乳腺癌耐藥蛋白ATP結合轉運蛋白G超家族成員2(ABCG2)的細胞，專門保持致癌的活性并且顯示出了干細胞樣特性。即現(xiàn)有技術可以通過檢測癌瘤處分離的疑似干細胞樣肺癌細胞的ABCG2或Prominin1，來鑒定干細胞樣肺癌細胞。但是在正常細胞中也有同樣的ABCG2和Prominin1的性質，因此現(xiàn)有技術的方法無法將癌瘤處分離的干細胞樣肺癌細胞和正常細胞高效準確的區(qū)分開，因而無法迅速有效地富集并體外繁殖干細胞樣肺癌細胞。例如，在干細胞樣肺癌細胞中特異性表達的蛋白激酶Ciota，在肺癌細胞中沒有表達，但是在正常的肺泡巨噬細胞中也有表達。綜上如何高效準確地得到干細胞樣肺癌細胞，并且能否利用所得的干細胞樣肺癌細胞來制備對抗供體中肺癌的疫苗，仍然是亟待解決的問題。

技術實現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術很難在短時間內高效準確得到純度高且富集容易的干細胞樣肺癌細胞的問題，本發(fā)明的目的是提供一種制備干細胞樣肺癌細胞的方法，該方法可以在短時間內高效準確得到純度高且富集容易的干細胞樣肺癌細胞。本發(fā)明提供一種干細胞樣肺癌細胞抗原組合物及其負載該抗原樹突狀細胞的方法，以及提供使用本發(fā)明所述方法的試劑盒，通過本發(fā)明所述方法獲得的樹突細胞疫苗。本發(fā)明提供了一種制備干細胞樣肺癌細胞的方法，其中，所述方法包括鑒定待測肺癌細胞標本中是否存在干細胞樣肺癌細胞的步驟：所述步驟包括檢測所述待測肺癌細胞標本中是否特異表達以下差異蛋白的至少兩種：蛋白激酶Ciota、五次跨膜單鏈糖蛋白Prominin1、乙醛脫氫酶1或乳腺癌耐藥蛋白ATP結合轉運蛋白G超家族成員2。本發(fā)明還提供了一種上述干細胞樣肺癌細胞抗原組合物的制備方法，其中，該方法包括以下步驟：1)按照本發(fā)明所述的方法制備干細胞樣肺癌細胞，2)用生理鹽水洗滌并重懸所述干細胞樣肺癌細胞，3)裂解所述干細胞樣肺癌細胞。本發(fā)明還提供了一種干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞的制備方法，其中，該方法包括：通過裂解干細胞樣肺癌細胞得到干細胞樣肺癌細胞抗原組合物，將正常樹突狀細胞與干細胞樣肺癌細胞抗原組合物接觸得到負載腫瘤抗原的抗肺癌樹突狀細胞，其中，所述方法包括使用本發(fā)明所述的方法制備干細胞樣肺癌細胞，或者使用本發(fā)明的方法制備干細胞樣肺癌細胞抗原組合物。本發(fā)明還提供了一種樹突狀細胞疫苗，所述樹突狀細胞疫苗包括樹突狀細胞，其中，所述樹突狀細胞為本發(fā)明所述的干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞。本發(fā)明還提供了一種制備干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞疫苗的試劑盒，其中，所述試劑盒包括：1)干細胞樣肺癌細胞基礎培養(yǎng)基；2)蛋白激酶Ciota、五次跨膜單鏈糖蛋白Prominin1、乙醛脫氫酶1或乳腺癌耐藥蛋白ATP結合轉運蛋白G超家族成員2的至少兩種；3)消化細胞的酶；4)B27或N2、表皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和胰島素；5)樹突狀細胞基礎培養(yǎng)基；6)巨粒細胞-噬細胞集落刺激因子；7)白介素-4、干擾素α和腫瘤壞死因子α；以及6)使用說明書；其中，所述使用說明書包括本發(fā)明所述制備干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞的方法。通過本發(fā)明的方法，僅僅通過檢測蛋白激酶Ciota、五次跨膜單鏈糖蛋白Prominin1、乙醛脫氫酶1或乳腺癌耐藥蛋白ATP結合轉運蛋白G超家族成員2的至少兩種，就能夠高效準確地得到干細胞樣肺癌細胞，基于所述方法所得干細胞樣肺癌細胞純度高且富集容易。由本發(fā)明提供的方法得到的干細胞樣肺癌細胞以及由該干細胞樣肺癌細胞得到的抗原組合物、負載該抗原的樹突狀細胞制備的藥物，能夠在體內和體外引發(fā)免疫應答來殺死引起肺癌復發(fā)的干細胞樣肺癌細胞，從而為克服肺癌耐受性、根治肺癌的復發(fā)和轉移提供了可能。附圖說明圖1表示由實施例1或/和2制備PKCiota、PROM1、ALDH1和ABCG2四陽性的干細胞樣肺癌細胞抗原組合物負載樹突狀細胞表型圖。圖2表示由實施例1或/和2所得表特異達兩種差異蛋白以上的干細胞樣肺癌細胞抗原組合物負載樹突狀細胞產(chǎn)生的對PKCiota和PROM1雙陽性干細胞樣肺癌細胞的應答結果圖。圖3表示由實施例1或/和2所得PKCiota和PROM1雙陽性的干細胞樣肺癌細胞抗原組合物負載樹突狀細胞與由制備例1、4和對比例1所得三種抗原組合物分別負載樹突狀細胞，引發(fā)對PKCiota和PROM1雙陽性干細胞樣肺癌細胞產(chǎn)生的應答結果對比圖。圖4表示由實施例1或/和2所得PKCiota和PROM1雙陽性的干細胞樣肺癌細胞抗原組合物負載樹突狀細胞，以及由制備例1、4和對比例1所得三種抗原組合物分別負載樹突狀細胞引發(fā)對對比例1獲得的干細胞樣肺癌細胞產(chǎn)生的應答結果對比圖。具體實施方式本發(fā)明提供了一種制備干細胞樣肺癌細胞的方法，其中，所述方法包括鑒定待測肺癌細胞標本中是否存在干細胞樣肺癌細胞的步驟：所述步驟包括檢測所述待測肺癌細胞標本中是否特異表達以下差異蛋白的至少兩種：蛋白激酶Ciota(ProteinkinaseCiota，PKCiota)、五次跨膜單鏈糖蛋白Prominin1(PROM1)、乙醛脫氫酶1(aldehydedehydrogenase1，ALDH1)或ABCG2。其中，蛋白激酶Ciota是是肺癌干細胞增殖的必需基因，在對放化療產(chǎn)生抵抗、轉化生長和侵潤方面扮演的中心作用。優(yōu)選地，所述特異表達差異蛋白是指使用蛋白免疫印跡技術檢測所述肺癌細胞標本中的所述四種差異蛋白至少兩種(含蛋白激酶Ciota在內)的結果為陽性；其中，以已知純肺癌細胞為陰性對照，用蛋白免疫印跡技術檢測100份所述陰性對照，每份含5×106個細胞，測得每種差異蛋白的灰度與標準內參β肌動蛋白的灰度比值，將所測該種差異蛋白灰度比值的平均值與標準方差之和定義為分界值；取100份待測肺癌細胞標本，每份標本含5×106個細胞，測得與陰性對照所測同種差異蛋白灰度比值的平均值，該灰度比值的平均值大于等于所述分界值，即該待測肺癌細胞標本的該種差異蛋白的蛋白免疫印跡技術檢測結果為陽性。