專利名稱：新的溫度和pH敏感性共聚物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型共聚物，具體涉及溫度和pH敏感的兩性共聚物。本發(fā)明還涉及包含對藥物遞送有用的新型共聚物的組合物，以及對動物和人提供選擇的治療劑的方法。
背景技術(shù)：
研發(fā)可以提供治療藥物的準(zhǔn)確靶向、時機和劑量的復(fù)雜藥物制品和藥物遞送的方法已經(jīng)十分必要，這種必要性部分是由于在治療例如癌癥、HIV/AIDS、囊性纖維變性等疾病所致的器官特異性疾病上的復(fù)雜需求。一些對復(fù)雜的治療需求有貢獻的因素包括用于治療這種疾病的藥物的毒性、藥物的限制性治療活性以及患病器官的難接近性和異質(zhì)性。
在藥物的遞送上已經(jīng)取得了進展，尤其是在藥物載體的研發(fā)上，所述藥物載體表現(xiàn)出低毒性并且能夠改善對患病細(xì)胞的靶向。已經(jīng)研究了一些類型的藥物載體，包括脂質(zhì)體、藥物聚合物結(jié)合體和納米微粒。
近來，已經(jīng)出現(xiàn)聚合物核-殼納米顆粒作為使難溶于水的和兩性藥物以及基因靶向腫瘤位點的有前景的膠體載體[Kataoka et al.-Advanced Drug Delivery Rev.47(2001)113-131；V.P.Torchilin-J.Control.Rel.73(2001)137-172；Allen et al.-Cool.Surf. BBiointerfaces 16(1999)3-27]。聚合物核-殼納米顆粒尺寸很小，通常小于200nm，并且可以在其內(nèi)核中通過疏水性相互作用、靜電相互作用和氫鍵結(jié)合等增溶疏水藥物、基因或蛋白質(zhì)，同時將其疏水殼暴露于外界環(huán)境。這有效地防止了包封的生物活性化合物的降解，并且通過避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)吸收而使它們能夠在體循環(huán)中表現(xiàn)出延長的活性。使用聚合物核-殼納米顆粒可以通過增強的滲透和保持作用(EPR effect)被動地和主動地實現(xiàn)靶向[Matsumura et al.-CancerResearch 46(1986)6387-6392]和將識別信號引入膠束表面[Kabanovet al.-FEBS Lett.258(1989)343-345]或?qū)雽ι憝h(huán)境變量例如溫度或pH敏感的聚合物。
近來，由于聚合物的熱響應(yīng)性，使得具有由溫度敏感的聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)構(gòu)成殼的聚合物納米顆粒吸引了相當(dāng)多的注意力。PNIPAAm在水溶液中表現(xiàn)出約32℃的低臨界溶解溫度(LCST)，低于該溫度時聚合物是水溶性的，高于該溫度時聚合物不溶于水[Taylor et al.-J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.13(1975)2551-2570]。聚合物的溫度敏感性有利地提供了通過熱使藥物載體靶向的方法。
Okano et al.報道了引入多柔比星的膠束結(jié)構(gòu)的合成，所述膠束結(jié)構(gòu)衍生自PNIPAAm-b-聚(甲基丙烯酸丁酯)和PNIPAAm-b-聚(D，L-丙交酯)嵌段共聚物[Chung et al.-J.Control.Rel.62(1999)115-127；Kohori et al-Colloids and Surfaces BBiointerfaces 16(1999)195-205]。核-殼納米顆粒在LCST下很好地形成，但是在高于LCST溫度下核-殼納米顆粒變形。藥物的釋放通過局部加熱和冷卻循環(huán)來調(diào)節(jié)。然而，發(fā)現(xiàn)單獨溫度調(diào)節(jié)對靶向深部組織或腫瘤不太有效。
溫度敏感性藥物載體的一種替代方案是pH敏感性藥物載體。例如已知大多數(shù)固體腫瘤的細(xì)胞外pH為5.7-7.8[Vaupel et al.-CancerResearch 41(1981)2008-2013]，而腫瘤間質(zhì)流體的pH很少低于pH6.5。提供具有這樣窄的pH窗口的藥物載體是個挑戰(zhàn)[Drummond et al.-Progress in Lipid Research 39(2000)409-460]。
Chen和Hoffman報道了NIPAAm和丙烯酸的共聚物的合成及其pH依賴性的LCST，并且提出其在藥物靶向方面的可能應(yīng)用[Nature373(1995)49-52]。更近一些，報道了由聚(L-組氨酸)-b-聚(乙二醇)(PEG)制成的核-殼納米顆粒是pH敏感性的，其在pH7.4-6.8下釋放包封的藥物-鏈霉菌(DOX)[Lee et al.-J.Control.Rel.90(2003)363-374；J.Control.Rel.91(2003)103-113]。酸性環(huán)境引起核-殼納米顆粒的不穩(wěn)定并因此在腫瘤組織處釋放包封的藥物分子。