進一步優(yōu)選地，所述特異表達差異蛋白是指使用蛋白免疫印跡技術檢測所述肺癌細胞標本中的所述四種差異蛋白的結果均為陽性。優(yōu)選地，當鑒定所述待測肺癌細胞標本中存在干細胞樣肺癌細胞時，該方法還包括：使用免疫磁珠法和/或流式細胞儀分選法富集所述待測細胞中的干細胞樣肺癌細胞的步驟；其中，利用針對得到蛋白激酶Ciota(ProteinkinaseCiota，PKCiota)、五次跨膜單鏈糖蛋白Prominin1(PROM1)、乙醛脫氫酶1(aldehydedehydrogenase1，ALDH1)或ABCG2的至少兩種的抗體。所述方法還可以包括從離體肺癌腫瘤組織和/或肺癌細胞系中分離干細胞樣肺癌細胞。手術從患者體內取出的肺癌腫瘤組織，屬于廢棄的離體肺癌腫瘤組織。本發(fā)明可以適用常規(guī)的方法得到肺癌細胞。此外，由現(xiàn)有商業(yè)上能夠買到的細胞系培養(yǎng)物也能從中分離出相應的干細胞樣肺癌細胞。例如，A549人非小細胞肺癌細胞就是可以從美國典型物保藏中心(ATCC)買到、并且能夠從中分離出相應的干細胞樣肺癌細胞的細胞株系。本發(fā)明還提供了一種上述干細胞樣肺癌細胞抗原組合物的制備方法，其中，該方法包括以下步驟：1)按照本發(fā)明所述的方法制備干細胞樣肺癌細胞，2)用生理鹽水洗滌并重懸所述干細胞樣肺癌細胞，3)裂解所述干細胞樣肺癌細胞。其中，所述生理鹽水的洗滌次數(shù)可以通過測定洗出液中殘留的培養(yǎng)基組分來決定。將本發(fā)明的方法制得的干細胞樣肺癌細胞抗原組合物在注射給患者時殘留的培養(yǎng)基組分以及可能殘留的化療藥物不會引起患者不適即可。裂解本發(fā)明的干細胞樣肺癌細胞可以使用本領域常規(guī)的各種裂解方法實現(xiàn)。出于不在裂解干細胞樣肺癌細胞后增加新的物質的考慮，優(yōu)選所述裂解干細胞樣肺癌細胞的步驟包括熱休克和/或反復凍融；所述熱休克裂解的條件包括在37～45℃下保持1h-6h，優(yōu)選包括在38～43℃下保持2h-4h；所述反復凍融的次數(shù)為3-5次，每兩次的間隔時間是10min-2h，優(yōu)選為30min-1h，所述冷凍的溫度范圍是零下120℃-零下196℃(可以使用液氮、干冰等來實現(xiàn))，優(yōu)選零下150℃-零下196℃，所述融化的溫度范圍是10℃-37℃，優(yōu)選為20℃-37℃。由于經(jīng)熱休克后，本發(fā)明的干細胞樣肺癌細胞會產(chǎn)生熱休克蛋白，裂解后仍然存在所述熱休克蛋白。熱休克蛋白的存在有助于負載后的樹突狀細胞免疫應答。因此，更優(yōu)選所述裂解干細胞樣肺癌細胞的步驟包括熱休克和反復凍融；所述熱休克裂解的條件包括在37-45℃下保持1h-6h；所述反復凍融的次數(shù)為3-5次兩次的間隔時間是10min-2h，所述冷凍的溫度范圍是零下120℃-零下196℃，所述融化的溫度范圍是20℃-37℃。裂解完成后，通常通過離心和過濾的步驟除去裂解液中過大的細胞碎片，例如，通過600rpm離心1min除去，然后上清用0.45μm濾膜過濾。所述組合物的基本成分包括生理鹽水。裂解得到的本發(fā)明的抗原組合物可以在-80℃中保存。優(yōu)選地，所述步驟1)中制備所得的干細胞樣肺癌細胞的濃度為1×105到1×108細胞/mL。其中，所述干細胞樣肺癌細胞基礎培養(yǎng)基可以是本領域任何能夠用于培養(yǎng)干細胞樣肺癌細胞的培養(yǎng)基，例如DMEM/F12等。所述干細胞樣肺癌細胞培養(yǎng)體系包括干細胞樣肺癌細胞和3mL-50mL的干細胞樣肺癌細胞基礎培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所述消化細胞的酶可以為本領域常規(guī)的消化細胞的酶，優(yōu)選為胰酶和/或阿尤替斯酶。其中，在干細胞樣肺癌細胞基礎培養(yǎng)基達3mL-50mL的時，所述胰酶和/或阿尤替斯酶(Accutase)優(yōu)選作為腫瘤組織分離干細胞樣肺癌細胞所使用試劑，可以使用本領域常規(guī)的用量，例如一般用量為1倍濃度的0.5mL-10mL來消化細胞，即基礎培養(yǎng)基體積的1/6到1/5。所述細胞因子為B27或N2、表皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和胰島素。其中，所述B27在培養(yǎng)干細胞樣肺癌細胞時，向干細胞樣肺癌細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為2ng/mL-50ng/mL。所述N2在培養(yǎng)干細胞樣肺癌細胞時，向干細胞樣肺癌細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為2ng/mL-50ng/mL。其中所述B27和N2是商業(yè)上可供的細胞培養(yǎng)添加劑(即細胞因子)，例如，美國biotech公司、美國Gibco公司生產(chǎn)的B27和N2。所述表皮細胞生長因子在培養(yǎng)干細胞樣肺癌細胞時，向干細胞樣肺癌細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為5ng/mL-100ng/mL。所述堿性成纖維細胞生長因子在培養(yǎng)干細胞樣肺癌細胞時，向干細胞樣肺癌細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為5ng/mL-100ng/mL。所述胰島素在培養(yǎng)干細胞樣肺癌細胞時，向干細胞樣肺癌細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為1mg/mL-50mg/mL。所述試劑盒還可以包括非必要的動物血清。所述動物血清可以是人血清和/或牛血清。所述血清可以作為消化酶的終止劑，其用量為現(xiàn)有技術中作為消化酶終止劑的常規(guī)用量，例如，與消化細胞的酶液相當0.1mL-10mL，即動物血清與消化細胞的酶液的體積比為1∶1至1∶5。本發(fā)明還提供了一種干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞的制備方法，其中，該方法包括：通過裂解干細胞樣肺癌細胞得到干細胞樣肺癌細胞抗原組合物，將正常樹突狀細胞與干細胞樣肺癌細胞抗原組合物接觸得到負載腫瘤抗原的抗肺癌樹突狀細胞，其中，所述方法包括使用本發(fā)明所述的方法制備干細胞樣肺癌細胞，或者使用本發(fā)明的方法制備干細胞樣肺癌細胞抗原組合物。優(yōu)選所述正常樹突狀細胞與制備干細胞樣肺癌細胞抗原組合物的干細胞樣肺癌細胞來自同一個體。這樣可以最大限度地避免由于免疫排斥反應而引起的副作用。當然，如果所述正常樹突狀細胞與制備干細胞樣肺癌細胞抗原組合物的干細胞樣肺癌細胞并非來自同一個體，仍然可以使用本領域常用的抗免疫排斥反應的藥物來減小副作用。所述抗免疫排斥反應的藥物例如地塞米松等。本發(fā)明還提供了一種樹突狀細胞疫苗，所述樹突狀細胞疫苗包括樹突狀細胞，可來源于外周血、骨髓和臍帶血等，其中，所述樹突狀細胞為本發(fā)明所述的干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞。在制備樹突狀細胞疫苗之前，用生理鹽水洗滌并重懸所述干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞。所述生理鹽水的洗滌次數(shù)可以通過測定洗出液中殘留的培養(yǎng)基組分來決定。將本發(fā)明的樹突狀細胞疫苗在注射給患者時殘留的培養(yǎng)基組分以及可能殘留的化療藥物不會引起患者不適即可。所述疫苗優(yōu)選包括1×105到5×107個/mL本發(fā)明的干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞；更優(yōu)選為5×105到1×107個/mL。所述疫苗還包括人血白蛋白；其中，以所述疫苗為基準，所述人血白蛋白的含量優(yōu)選為1-5重量體積％，更優(yōu)選為2-3重量體積％。本發(fā)明還提供了一種制備干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞疫苗的試劑盒，其中，所述試劑盒包括：1)干細胞樣肺癌細胞基礎培養(yǎng)基；2)蛋白激酶Ciota(ProteinkinaseCiota，PKCiota)、五次跨膜單鏈糖蛋白Prominin1(PROM1)、乙醛脫氫酶1(aldehydedehydrogenase1，ALDH1)或ABCG2的至少兩種；優(yōu)選包括所述四種蛋白。3)消化細胞的酶；4)B27或N2、表皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和胰島素；5)樹突狀細胞基礎培養(yǎng)基；6)巨粒細胞-噬細胞集落刺激因子；7)白介素-4、干擾素α和腫瘤壞死因子α；以及6)使用說明書；其中，所述使用說明書包括本發(fā)明所述的干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞的制備方法。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括針對所述蛋白激酶Ciota(ProteinkinaseCiota，PKCiota)、五次跨膜單鏈糖蛋白Prominin1(PROM1)、乙醛脫氫酶1(aldehydedehydrogenase1，ALDH1)或ABCG2的至少兩種的抗體。利用所述抗體，使用免疫磁珠法和/或流式細胞儀可以分選法富集所述待測細胞中的干細胞樣肺癌細胞。其中，所述干細胞樣肺癌細胞基礎培養(yǎng)基可以是本領域任何能夠用于培養(yǎng)干細胞樣肺癌細胞的培養(yǎng)基，例如DMEM/F12等。所述干細胞樣肺癌細胞培養(yǎng)體系包括干細胞樣肺癌細胞和3mL-50mL的干細胞樣肺癌細胞基礎培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所述消化細胞的酶可以為本領域常規(guī)的消化細胞的酶，優(yōu)選為胰酶和/或阿尤替斯酶。其中，在干細胞樣肺癌細胞基礎培養(yǎng)基達3mL-50mL的時，所述胰酶和/或阿尤替斯酶(Accutase)優(yōu)選作為腫瘤組織分離干細胞樣肺癌細胞所使用試劑，可以使用本領域常規(guī)的用量，例如一般用量為1倍濃度的0.5mL-10mL來消化細胞，即基礎培養(yǎng)基體積的1/6到1/5。其中，所述B27在培養(yǎng)干細胞樣肺癌細胞時，向干細胞樣肺癌細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為2ng/mL-50ng/mL。所述N2在培養(yǎng)干細胞樣肺癌細胞時，向干細胞樣肺癌細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為2ng/mL-50ng/mL。所述表皮細胞生長因子在培養(yǎng)干細胞樣肺癌細胞時，向干細胞樣肺癌細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為5ng/mL-100ng/mL。所述堿性成纖維細胞生長因子在培養(yǎng)干細胞樣肺癌細胞時，向干細胞樣肺癌細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為5ng/mL-100ng/mL。所述胰島素在培養(yǎng)干細胞樣肺癌細胞時，向干細胞樣肺癌細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為1mg/mL-50mg/mL。所述試劑盒還可以包括非必要的動物血清。所述動物血清可以是人血清和/或牛血清。所述血清可以作為消化酶的終止劑，其用量為現(xiàn)有技術中作為消化酶終止劑的常規(guī)用量，例如，與消化細胞的酶液相當0.1mL-10mL。由本發(fā)明制備干細胞樣肺癌細胞抗原組合物的方法所得到的干細胞樣肺癌細胞抗原組合物來自細胞濃度優(yōu)選為1×105到1×108細胞/mL，更優(yōu)選為1×106到5×107細胞/mL的由本發(fā)明制備干細胞樣肺癌細胞的方法所得到的干細胞樣肺癌細胞。所述細胞濃度過大造成浪費，反之細胞濃度過小，則不足以使樹突狀細胞負載上足夠的抗原。