WO 01/87227 A2公開了由具有疏水核和親水殼的聚合物膠束組成的膠體組合物的用途。所述pH和溫度敏感性膠束衍生自NIPAAm、甲基丙烯酸和丙烯酸十八醇酯的共聚物。溫度敏感性和pH敏感性部分定位于膠束的殼上。
盡管已經(jīng)取得了進展，但目前的藥物載體仍存在限制，為此需要進一步改善其性能。
因此，本發(fā)明的目的是提供聚合化合物，其可以用作具有改善的pH和溫度敏感性的藥物載體，并且因此提供改善的藥物遞送性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供pH和溫度敏感性共聚物，其可以用作藥物遞送材料。在一個方面，本發(fā)明涉及包含至少三類單體單元的共聚物，所述三類單體單元包含溫度敏感性單元，親水單元，和包含至少一個pH敏感性部分的疏水單元；其中所述疏水單體單元衍生自可共聚的不飽和脂肪酸。
在另一方面，本發(fā)明涉及溫度和pH敏感性組合物，其包含治療劑，和包含至少三類單體單元的共聚物，所述三類單體單元包含溫度敏感性單元，親水單元，和包含至少一個pH敏感性部分的疏水單元；其中所述疏水單體單元衍生自可共聚的不飽和脂肪酸。
在又一個方面，本發(fā)明提供一種向動物或人提供選擇的治療劑的方法，所述方法包括向動物或人施用溫度和pH敏感性組合物，所述組合物包含治療劑，和包含至少三類單體單元的共聚物，所述三類單體單元包含溫度敏感性單元，親水單元，和包含至少一個pH敏感性部分的疏水單元；其中所述疏水單體單元衍生自可共聚的不飽和脂肪酸；其中所述共聚物被安排在至少一個包含疏水核和親水殼的納米顆粒中；和其中所述治療劑包含在所述疏水核中。
根據(jù)以下描述、附圖和非限制性實施例將更全面地理解本發(fā)明的這些方面。


圖1示出方案1，其出于說明性目的描述了使用單體N-異丙基丙烯酰胺、N，N’-二甲基丙烯酰胺和10-十一碳烯酸與鏈轉(zhuǎn)移劑-氨基乙硫醇進行合成本發(fā)明共聚物的一種可能方案。表1示出在示例性試驗中用來形成本發(fā)明共聚物的各種進料摩爾比和所得共聚物的物理特征，也就是分子量、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、親水單元對溫度敏感性單元的實際摩爾比、酸度和熱降解溫度。氨基乙硫醇用作鏈轉(zhuǎn)移劑將末端部分引入這些共聚物中。
圖2示出聚合物的典型1H NMR譜，該聚合物由單體N-異丙基丙烯酰胺、N，N’-二甲基丙烯酰胺和10-十一碳烯酸以3.5∶1.5∶0.5(聚合物III)的進料摩爾比在CDCl3中合成得到。
圖3示出聚合物III的典型FT-IR譜。
圖4示出在500nm和變化的pH下，聚合物的光透射率作為溫度的函數(shù)的圖，所述聚合物由單體N-異丙基丙烯酰胺、N，N’-二甲基丙烯酰胺和10-十一碳烯酸以4.0∶1.00∶0.5(聚合物I)的進料摩爾比合成得到。
圖5示出在500nm和變化的pH下，聚合物的透射率作為溫度的函數(shù)的圖，所述聚合物由單體N-異丙基丙烯酰胺、N，N’-二甲基丙烯酰胺和10-十一碳烯酸以3.75∶1.25∶0.5(聚合物II)的進料摩爾比合成得到。
圖6示出在500nm和變化的pH下，聚合物III的透光率作為溫度的函數(shù)的圖。
圖7示出在500nm和含有10(w/v)％BSA的PBS(pH7.4)中，聚合物II的透光率作為溫度的函數(shù)的圖。
圖8示出I3/I1作為聚合物濃度(聚合物II)的函數(shù)的圖。
圖9示出負(fù)載DOX的納米顆粒的尺寸分布的典型圖形。
圖10示出負(fù)載藥物的納米顆粒的TEM圖。
圖11示出聚合物II對L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
圖12示出在37℃和變化的pH下，DOX從聚合物II納米顆粒的釋放曲線。
圖13示出方案2，其描述了葉酸與N-氫基琥珀酰亞胺(NHS)的活化作用。
圖14示出方案3，其描述了葉酸與聚合物II的結(jié)合。
圖15示出方案4，其描述了膽固醇與聚合物II通過NHS活化作用的結(jié)合。
圖16示出結(jié)合葉酸的聚合物II的NMR譜。
圖17示出接枝膽固醇的聚合物II的NMR譜。
圖18示出在500nm和變化的pH下，作為溫度的函數(shù)的聚葉酸和聚合物II的光透射率圖。
圖19示出在500nm下和pH 7.4時，作為溫度的函數(shù)的聚膽固醇的光透射率。
圖20示出在500nm下和不同pH時，作為溫度的函數(shù)的聚膽固醇-葉酸的光透射率。
圖21示出描述聚膽固醇-葉酸對L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性的柱狀圖。
圖22示出共聚物、紫杉醇和負(fù)載紫杉醇的核-殼納米顆粒的DSC分析。
圖23示出鹽酸多柔比星結(jié)構(gòu)式。
圖24示出結(jié)合多柔比星的聚合物II的合成。
圖25示出結(jié)合多柔比星的聚合物II的凝膠滲透色譜圖。
圖26示出結(jié)合多柔比星的聚合物II的差示掃描量熱圖。