所述樹突狀細胞基礎培養(yǎng)基可以是本領域任何能夠用于培養(yǎng)樹突狀細胞的培養(yǎng)基，例如RPMI/1640等。所述樹突狀細胞培養(yǎng)體系包括干細胞樣肺癌細胞和1mL-100mL、優(yōu)選30-80mL的樹突狀細胞基礎培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中，所述巨粒細胞-噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)在干細胞樣肺癌細胞抗原負載樹突狀細胞時添加到樹突狀細胞基礎培養(yǎng)基中，終濃度100IU/mL-2500IU/mL。所述白介素-4在干細胞樣肺癌細胞抗原負載樹突狀細胞時添加到樹突狀細胞基礎培養(yǎng)基中，終濃度100IU/mL-1500IU/mL。所述干擾素α在干細胞樣肺癌細胞抗原負載樹突狀細胞時添加到樹突狀細胞基礎培養(yǎng)基中，終濃度100IU/mL-2000IU/mL。所述腫瘤壞死因子α在干細胞樣肺癌細胞抗原負載樹突狀細胞時添加到樹突狀細胞基礎培養(yǎng)基中，終濃度0.5ng/mL-100ng/mL。本發(fā)明還提供了一種治療癌癥的方法，其包括給患者施用選自由本發(fā)明方法制備的干細胞樣肺癌細胞抗原組合物、本發(fā)明的樹突狀細胞疫苗所組成的組中的藥物。優(yōu)選所述施用的方式為注射。具體地，施用干細胞樣肺癌細胞抗原組合物的方式選自由腫瘤組織內注射、靜脈注射、皮下注射和皮內注射中的一種或幾種；施用所述樹突狀細胞疫苗的方式為在淋巴結部位皮下或皮內注射。優(yōu)選施用所述樹突狀細胞疫苗的方式為在腹部溝或腋下進行皮下或皮內注射。所述干細胞樣肺癌細胞抗原組合物優(yōu)選來自細胞濃度為1×105到1×108細胞/mL的本發(fā)明的干細胞樣肺癌細胞，其有效量為0.1mL-5mL/個體；所述樹突狀細胞疫苗優(yōu)選包括1×105到5×107個/mL本發(fā)明的抗癌樹突狀細胞，其有效量為0.1mL-2mL/個體。更優(yōu)選所述干細胞樣肺癌細胞抗原組合物優(yōu)選來自細胞濃度為1×105到1×108細胞/mL的本發(fā)明的干細胞樣肺癌細胞，其有效量為0.2mL-2mL/個體；所述樹突狀細胞疫苗優(yōu)選包括1×105到5×107個/mL本發(fā)明的抗癌樹突狀細胞，其有效量為0.5mL-2mL/個體。以上所述干細胞樣肺癌細胞抗原組合物和所述樹突狀細胞疫苗都是一次注射的劑量，一個療程四次注射，間隔一周。干細胞樣肺癌細胞抗原組合物和所述樹突狀細胞疫苗一般在注射完第一針后的第三天到第七天起效。所述有效的標準是：起免疫促進的細胞因子如白介素2、白介素12、干擾素γ和腫瘤壞死因子α等的升高；起免疫抑制的細胞因子如白介素6、白介素10、轉化生長因子β和表皮細胞生長因子等的降低；以及T淋巴細胞亞群變化，即：CD3、CD4和CD8的陽性率的升高或改善，CD16/56陽性率的升高，以及CD4CD25FoxP3三陽性率的降低。一個療程結束后，可以間隔三個月后繼續(xù)給藥，可以治療兩個或四個療程；如有必要，間隔時間為六個月或1年還可繼續(xù)再治療，只要患者一直存活在。其中，所述有效標準還可以分為以下三個等級：1.患者血液細胞因子檢測：起免疫促進的細胞因子如白介素2、白介素12、干擾素γ和腫瘤壞死因子α等的升高；起免疫抑制的細胞因子如白介素6、白介素10、轉化生長因子β和表皮細胞生長因子等的降低；以及T淋巴細胞亞群變化，即：CD3、CD4和CD8的陽性率的升高或改善，CD16/56陽性率的升高，以及CD4CD25FoxP3三陽性率的降低等。2.患者肺癌瘤標志物檢測，如甲胎蛋白、癌胚抗原、糖蛋白等肺癌特異抗原的表達的降低，主要是通過酶免和化學發(fā)光檢測等。3、影像學檢測，如CT、核磁共振和B超檢測，能檢測到治療前后肺癌瘤細胞縮小。優(yōu)選所述干細胞樣肺癌細胞和/或所述樹突狀細胞來自于同一患者，這樣可以最大限度地避免免疫排斥反應造成的副作用。本發(fā)明提及的手術從患者體內取出的肺癌瘤組織，屬于廢棄的離體肺癌瘤組織，并非為實現(xiàn)本發(fā)明而特意從患者體內取出的肺癌瘤組織。此外，本發(fā)明提及的細胞可以是商業(yè)上可供的細胞系。并且現(xiàn)有長期冷凍保藏細胞的技術已經(jīng)非常成熟，比如在液氮(零下196℃)下凍存細胞，例如臍帶血細胞保藏。本領域技術人員完全可以利用上述技術保藏本發(fā)明涉及的肺癌瘤組織、腫瘤細胞系和樹突狀細胞，樹突狀細胞可以來源外周血、骨髓和臍帶血等。以下，對本發(fā)明的具體實施例進行說明，但本發(fā)明的技術范圍不限于這些示例。制備例1人肺癌細胞的差異蛋白表達檢測將購自美國ATCC公司的人肺癌細胞(A549)，在10mLRPMI1640培養(yǎng)基(含體積比10％胎牛血清和1×青霉素與鏈霉素混合液，北京索萊寶公司)中，75cm2培養(yǎng)瓶中，放置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞生長達到培養(yǎng)瓶底面的90％匯合時，用2mL胰酶(北京索萊寶公司)消化后，苔盼蘭計數(shù)，用新鮮RPMI1640培養(yǎng)基(含體積比10％胎牛血清和1×青霉素與鏈霉素混合液)進行傳代培養(yǎng)。取100份50μL(5×106個)上述細胞懸液加入500μL預冷即用型總蛋白提取裂解液(RIPA，北京百泰克公司)(含體積比1％蛋白酶抑制劑，瑞士Roche公司)，冰上孵育20分鐘后，每分鐘13000轉，4℃離心20分鐘。取上清，分裝-80℃保存?zhèn)溆?。按照二喹啉甲?BCA)蛋白定量試劑盒(武漢博士德公司)使用說明操作，測定蛋白濃度。以RIPA調整蛋白濃度，樣品終濃度為1.0μg/μL，加入5×蛋白樣品緩沖液，95℃下5分鐘。根據(jù)目的蛋白的分子量，配制10％分離膠，濃縮膠濃度為5％。待檢測蛋白樣品上樣量：20μg/孔。電泳條件：濃縮膠恒壓90V，約20分鐘；分離膠恒壓120V，通過標準分子量預染蛋白來確定電泳停止時間。濕轉法，轉膜條件：300mA恒流；0.45μm孔徑PVDF膜，轉膜時間80分鐘。轉膜完成后麗春紅染色試劑對膜進行染色，觀察轉膜效果。封閉：將膜完全浸沒于5％(mg/mL)牛血清白蛋白(BSA)的轉膜緩沖液(含體積比3％吐溫-20，TBST)中，室溫下水平搖床孵育1小時。一抗孵育：5％(mg/mL)BSA-TBST稀釋一抗(如下表所示，均購自美國Santa公司；β肌動蛋白，Betaactin為內參對照)，4℃水平搖床孵育過夜。膜編號一抗名稱來源稀釋比例稀釋后體積1PKCiotaRabbit1∶2004mL2PROM1Mouse1∶2004mL3ALDH1Rabbit1∶2004mL4ABCG2Mouse1∶2004mL5BetaactinMouse1∶10004mL次日，洗膜：TBST洗3次，每次10分鐘。二抗孵育：5％(mg/mL)BSA-TBST稀釋二抗，山羊抗兔IgG(H+L)辣根過氧化酶(HRP)和山羊抗鼠IgG(H+L)HRP1∶10000，室溫孵育40分鐘。洗膜：TBST洗膜3次，每次10分鐘?；瘜W發(fā)光底物ECL滴加到膜的蛋白面，反應3-5分鐘；膠片曝光：10秒-5分鐘(曝光時間隨不同光強度而調整)，顯影2分鐘，定影。膠片用掃描儀掃描為大于300DPI的TIF格式圖片，使用QuantityOne分析軟件(Bio-Rad公司)進行灰度分析，結果顯示PKCiota、PROM1、ALDH1和ABCG2與內參β-actin灰度比值的平均值分別為0.35、0.46、0.47和0.59，標準差分別為0.17、0.21、0.20和0.27。差異蛋白表達分界值按100份人肺癌細胞蛋白免疫印跡技術檢測所得灰度比值的平均值+3倍標準差取值，即PKCiota分界值為0.86，PROM1分界值為1.09，ALDH1分界值為1.07以及ABCG2分界值為1.40。制備例2正常人肺泡上皮細胞的差異蛋白表達檢測將購自美國ScienCell公司的正常細胞系的人肺泡上皮細胞(HPAEpiC)，在10mL杜爾貝可改良伊格爾(DMEM)/高糖培養(yǎng)基(含20％胎牛血清和1×青霉素與鏈霉素混合液，北京索萊寶公司)中，75cm2培養(yǎng)瓶中，放置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞生長達到培養(yǎng)瓶底面的90％匯合時，用2mL胰酶(北京索萊寶公司)消化后，苔盼蘭計數(shù)，用新鮮DMEM/高糖培養(yǎng)基(含20％胎牛血清和1×青霉素與鏈霉素混合液)進行傳代培養(yǎng)。根據(jù)制備例1中蛋白免疫印跡技術檢測100份上述細胞的差異蛋白表達水平，經(jīng)灰度分析，結果顯示PKCiota、PROM1、ALDH1和ABCG2與內參β-actin灰度比值的平均值分別為0.00、0.53、0.61和0.35，均低于差異蛋白表達的分界值。制備例3正常人肺泡干細胞的差異蛋白表達檢測將購自美國ATCC公司的正常細胞系的人肺間充質干細胞(HPMSC)，在10mL杜爾貝可改良伊格爾(DMEM)/F12(1∶1)培養(yǎng)基(含體積比10％胎牛血清和1×青霉素與鏈霉素混合液，北京索萊寶公司)中，75cm2培養(yǎng)瓶中，放置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞生長達到培養(yǎng)瓶底面的90％匯合時，用2mL胰酶(北京索萊寶公司)消化后，苔盼蘭計數(shù)，用新鮮DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基(含體積比10％胎牛血清和1×青霉素與鏈霉素混合液)進行傳代培養(yǎng)。根據(jù)制備例1中蛋白免疫印跡技術檢測100份上述細胞的差異蛋白表達水平，經(jīng)灰度分析，結果顯示PKCiota、PROM1、ALDH1和ABCG2與內參β-actin灰度比值的平均值分別為0.00、0.98、1.01和0.24，均低于表達分界值。制備例4肺癌患者組織來源干細胞樣肺癌細胞的差異蛋白表達檢測肺癌組織來自在患者進行手術時采集的，患者經(jīng)病理檢查確診為肺癌，并與患者簽署知情同意書，患者信息如下表所示。患者序號年齡性別病理分型是否簽署知情同意書141男非小細胞肺腺癌是236男低分化肺鱗癌是352女非小細胞肺腺癌是446男小細胞肺癌是557女非小細胞肺腺癌是643男非小細胞肺腺癌是736女低分化肺鱗癌是827女非小細胞肺腺鱗癌是967女小細胞肺癌是1070男非小細胞肺腺癌是用眼科剪將肺癌瘤組織剪碎成為約1mm3的小塊。所得剪碎的組織小塊用0.25％胰酶溶液以1克：0.5mL的重量體積比消化5分鐘后，加入胰酶溶液體積1/5的小牛血清(美國Hyclone公司)終止，以1000rpm離心收集消化好的組織小塊，棄上清，所得離心沉淀用Accutase(阿尤替斯酶，美國西格瑪公司)以1克：1mL的體積比在37℃下混勻消化10分鐘，然后在1000rpm下離心5min收集細胞，用以1克：1mL的重量體積比用杜爾貝可改良伊格爾-F12培養(yǎng)基重懸。所得重懸液用40μm分子篩(美國BD公司)過濾。用所述孔徑的分子篩過濾，截留的是大片細胞碎片和未被消化的細胞團，濾出的是細胞懸液。取1份50μL(2×106個)上述得到細胞懸液，根據(jù)蛋白免疫印跡技術，優(yōu)選制備例1中蛋白免疫印跡技術，檢測10位患者分別10份上述細胞的差異蛋白表達水平，經(jīng)灰度分析，結果顯示PKCiota、PROM1、ALDH1和ABCG2與內參β-actin灰度比值的平均值分別為0.00、0.80、0.91和1.27，差異蛋白均低于表達分界值。收集剩余的所述細胞懸液后，向其中含有5ng/mLB27、40ng/mL人表皮生長因子(epidermalgrowthfactor，EGF)、30ng/mL堿性成纖維細胞生長因子(bEGF)和30mg/mL胰島素的杜爾貝可改良伊格爾-F12(Dulbecco’smodifiedEagle’smedium-F12)(DMEM/F12)培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)使細胞懸液濃度被稀釋為2×106細胞/mL。然后將每5mL所得稀釋的細胞懸液轉移至25cm2滅菌塑料培養(yǎng)瓶中在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)所得細胞呈成神經(jīng)球狀懸浮生長，吸取培養(yǎng)基到15mL離心管中，每分鐘1000轉，4℃離心10分鐘收集懸浮細胞，棄上清，沉淀細胞添加新鮮的含有8ng/mLB27、30ng/mL人表皮生長因子、20ng/mL堿性成纖維細胞生長因子和20mg/mL胰島素的杜爾貝可改良伊格爾-F12(DMEM/F12)培養(yǎng)基。