圖27示出在pH7.4的PBS中，結(jié)合藥物的膠束的溫度敏感性可逆顆粒尺寸。
圖28示出方案5，其描述了由NIPAAm和DMAAm組成的溫度嵌段的合成以及聚(10-十一碳烯酸)的合成。
圖29示出方案6，其描述了嵌段共聚物的合成。
圖30示出溫度敏感性嵌段和嵌段共聚物的凝膠滲透色譜圖。
圖31示出嵌段共聚物的LCST測量。
具體實施例方式
本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，即由引入脂肪酸作為疏水、pH敏感官能團的共聚物得到的核-殼納米顆粒具有極好的作為藥物載體的特征。本發(fā)明的共聚物可以自組裝成核-殼結(jié)構(gòu)，所述核-殼結(jié)構(gòu)包含被親水殼包圍的疏水核，在疏水核中安置疏水部分例如脂肪酸，所述親水殼包含共聚物的親水部分。藥物可以通過物理截留或化學(xué)結(jié)合而包封在核內(nèi)。這些納米顆粒能夠響應(yīng)環(huán)境pH變化的狹窄窗口來改變它們的物理構(gòu)造，引起包封在納米顆粒疏水核中的藥物的釋放。
本發(fā)明的共聚物的一個優(yōu)點是，可以使由這些共聚物形成的核-殼納米顆粒的低臨界溶解溫度(LCST)依賴于環(huán)境pH，這意味著核-殼納米顆粒的這種結(jié)構(gòu)變形可以通過環(huán)境pH變化引起。可以將這種特性用于靶向特征為酸性的環(huán)境中的器官或腫瘤組織。在正常生理pH下，核-殼納米顆粒的LCST高于正常體溫(大約37℃)。然而，在微酸環(huán)境中，納米顆粒的LCST低于正常體溫。這意味著核-殼納米顆粒在生理環(huán)境中是穩(wěn)定的，但在酸性環(huán)境中不穩(wěn)定或凝聚。
不希望受到理論的束縛，認(rèn)為使用脂肪酸作為共聚物的疏水、pH敏感部分有助于使本發(fā)明共聚物更加pH敏感。pH敏感性官能團與脂肪酸的疏水片段結(jié)合，意味著它們被組裝到核-殼納米顆粒中。還認(rèn)為由這些聚合物制成的核-殼納米顆粒堆積松散，使得pH敏感性官能團雖然位于納米顆粒的內(nèi)核但仍然可以接近外部環(huán)境。當(dāng)外部環(huán)境的pH改變時，pH敏感性官能團也可以改變，例如離子化或去離子化。這導(dǎo)致脂肪酸的疏水性改變，并且因此改變納米顆粒的LCST，引起藥物分子釋放。此外，由于脂肪酸是天然化合物，因此認(rèn)為它們是高生物相容性的并且應(yīng)該在人體內(nèi)具有非常低的毒性。
本發(fā)明的共聚物包含至少三類單體單元。為清楚起見，本文提到的術(shù)語“單體單元”指已經(jīng)聚合成聚合物的單體。它不同于術(shù)語“單體”，“單體”表示能夠聚合成聚合物的確定的分子實體。
本發(fā)明共聚物中所需的一類單體單元是溫度敏感性/響應(yīng)性單元。在本發(fā)明中，溫度敏感性單體單元被用來賦予共聚物以溫度敏感性，導(dǎo)致形成溫度敏感性共聚物。溫度敏感性共聚物通常表現(xiàn)出明確的LCST或UCST(高臨界溶解溫度)，還被稱為相轉(zhuǎn)變溫度。具有明確的LCST的共聚物(在后面稱為‘LCST系統(tǒng)’)在大于LCST時不溶于水，而那些具有明確的UCST的共聚物在低于UCST時是不可溶的。這種特性通過當(dāng)溫度改變跨越臨界溶解溫度發(fā)生時或者共聚物的臨界溶解溫度響應(yīng)pH變化而移動跨越靜態(tài)環(huán)境溫度時共聚物中構(gòu)型的變化得到證實。一般而言，大多數(shù)藥物遞送利用LCST系統(tǒng)。當(dāng)環(huán)境溫度高于LCST時，LCST系統(tǒng)的突然收縮和得到的不溶性使得本發(fā)明共聚物離開水相并且呈現(xiàn)疏水相，由此促進與細(xì)胞膜的相互反應(yīng)。此外，溫度敏感性單體單元可以與親水的共聚單體例如丙烯酰胺(AAm)或者與其它類型的改性共聚單體共聚合，實現(xiàn)較高或較低的LCST。這種共聚物可以用作控制藥物釋放速率的功能性藥物遞送材料。
適用于本發(fā)明的溫度敏感性單體單元可以含有一種或多種極性官能團，例如伯、仲或叔氨基、酰胺基、羧基、羰基或羥基，所有這些基團性質(zhì)上都是極性的。通常，由于存在極性官能團，溫度敏感性單體單元因此在性質(zhì)上是親水的。可以用于本發(fā)明的溫度敏感性單體單元的實例包含衍生自下列單體的單體單元，例如取代的丙烯酰胺、丙烯酸酯、吡咯烷酮、哌啶和纖維素。適合的溫度敏感性單體單元的實例包括但不限于那些衍生自例如N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、N-丙烯酸羥乙酯、N-丙烯酰吡咯烷酮(APy)、N-丙烯酰哌啶、N-丙烯酰哌啶(N-acroylpiperadine)、羥甲基纖維素、N-叔丁基丙烯酰胺、N-哌啶基-甲基丙烯酰胺的單體單元。目前用作本發(fā)明的溫度敏感性單體單元的優(yōu)選單體是NIPAAm。引入NIPAAm單體單元的聚合物是高度溫度敏感的，并且表現(xiàn)出負(fù)溫度敏感性(即LCST系統(tǒng))，意味著它們在溫度降至低于其LCST時變?yōu)樗苄浴?br> 本發(fā)明共聚物中所需的另一類單體單元是親水單元。一般，親水單元提供改變/移動本發(fā)明共聚物的LCST的手段。當(dāng)親水單元比溫度敏感性親水單元相對更親水時，共聚物的LCST可以增加；相反地，如果存在親水性相對較低的單元或疏水單元，則共聚物的LCST可以降低。適合本發(fā)明的親水單體單元包括任何適合的可共聚單體，其可以具有一個或多個極性官能團，例如伯、仲或叔氨基、酰胺基、硫氫基、羧基、羰基或羥基。與其中還可以存在極性官能團并因而還可以在性質(zhì)上親水的溫度敏感性單體單元相反，本發(fā)明所要求的親水單體單元不一定是溫度敏感性的。