當細胞球生長達到1μm左右時，用Accutase消化成單細胞后，用含有8ng/mLB27、30ng/mL人表皮生長因子、20ng/mL堿性成纖維細胞生長因子和20mg/mL胰島素的杜爾貝可改良伊格爾-F12(DMEM/F12)培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)(1瓶傳幾個瓶，每瓶起始培養(yǎng)的細胞密度為2×106細胞/mL)。按照上述傳代條件再傳4代，得到成神經(jīng)球狀的細胞。取1份50μL(2×106個)上述成神經(jīng)球培養(yǎng)得到的干細胞樣肺癌細胞懸液，根據(jù)制備例1中蛋白免疫印跡技術檢測上述10位患者分別10份上述細胞的差異蛋白表達水平，經(jīng)灰度分析，結果顯示PKCiota、PROM1、ALDH1和ABCG2與內參β-actin灰度比值的平均值分別為2.31、3.46、7.97和6.48，差異蛋白均高于表達分界值，表明培養(yǎng)得到的干細胞樣肺癌細胞特異表達該5種差異蛋白。對比例1利用MariaM.Ho等人記載的方法分離并制備干細胞樣肺癌細胞及其抗原組合物肺癌患者腫瘤標本用5mL的1×磷酸緩沖液漂洗3次，使用無菌研磨棒在無菌細胞平皿中機械法磨碎后，加入2mL的DMEM培養(yǎng)基(含0.1膠原酶活性Wunschunits/mL，瑞士Roche診斷公司)在37℃，搖動培養(yǎng)箱中消化4小時。消化液用18.5G針管進一步去除團塊，并用100μm細胞篩過篩，獲得單細胞懸液。單細胞懸液用70％和40％的細胞分離液Percoll梯度離心，室溫下每分鐘2500轉離心20分鐘，收集在70％/40％界面的細胞。細胞用DMEM培養(yǎng)基(美國Invitrogen生命技術公司)(含體積比2％小牛血清和10mmol/LHEPES緩沖液)重懸至106/mL，加入終濃度熒光染料Hoechst33342至終濃度5μg/mL，在37℃下孵育90分鐘，并間隔10分鐘搖勻一次。然后細胞用冷的HBSS緩沖液(含體積比2％小牛血清和10mmol/LHEPES緩沖液)洗滌一次，并4℃下每分鐘1000轉離心5分鐘收集細胞，并用冷的HBSS緩沖液(含體積比2％小牛血清和10mmol/LHEPES緩沖液)重懸。細胞分選前過40μm細胞篩得到細胞懸液，然后使用美國BD公司流式細胞儀FACSVantageSE分選，根據(jù)儀器使用說明書操作分選獲得Hoechst33342染色的側群細胞(SP)，即干細胞樣肺癌細胞。取1份50μL(2×106個)上述得到細胞懸液，根據(jù)制備例1中蛋白免疫印跡技術檢測10位患者分別10份上述細胞的差異蛋白表達水平，經(jīng)灰度分析，結果顯示PKCiota、PROM1、ALDH1和ABCG2與內參β-actin灰度比值的平均值分別為0.05、0.98、0.61和2.27，除ABCG2灰度比值高于表達分界值外，其余的差異蛋白均低于表達分界值。實施例1免疫磁珠法富集特異表達差異蛋白的干細胞樣肺癌細胞使用制備例4中傳代培養(yǎng)獲得108個細胞，用0.5mL孵育液PBE(含0.5％BSA和0.08％EDTA的pH7.21×PBS，真空抽濾除菌及液體內氣體)充分混勻細胞，加入一抗(20μg/ml終濃度的兔抗人PKCiota抗體，美國Santa公司)，4℃孵育30分鐘。用20倍體積PBE洗細胞一次，再加0.3mLPBE充分混勻細胞后，加入50μL二抗山羊抗兔IgG(H+L)包被的超微磁珠(美國Invitrogen生命技術公司)，混勻后置8℃孵育15分鐘，然后加入5倍體積PBE洗細胞3次，再用0.3mLPBE充分混懸細胞。將分離柱安裝入磁鐵分離器中，加入0.5mlPBE，在重力作用下自然流盡，預處理分離柱。向分離柱中加入0.3mL細胞的PBE懸液，在重力作用下自然流盡PBE。將分離柱從磁鐵分離器上取下，用特殊注射器吸取沖洗液加壓注入，洗脫下吸附的PKCiota陽性細胞。使用一抗為小鼠抗人PROM1、兔抗人ALDH1和小鼠抗人ABCG2的抗體，以及相對應的二抗山羊抗鼠和山羊抗兔的IgG(H+L)包被的超微磁珠，可連續(xù)分選出表達PKCiota、PROM1、ALDH1和ABCG2中至少兩種的干細胞樣肺癌細胞。實施例2流式細胞儀分選法富集特異表達差異蛋白的干細胞樣肺癌細胞使用制備例4中傳代培養(yǎng)獲得108個細胞，用1×PBS(pH7.2)(含體積比2％胎牛血清)重懸至2×106/mL，加入20μg/mL終濃度的兔抗人PKCiota抗體，在37℃下孵育90分鐘，并間隔10分鐘搖勻一次。然后細胞用冷的1×PBS(pH7.2)(含體積比2％胎牛血清)洗滌一次，并4℃下每分鐘1000轉離心5分鐘收集細胞，加入5mL含50μLFITC標記的二抗山羊抗兔IgG(H+L)的冷的1×PBS(pH7.2)，混勻后置4℃孵育30分鐘，并用冷的1×PBS(pH7.2)(含體積比2％小牛血清)洗滌3次，重懸于5mL的1×PBS(pH7.2)(含體積比2％小牛血清)中。細胞懸液然后使用美國BD公司流式細胞儀FACSVantageSE分選，根據(jù)儀器使用說明書操作分選獲得PKCiota陽性細胞。使用一抗為小鼠抗人PROM1、兔抗人ALDH1和小鼠抗人ABCG2的抗體，以及相對應的FITC標記的二抗山羊抗鼠和山羊抗兔的IgG(H+L)，使用美國BD公司流式細胞儀FACSVantageSE連續(xù)富集表達PKCiota、PROM1、ALDH1和ABCG2中至少兩種的的干細胞樣肺癌細胞。也可以先使用磁珠法富集PKCiota陽性細胞，然后使用流式細胞儀富集其他差異蛋白陽性的細胞，這樣也可以獲得富集特異表達兩種以上差異蛋白的干細胞樣肺癌細胞。實施例3干細胞樣肺癌細胞抗原組合物制備利用本發(fā)明所述的方法分離并制備干細胞樣肺癌細胞及其抗原組合物。取上述制備例1和4所得的肺癌細胞和干細胞樣肺癌細胞以及上述實施例1-2中富集特異表達PKCiota、PROM1、ALDH1和ABCG2中至少兩種的干細胞樣肺癌細胞，選擇富集PKCiota和PROM1雙陽性，PKCiota、PROM1和ALDH1三陽性，PKCiota、PROM1、ALDH1和ABCG2四陽性的干細胞樣肺癌細胞；并取對比例1獲得的干細胞樣肺癌細胞。