在特定實施方案中，親水單體單元比溫度敏感性親水單元更親水。這用以增加所得共聚物的LCST。這些實施方案中存在的親水單體單元可以衍生自，但不限于下列單體丙烯酸、丙烯酰胺、丙烯酸酯、吡咯烷酮、乙二醇及其衍生物。在具體實施方案中，親水單體單元可以衍生自丙烯酰胺和N-取代的丙烯酰胺衍生物單體，其包括但不限于丙烯酰胺(AAm)、N，N’-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)和N-(羥甲基)丙烯酰胺。在本發(fā)明共聚物中存在DMAAm的優(yōu)選實施方案中，增強了熱敏性，從而使“開-關(guān)”藥物釋放能夠響應(yīng)更小的體溫變化。另外，由于本發(fā)明共聚物中存在NIPAAm和DMAAm，因此本發(fā)明共聚物的LCST升高(至稍微高于37℃)。通常期望在生理條件下使用LCST稍微高于體溫的聚合物。認(rèn)為對LCST不需要上限，只要環(huán)境pH從正常生理pH(典型為7.4)至7.2和更小的變化能夠使LCST從高于正常體溫的值變?yōu)榈陀谡ｓw溫的值即可。
本發(fā)明共聚物中所需的第三類單體單元是疏水單元，其衍生自可共聚的不飽和脂肪酸并且包含至少一個pH敏感性部分。本發(fā)明可以使用含有至少一個pH敏感性官能團的任何適合的不飽和脂肪酸。適合的不飽和脂肪酸包括所有天然和人工修飾/合成的脂肪酸和所有具有1、2、3、4、5、6、7、8個或更多碳-碳雙鍵和/或三鍵的單不飽和與多不飽和脂肪酸，以及其順式-和反式異構(gòu)體。脂肪酸的不飽和部分，即碳-碳雙鍵可以存在于脂肪酸主碳鏈的任何位置處。
不飽和脂肪酸的碳?xì)滏湗?gòu)成共聚物的主要疏水部分。疏水部分對賦予本發(fā)明共聚物以疏水特性起作用。需要疏水部分來形成核-殼結(jié)構(gòu)并且使共聚物與其它疏水材料例如抗癌藥物分子相互反應(yīng)。適合的脂肪酸的碳?xì)滏溈梢允峭ǔＴ谔烊恢舅嶂邪l(fā)現(xiàn)的直的、無分支的烷基鏈(包括支化的烷基鏈)。碳?xì)滏溸€可以是環(huán)狀或支化的烷基鏈，任選取代有官能團例如羧酸、胺或羥基。對官能團的位置沒有限制。其中，羧酸基團為共聚物提供pH敏感性以及結(jié)合適當(dāng)配體的能力。脂肪酸中存在的任何其它pH敏感性官能團也可以起到這些功能。
在一個實施方案中，本發(fā)明共聚物含有下列結(jié)構(gòu)式(I)
上式中限定的A、B和C是指分別隨機共聚的單體單元，也就是溫度敏感性單元、親水單元和疏水單元或其聚合物嵌段。X表示羧酸官能團，其直接與脂肪酸的疏水片段結(jié)合。
在另一個實施方案中，不飽和脂肪酸包含5-50個(包括端點)或更多主鏈碳原子。在這個實施方案中，脂肪酸可以包含單個碳-碳雙鍵，意味著它是單不飽和脂肪酸。衍生疏水單體單元的具體單體包括例如戊烯酸、己烯酸、庚烯酸、辛烯酸、壬烯酸、癸烯酸、十一碳烯酸和十二碳烯酸。脂肪酸中碳-碳雙鍵的位置沒有特殊限制。
目前優(yōu)選的單不飽和脂肪酸包括，但不限于下列脂肪酸，選自(Z)-9-十四碳烯酸、(E)-9-十六碳烯酸、(Z)-9-十六碳烯酸、(E)-9-十八碳烯酸、(Z)-9-十八碳烯酸、(Z)-11-十八碳烯酸、(Z)-11-二十碳烯酸、(Z)-13-二十二烯酸和(Z)-15-二十四碳烯酸。
在一個實施方案中，單不飽和脂肪酸是ω-1脂肪酸，意味著雙鍵存在于與羧酸官能團位置相反的脂肪酸末端的第一和第二碳原子之間。使用ω-1脂肪酸的優(yōu)點是，它使得脂肪酸能夠容易與所需的溫度敏感性單體單元和親水單體單元共聚，這是因為碳-碳雙鍵空間上不受巨大烷基鏈的阻礙。目前優(yōu)選的ω-1脂肪酸選自4-戊烯酸、7-辛烯酸、10-十一碳烯酸、15-十六碳烯酸和19-二十碳烯酸。