在液氮中和室溫(25℃)下反復凍融5次，通過倒置顯微鏡檢測到所述細胞完全裂解。所得裂解液在600rpm下離心1min，收集上清用0.45μm濾膜過濾，收集濾液。所述裂解液即干細胞樣肺癌細胞的抗原組合物，儲存在-80℃中備用。實施例4樹突狀細胞獲取取100mL外周血經(jīng)Ficoll-Hypaque密度梯度離心，得到單個核細胞。外周血單個核細胞用RPMI1640培養(yǎng)基重懸，并加入6孔板中貼壁。在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育90min后，未貼壁細胞洗滌收集下來，用于誘導CIK細胞。貼壁細胞加入完全培養(yǎng)基RPMI1640誘導培養(yǎng)，含有5％的自體血清、2000IU/mL重組人粒細胞巨噬集落刺激因子和1500IU/mLIL-4。在培養(yǎng)到第三天時細胞更換新鮮培養(yǎng)基(含2000IU/mLGM-CSF和1500IU/mLIL-4)。培養(yǎng)到第五天收獲未成熟樹突狀細胞(DCs)，成熟DCs采用完全RPMI1640培養(yǎng)基在誘導到第七天得到，含0.1μg/mL脂多糖和20ng/mL腫瘤壞死因子α。在第五天時添加特殊抗原(如PKCiota、PROM1、ALDH1和ABCG2四陽性干細胞樣肺癌細胞抗原)，負載DCs。實施例5肺癌細胞抗原負載DCs培養(yǎng)5天后，3×106個未成熟DCs用制備例1和4、實施例1-2和對比例1所述的干細胞樣肺癌細胞裂解抗原組合物(得自1×106干細胞樣肺癌細胞)在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中負載4小時?？乖撦d的DCs通過離心(10min，1000rpm)收獲得到。所得DCs經(jīng)生理鹽水洗滌3次，后重懸到生理鹽水中，至濃度為3×106成熟DC/mL，并添加終濃度為質量體積比2％的人血白蛋白，從而制備成干細胞樣肺癌細胞裂解抗原組合物負載的DC疫苗。實施例1或/和2制備獲得的PKCiota、PROM1、ALDH1和ABCG2四陽性干細胞樣肺癌細胞抗原負載樹突狀細胞通過CD86-PE、CD80-PE、CD40-FITC、CD83-PE、CD11c-FITC和HLA-DR-PerCP(BD公司)染色，流式細胞儀檢測負載后DC表型變化。圖1顯示制備的DC表型為CD11c+/HLA-DR+為99.0％，CD11c+/CD83+為98.5％，CD86+/HLA-DR+為99.6％，CD80+/HLA-DR+為99.1％和CD40+/HLA-DR+為99.7％，符合DC細胞特異表型，并高表達共刺激分子。效果說明例1：制備例1和4、實施例1-2和對比例1所得的肺癌細胞抗原負載的DC疫苗體外殺瘤試驗在6孔板內，仍以含5％小牛血清的RPMI1640為培養(yǎng)基，按上述抗原負載的成熟樹突狀細胞∶T細胞＝1∶5的比例混合上述抗原負載的成熟樹突狀細胞和T細胞，同時加入GM-CSF(終濃度為800U/mL)和IL-4(終濃度為20ng/mL)，共培養(yǎng)7天，期間每隔1天均半量換液(含5％小牛血清、終濃度為800U/mL的GM-CSF和終濃度為20ng/mL的IL-4的RPMI1640培養(yǎng)基)，得到CTL細胞。選擇相應的肺癌細胞作為靶細胞，用51Cr標記，即靶細胞(2×106/mL)通過與300μCi51Cr在RPMI1640培養(yǎng)基中37℃孵育2小時。標記好的靶細胞用1×PBS洗滌三次，并最終用RPMI1640(含10％小牛血清)重懸到2×105的濃度。以每孔2×104個標記的靶細胞(0.1mL)添加到96孔板的孔中。將上述產(chǎn)生的CTL細胞(效應細胞)分別以2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1和40∶1的效靶比加入對應的孔中，在37℃孵育4小時。孵育后，取上清75μL組分用γ放射計數(shù)器計數(shù)。特異的51Cr釋放的百分比根據(jù)下述的公式進行計算。其中，自發(fā)釋放的每分脈沖數(shù)通過單獨培養(yǎng)靶細胞(未加效應細胞)獲得，最大釋放的每分脈沖數(shù)是用終濃度2％NP-40(表面活性劑，上海生工)處理的單獨培養(yǎng)靶細胞后獲得的。檢測的每分脈沖數(shù)通過添加效應細胞的靶細胞培養(yǎng)獲得的。圖2顯示了由實施例1或/和2所得PKCiota和PROM1雙陽性，PKCiota、PROM1和ALDH1三陽性，PKCiota、PROM1、ALDH1和ABCG2四陽性的干細胞樣肺癌細胞抗原組合物負載樹突狀細胞，得到細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，由該CTL細胞產(chǎn)生的對PKCiota和PROM1雙陽性干細胞樣肺癌細胞的應答結果。如圖2所示，隨著效靶比不斷提高，對干細胞樣肺癌細胞產(chǎn)生的CTL應答也特異升高，并且由富集四種陽性差異蛋白的實施例效果佳。其中，PP-DC1表示為PKCiota和PROM1雙陽性干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞引發(fā)對PKCiota和PROM1雙陽性干細胞樣肺癌細胞的毒性活性；PPA-DC2表示為PKCiota、PROM1和ALDH1三陽性干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞引發(fā)對PKCiota和PROM1雙陽性干細胞樣肺癌細胞的毒性活性；PPAA-DC3表示為PKCiota、PROM1、ALDH1和ABCG2四陽性干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞引發(fā)對PKCiota和PROM1雙陽性干細胞樣肺癌細胞的毒性活性。所述PKCiota和PROM1雙陽性干細胞樣肺癌細胞按照實施例1或/和2制備。圖3顯示了由實施例1或/和2所得PKCiota和PROM1雙陽性的干細胞樣肺癌細胞抗原組合物負載樹突狀細胞(PP-DC1)，以及由制備例1、4和對比例1所得三種抗原組合物分別負載樹突狀細胞，得到四種細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，由該四種CTL細胞分別對PKCiota和PROM1雙陽性干細胞樣肺癌細胞產(chǎn)生的應答結果對比圖。