在另一個實施方案中，脂肪酸包含至少兩個碳-碳雙鍵，意味著脂肪酸是多不飽和的。合適的多不飽和脂肪酸包含ω-3、ω-6和ω-9脂肪酸以及其它類型的脂肪酸?？捎糜诒景l(fā)明的多不飽和脂肪酸的具體實例包括(E，E)-9，12-十八碳二烯酸、(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸、(E，E)-9，11-十八碳二烯酸、(Z，Z，Z)-9，12，15-十八碳三烯酸、(Z，Z，Z)-6，9，12-十八碳三烯酸、(Z，Z，Z，Z)-6，9，12，15-十八碳四烯酸、(Z，Z)-11，14-二十碳二烯酸、(Z，Z，Z)-5，8，11-二十碳三烯酸、(Z，Z，Z)-11，14，17-二十碳三烯酸、(Z，Z，Z)-8，11，14-二十碳三烯酸、(Z，Z，Z，Z)-8，11，14，17-二十碳四烯酸、(Z，Z，Z，Z)-5，8，11，14-二十碳四烯酸、(Z，Z，Z，Z，Z)-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸、(Z，Z)-13，16-二十二碳二烯酸、(Z，Z，Z)-13，16，19-二十二碳三烯酸、(Z，Z，Z，Z)-7，10，13，16-二十二碳四烯酸、(Z，Z，Z，Z，Z)-4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸、(Z，Z，Z，Z，Z)-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸、(Z，Z，Z，Z，Z，Z)-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸和(Z，Z，Z，Z，Z，Z)-6，9，12，15，18，21-二十四碳六烯酸。
本發(fā)明的共聚物可以僅包含上述3類單體單元，或者可以另外包含其它類型的單體單元。例如，還可以使用兩種或多種溫度敏感性單體單元，例如NIPAAm和N-叔丁基丙烯酰胺，或NIPAAm和N-哌啶基-甲基丙烯酰胺。同樣可以使用兩種或多種親水單體單元，例如DMAAm和AAm，或DMAAm和APy。還可以將其它類型的單體單元引入共聚物主鏈來調(diào)節(jié)共聚物的物理化學(xué)特性，或?qū)牍倌軋F或間隔物以進一步結(jié)合配體，這些單體單元包括例如N-(羥甲基)丙烯酰胺或雜二官能PEG。
本發(fā)明共聚物可以是無規(guī)共聚物，其中三類主要單體單元，即溫度敏感性單體單元、親水單體單元和疏水單體單元隨機分布在共聚物中。還有可能是可以將共聚物合成為嵌段共聚物例如雙嵌段或三嵌段的嵌段共聚物，以及嵌段-接枝共聚物。在一個實施方案中，將溫度敏感性單體和親水單體共聚形成一個聚合物嵌段，并且將疏水單體共聚形成另一個聚合物嵌段，從而形成雙嵌段共聚物。
在一個實施方案中，所述共聚物還包含至少一個端基。所述端基包含至少一個部分，其選自末端部分、配體、藥物分子、標(biāo)記物、放射免疫偶聯(lián)物、修飾共聚物的物理-化學(xué)特性的部分和間隔物(連接物)。
在具體的實施方案中，本發(fā)明的聚合物包含端基，所述端基由具有根據(jù)式(II)結(jié)構(gòu)的末端部分組成
其中Y是末端部分。
在這個實施方案中，端基與共聚物的碳主鏈(即，連接單體單元的碳鏈)中的末端碳原子連接。典型地，可以通過將包含期望的末端結(jié)構(gòu)的鏈轉(zhuǎn)移劑加入反應(yīng)單體的混合物中而將末端部分導(dǎo)入共聚物，或可以通過活性聚合方法產(chǎn)生末端部分。鏈轉(zhuǎn)移劑可以通過向增長鏈末端的活性種提供‘猝滅’原子來停止增長聚合物鏈的生長。其反過來作為可以攻擊未反應(yīng)單體的自由基留下，并且因此開始新鏈的生長。因此，鏈轉(zhuǎn)移劑可以用于本發(fā)明以提供適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)性官能基團給共聚物，以及得到低分子量聚合物。鏈轉(zhuǎn)移劑的實例包括氯仿、四氯化碳、氨基乙硫醇、烷基硫醇、辛硫醇、癸硫醇、正十二硫醇或叔十二硫醇、巰基丙酸、巰基琥珀酸、巰基乙醇酸、巰基乙醇及其仲醇、鹵代烷、氧化數(shù)小于5的磷酸鹽，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它添加劑/鏈限制劑。可以用于本發(fā)明的鏈轉(zhuǎn)移劑的其它實例包括溶劑、雜質(zhì)或適合的改性劑。
在另外的實施方案中，所述末端部分包含至少一個官能團，其選自羥基、羧基、羰基和氨基官能團。氨基官能團目前是優(yōu)選的，包括伯或仲氨基。氨基可以例如存在于與共聚物的末端連接的烷硫基中，例如2-氨基-乙硫醇或2，2-二氨基-乙硫醇。末端部分中氨基的存在使得可以例如通過與配體結(jié)合來修飾聚合物和靶向基團，所述配體包括但不限于小的靶向分子(例如葉酸、其它維生素和乙酰膽堿等)、蛋白質(zhì)(例如轉(zhuǎn)鐵蛋白和單克隆/多克隆抗體等)、肽(例如TAT)和碳水化合物(例如半乳糖和多糖)，它們可以在期望的細(xì)胞、組織或器官上被特殊受體識別。另外，氨基還可以與藥物或標(biāo)記物(例如在感興趣的生物系統(tǒng)中顯示或識別納米顆粒的熒光探針)或放射免疫偶聯(lián)物或化學(xué)基團來修飾聚合物特性，例如連接疏水片段來增加聚合物的疏水性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，末端部分Y可以適合作為能夠與存在于配體或標(biāo)記物或放射免疫偶聯(lián)物或藥物或其它化學(xué)基團例如蛋白質(zhì)中的官能團反應(yīng)的官能團。例如，當(dāng)一個或多個羧酸官能團存在于選擇的配體中時，具有氨基的末端部分可以用于促進結(jié)合。相反地，包含氨基的生物分子可以連接到具有羧酸官能團的末端部分。
為了對靶向受體的生物識別提供適當(dāng)?shù)墓倌軋F，所述共聚物可以與一個或多個能夠連接共聚物上存在的官能團的配體結(jié)合?？梢允褂玫呐潴w包括但不限于小的靶向分子、蛋白質(zhì)、肽和碳水化合物。
在一個實施方案中，所述端基由末端部分和配體組成。負(fù)載配體的共聚物可以用來有效地靶向體內(nèi)的期望組織或具體細(xì)胞類型或細(xì)胞段。通過本發(fā)明共聚物的pH敏感性來增強共聚物的靶向有效性。
可以用于結(jié)合本發(fā)明共聚物的配體包括但不限于小的靶向分子(例如葉酸、其它維生素和乙酰膽堿等)、蛋白質(zhì)(例如轉(zhuǎn)鐵蛋白和單克隆/多克隆抗體等)、肽(例如TAT)和碳水化合物(例如半乳糖和多糖)?？梢源嬖谟趩我还簿畚锏纳锘钚耘潴w的數(shù)目為1、2、3、4、5或更多。
用于本發(fā)明的生長因子(蛋白質(zhì)和肽)的示例性實例包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、上表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)、轉(zhuǎn)化生長因子-b(TGFs-b)、轉(zhuǎn)化生長因子-a(TGFs-a)、紅血球生成素(Epo)、胰島素樣生長因子-I(IGF-I)、胰島素樣生長因子-II(IGF-II)、干擾素-g(INF-g)、集落刺激因子(CSFs)。期望使用的細(xì)胞因子(蛋白質(zhì))包括淋巴因子以及單核因子，實例包括白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)。如果待治療的疾病是癌癥，則選擇的配體應(yīng)該優(yōu)選被癌細(xì)胞上的特殊受體識別。期望與本發(fā)明共聚物一起使用的特殊類型的癌細(xì)胞受體配體包括葉酸、貝沙羅汀(targretin)、阿利維A酸(alitretinoin)、大腸桿菌毒素、C3切割片段(C3d、C3dg和iC3b)，Epstein-Barr病毒膜gp350/220和CD23可以與本發(fā)明共聚物結(jié)合。還可以使用抗體作為癌細(xì)胞配體，其包括從小鼠、兔、雞、山羊和綿羊得到的單克隆和多克隆免疫球蛋白，以及重組抗體例如Fu片段、scFu片段、Fab片段或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的雙功能抗體。期望使用的細(xì)胞因子包括細(xì)胞因子的TNF家族，其包括腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、腫瘤壞死因子-b(TNF-b)、Fas配體(FasL)和涉及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡配體的TNF(TRAIL)。其它適合的配體包括轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙酰膽堿、生物素標(biāo)記和葉酸。如果需要，可以進行配體或本發(fā)明共聚物的預(yù)先修飾(例如通過引入可以與配體上補充的官能團反應(yīng)的官能團)。
在另一個實施方案中，所述端基選自末端部分、配體、標(biāo)記物、藥物分子、放射免疫偶聯(lián)物或任何其它化學(xué)部分，例如修飾共聚物物理化學(xué)特性的部分。
引入配體、藥物、標(biāo)記物、放射免疫偶聯(lián)物或任何其它化學(xué)部分的共聚物可以含有根據(jù)式(III)的一般結(jié)構(gòu) 末端部分Y可以與配體、標(biāo)記物、藥物、放射免疫偶聯(lián)物或如上式所示Q表示的化學(xué)部分連接。
所述配體、標(biāo)記物、藥物、放射免疫偶聯(lián)物或化學(xué)部分與末端部分非限制性地連接。在其它實施方案中，所述配體、標(biāo)記物、藥物、放射免疫偶聯(lián)物或化學(xué)部分可以與溫度敏感性單元或親水單元上的官能團連接或結(jié)合。作為選擇，所述端基可以與任何一種單體單元連接，例如與親水單元或溫度敏感性單元中的官能團連接，而不是與末端部分Y連接。在這個實施方案中，可以存在或不存在末端部分。下式(IV)和(V)示出這個實施方案 在這個實施方案中，P可以是配體、標(biāo)記物、藥物、放射免疫偶聯(lián)物或化學(xué)部分。
在另一個實施方案中，疏水分子P’，例如藥物分子(例如多柔比星)或修飾共聚物的疏水性基團與X結(jié)合。這樣，所述共聚物可以被安排到核殼結(jié)構(gòu)中，其中疏水分子位于核中(式(VI)) 上式(III)、(IV)、(V)和(VI)中所示的實施方案中，間隔物-s-可以任選地位于配體或標(biāo)記物或放射免疫偶聯(lián)物或藥物或化學(xué)分子與末端部分之間(式III) 或任選地在B和P之間(見式IV) 或任選地在A和P之間(見式V)