其中，PP-DC1表示為PKCiota和PROM1雙陽性干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞引發(fā)對PKCiota和PROM1雙陽性干細胞樣肺癌細胞的毒性活性；A549-DC4表示制備例1肺癌細胞A549抗原負載的樹突狀細胞引發(fā)對PKCiota和PROM1雙陽性干細胞樣肺癌細胞的毒性活性，LSC-DC5表示制備例4的肺癌成神經(jīng)球細胞抗原負載的樹突狀細胞對PKCiota和PROM1雙陽性干細胞樣肺癌細胞的毒性活性，DLSC-DC6表示對比例1的干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞對PKCiota和PROM1雙陽性干細胞樣肺癌細胞的毒性活性。如圖3所示由實施例1或/和2所得PKCiota和PROM1雙陽性的干細胞樣肺癌細胞抗原組合物負載樹突狀細胞(PP-DC1)引發(fā)對PKCiota和PROM1雙陽性干細胞樣肺癌細胞的細胞毒性活性要分別高于A549-DC4、LSC-DC5和DLSC-DC6引發(fā)對PKCiota和PROM1雙陽性干細胞樣肺癌細胞的細胞毒性活性。所述PKCiota和PROM1雙陽性干細胞樣肺癌細胞按照實施例1或2制備。圖4顯示了由實施例1或/和2所得PKCiota和PROM1雙陽性的干細胞樣肺癌細胞抗原組合物負載樹突狀細胞，以及由制備例1、4和對比例1所得三種抗原組合物分別負載樹突狀細胞，得到四種細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，由該四種CTL細胞分別對對比例1獲得的干細胞樣肺癌細胞產(chǎn)生的應答結果對比圖。其中，PP-DC1’表示為PKCiota和PROM1雙陽性干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞引發(fā)對對比例1獲得的干細胞樣肺癌細胞的毒性活性；A549-DC4’表示肺癌細胞A549抗原負載的樹突狀細胞引發(fā)對對比例1獲得的干細胞樣肺癌細胞的毒性活性，LSC-DC5’表示制備例4的肺癌成神經(jīng)球細胞抗原負載的樹突狀細胞對對比例1獲得的干細胞樣肺癌細胞的毒性活性，DLSC-DC6’表示對比例1的干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞對對比例1獲得的干細胞樣肺癌細胞的毒性活性。如圖4所示由實施例1或/和2所得PKCiota和PROM1雙陽性的干細胞樣肺癌細胞抗原組合物負載樹突狀細胞(PP-DC1)引發(fā)對對比例1獲得的干細胞樣肺癌細胞的細胞毒性活性要分別高于A549-DC4、LSC-DC5和DLSC-DC6引發(fā)對對比例1獲得的干細胞樣肺癌細胞的細胞毒性活性。效果說明例2：制備例1和4、實施例1-2和對比例1所得的肺癌細胞在體內殺瘤實驗中的作用以含5％小牛血清的RPMI1640為培養(yǎng)基，將3×106個的未成熟樹突狀細胞用上述制備例1和4、實施例1-2和對比例1所得的肺癌細胞裂解抗原組合物(得自1×106干細胞樣肺癌細胞)在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中負載4小時?？乖撦d的成熟樹突狀細胞通過1000rpm離心10min得到。將所述抗原負載的成熟樹突狀細胞用生理鹽水洗滌3次，然后重懸至1×106個/mL的濃度，4℃下保存?zhèn)溆谩８杉毎麡臃伟┘毎⒑煞伟┝鍪竽Ｐ?參見“人結腸癌細胞在免疫缺陷小鼠中能誘發(fā)腫瘤的生長”，O′BrienCA等人，自然，第445卷，第106-110頁，2008年2月3日；O′BrienCA，PollettA，GallingerS，etal.Ahumancoloncancercellcapableofinitiatingtumourgrowthinimmunodeficientmice.Nature，2007，445(7123)：106-110.)，隨機分為A、B、C、D、E、F和G7組，每組6只：A組為富集PKCiota和PROM1雙陽性的干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞治療組；B組為PKCiota、PROM1和ALDH1三陽性的干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞治療組；C組為PKCiota、PROM1、ALDH1和ABCG2四陽性的干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞治療組；D組為制備例1制備的肺癌細胞A549抗原負載的樹突狀細胞對比組(注射液制備方法與A組相同)；E組為制備例4制備的干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞對比組(注射液制備方法與A組相同)；F組為對比例1獲得的的干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞為對比組(注射液制備方法與A組相同)；G組為同體積生理鹽水空白組。A、B、C、D、E和F六組在第0天荷瘤鼠模型皮下輸注0.5-2×106個/mL樹突狀細胞，各0.5mL，半個月后再同樣劑量免疫1次。注射后分別于7、14、21、28、35d計算鼠模型荷瘤大小，G組于相同時間點在皮下注射0.5mL生理鹽水并計算鼠模型荷瘤大小。經(jīng)干細胞樣肺癌細胞抗原負載的樹突狀細胞疫苗對荷瘤鼠模型的抑制生長情況(mm3，)如下表所示。注：*空白組與治療組相比P遠小于0.01；#對比組與治療組相比P＜0.01。此外，有關實施例1或/和2富集所得兩種差異蛋白陽性以上的干細胞樣肺癌細胞負載DC引發(fā)的體內殺瘤活性，遠遠好于有關制備例1、4和對比例1的肺癌細胞的體內殺瘤活性。此外有關實施例5或/和6所得PKCiota、PROM1、ALDH1和ABCG2四陽性的干細胞樣肺癌細胞的體內殺瘤活性，好于有關實施例1或/和2所得兩種差異蛋白陽性和三種差異蛋白陽性的干細胞樣肺癌細胞的體內殺瘤活性。