或任選地在P’和羧基之間(見式VI) P、P’和Q還可以分別與末端部分(Y)和親水單體單元的官能團、或B和X、或X和Y、或X和A、或Y和A、或A和B、或在一個共聚物中A、B、X和Y中的任何三個結(jié)合，如下式(VII)所示 上式(VII)中的各個間隔物-s-可以相同或不同。
所述間隔物可以含有任何適合的主鏈原子長度或數(shù)目，只要配體或標(biāo)記物或放射免疫偶聯(lián)物在共聚物自組裝成納米顆粒之后自由進入細(xì)胞或組織或器官即可。
在優(yōu)選的實施方案中，使用一個間隔物，所述間隔物包含超過10個主鏈原子。這種間隔物的實例可以例如衍生自聚氧化乙烯化合物，例如聚(乙二醇)和聚(丙二醇)。所述配體或標(biāo)記物或放射免疫偶聯(lián)物可以存在于間隔物分子上的任何位置處。在一個實施方案中，所述配體或標(biāo)記物或放射免疫偶聯(lián)物與位于間隔物分子的末端主鏈原子上的官能團連接。在其它實施方案中，如果存在，所述配體或標(biāo)記物或放射免疫偶聯(lián)物與位于間隔物分子的任何一個側(cè)鏈上的官能團連接。
有利的是，本發(fā)明共聚物可以用作藥物遞送材料，尤其是用于遞送性質(zhì)上疏水的藥物。由于所述共聚物在性質(zhì)上是兩性的，并且由于所述共聚物的水溶性可以通過溫度和/或pH變化來調(diào)節(jié)，因此疏水性藥物可以方便地使用所述共聚物包封在核-殼結(jié)構(gòu)中，通常已知為核-殼納米顆粒。當(dāng)本發(fā)明組合物在低于所述共聚物的LCST的水相中制備時，共聚物和疏水性藥物將自組裝成核-殼排列，其中所述疏水性藥物位于核內(nèi)，在此它與脂肪酸單體單元的疏水片段相互反應(yīng)。溫度敏感性和親水單體單元位于殼內(nèi)，它與溶劑(水)分子或其它極性分子反應(yīng)并且使疏水性藥物在水相中溶解。這樣，疏水性藥物可以溶于水中并且可以在血液流中運輸。由于在疏水片段(即脂肪酸單元)中存在羧酸基，因此親水性藥物、蛋白質(zhì)或肽也可以封裝在納米顆粒的核內(nèi)，通過避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的清除來保護包封的藥物、蛋白質(zhì)和肽不降解并且使它們在體循環(huán)中表現(xiàn)出延長的活性。當(dāng)藥物被包封在核-殼納米顆粒中時，其形成組合物，可以容易通過靜脈內(nèi)、口腔、肌肉內(nèi)、局部或經(jīng)眼睛或吸入而施用于患者。一般來說，對用于形成納米顆粒的共聚物的分子量沒有限制。然而，為了使聚合物能從腎臟排出，優(yōu)選保持共聚物的分子量小于40,000。一些參數(shù)可以影響使用本發(fā)明共聚物形成的納米顆粒的尺寸，包括聚合物濃度、藥物裝載水平和納米顆粒的制作條件。由本文公開的共聚物合成的納米顆粒的尺寸通常可以小于200nm，尤其是對增強的滲透和保持作用(EPR)和在血漿中的長循環(huán)而言。
至少三種單體單元的每一個都可以以任何適合的比率存在于本發(fā)明共聚物中。一般來說，單體單元的比率可以改變以達到期望的LCST和pH特征。所述比率還取決于其它因素，例如存在于共聚物的各個單體單元和pH與溫度敏感性官能團的類型和數(shù)目。存在于共聚物內(nèi)的單體單元的摩爾比主要取決于用于制備共聚物的各個單體單元的摩爾比。
在一個實施方案中，存在于本發(fā)明共聚物中的溫度敏感性單體單元的摩爾量大于親水單體單元的摩爾量，以避免親水單體單元對最終共聚物的溫度敏感性的稀釋作用；反過來，親水單體單元的摩爾量大于共聚物中疏水單體單元的量。在特定的實施方案中，用于制備本發(fā)明共聚物的溫度敏感性單體的進料摩爾量為親水單體進料摩爾量的約2-6倍，并且是疏水單體進料摩爾量的約4-8倍?？梢杂脕硇纬捎杏玫墓簿畚锏倪M料摩爾比的實例為溫度敏感性單體的摩爾比為1-4；親水單體的摩爾比為0.5-1.5；疏水單體的摩爾比為0.01-0.75。在尤其適合的實施方案中，根據(jù)這個范圍的進料摩爾比使用的各個單體是N-異丙基丙烯酰胺、N，N’-二甲基丙烯酰胺和10-十一碳烯酸。
在一個優(yōu)選的實施方案中，在pH小于7或優(yōu)選小于7.2時，核-殼納米顆粒的LCST小于37℃。在另一個實施方案中，核-殼納米顆粒的低臨界溶解溫度在正常生理條件(pH 7.4)下高于37℃。注意到，可以通過改變單體單元的百分比或用來形成共聚物的親水單體單元的性質(zhì)來控制所述共聚物的LCST升高或降低。在目前優(yōu)選的共聚物中，核-殼納米顆粒在生理pH下高于正常體溫，即37℃，并且在酸性環(huán)境中低于正常體溫。相反，pH依賴性的LCST和相變特征通過使用本發(fā)明共聚物形成的納米顆粒表現(xiàn)出來。例如，在一個具體試驗中，核-殼納米顆粒在水溶液中由3.75∶1.25∶0.5摩爾比的N-異丙基丙烯酰胺、N，N’-二甲基丙烯酰胺和10-十一碳烯酸的共聚物自組裝，在這個具體組合物中形成的核-殼納米顆粒的LCST在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7.4)中為38.5℃，在微酸環(huán)境(例如小于pH6.6)中明顯降低(35.5℃)。
期望用于本發(fā)明的藥物包括但不限于抗癌藥物、抗炎藥物、治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物和免疫抑制劑等。例如，多柔比星、阿那曲唑、依西美坦、環(huán)磷酰胺、表柔比星、托瑞米芬、來曲唑、曲妥珠單抗、甲地孕酮、他莫昔芬、紫杉醇、多西他賽、卡培他濱、醋酸戈熱瑞林、環(huán)孢菌素、順鉑、茚甲新、倍他米松和強力霉素。
為了有效地遞送藥物，對藥物載體有利的是促進損傷靶向和細(xì)胞內(nèi)進入。特定條件下藥物載體的靶向和隨后的內(nèi)在化可以通過將藥物載體與正常胞吞配體結(jié)合，利用天然胞吞途徑來實現(xiàn)。使用這種策略，本發(fā)明共聚物可以引入各種配體，例如單克隆抗體、生長因子或細(xì)胞因子，它們可以用來促進將載體攝取到靶向細(xì)胞。為了避免擴散通過生物障礙物例如靶向細(xì)胞的細(xì)胞壁的困難以及免疫原性，目前期望用于本發(fā)明的是小的和非抗原配體。
在一個實施方案中，使用葉酸作為配體。葉酸(MW＝441Da)是低分子量和非抗原配體，適合作為腫瘤細(xì)胞的靶向信號。葉酸是一種維生素，其受體經(jīng)常表達在人類癌細(xì)胞的表面上。另外，其顯示出對它的細(xì)胞表面受體(Kd～10-10M)的非常高的親和力并且可以移動到細(xì)胞質(zhì)中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)葉酸按照質(zhì)膜微囊調(diào)節(jié)的胞吞作用，而不是在溶酶體中結(jié)束，此時其含量快速下降。因此，通過使用葉酸作為本文公開的使用共聚物的藥物組合物中的配體，可以將藥物遞送到期望的細(xì)胞內(nèi)位點，避開降解酶。還已知的是，通過質(zhì)膜微囊途徑可達到的核內(nèi)體也是酸性的。由于它們的酸度，核內(nèi)體可以改變納米顆粒的LCST(從高于體溫的溫度到低于體溫的溫度)，分解核內(nèi)體膜。所以，可以實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)藥物到細(xì)胞質(zhì)的遞送。
應(yīng)該注意到，本發(fā)明指定的組合物不限于治療藥物通過與共聚物中疏水部分的疏水反應(yīng)而被裝載至納米顆粒的疏水核內(nèi)的核-殼結(jié)構(gòu)納米顆粒。可以通過藥物分子與位于共聚物的任意部分上的合適官能團反應(yīng)，例如通過脂肪酸的羧基與藥物分子的氨基或羥基反應(yīng)，從而將治療藥物的分子與共聚物共價結(jié)合。藥物分子與共聚物結(jié)合的組合物可以采取核-殼結(jié)構(gòu)或膠束結(jié)構(gòu)或任何其它適合促進藥物遞送的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。藥物與本發(fā)明共聚物的結(jié)合提供了遞送藥物到靶向器官/細(xì)胞位置的作為選擇但類似的有效方式。
在另一個實施方案中，其中多柔比星用作本發(fā)明組合物的治療藥物，多柔比星通過碳化二亞胺化學(xué)與共聚物結(jié)合。多柔比星的胺官能團與本發(fā)明共聚物的羧基官能團結(jié)合，如圖23和24所示。
為了更全面地說明本發(fā)明，提供下列實施例，但其不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1合成聚(N-異丙基丙烯酰胺-co-N，N-二甲基丙烯酰胺-co-10-十一碳烯酸)[P(NIPAAm-co-DMAAm-co-UA)]A)試驗部分i)材料除了另有說明外，所有試劑和溶劑都是商品級的，并以收到的形式使用。N-異丙基丙烯酰胺、N，N’-二甲基丙烯酰胺和10-十一碳烯酸(98％)購自Aldrich，并且分別通過結(jié)晶(正己烷)和減壓蒸餾純化。鏈轉(zhuǎn)移劑(CTA)、2-氨基乙硫醇鹽酸(AET.HCI)購自Sigma、Aldrich。三硝基苯磺酸(TNBS)1M水溶液購自Fluka。鹽酸多柔比星由SunPharmaceuticals，India友好提供。在5mg/mL PBS(pH7.4)溶液中使用3-[4，5-二甲基噻唑基-21-2，5-聯(lián)苯四唑溴(MTT，Duchefa)來定量細(xì)胞。用0.22μm過濾器來過濾溶液除去藍色甲臜(formazan)結(jié)晶。ii)合成使用氧化還原對過硫酸胺(APS)和2-氨基乙硫醇鹽酸(AET.HCl)，通過自由基共聚合來合成具有各種組成的P(NIPAAm-co-DMAAm-co-UA)聚合物(圖1)[Bokias et al. Macromol.Chem.Phys.199(1998)1387-1392]。下面簡要說明聚合過程。將N-異丙基丙烯酰胺(3.965g，34.99mmol)和N，N’-二甲基丙烯酰胺(1.48g，14.99mmol)溶解在10mL超純水中。通過與5mL 4％的氫氧化鈉溶液反應(yīng)將十一碳烯酸(0.921g，5.0mmol)轉(zhuǎn)化為鈉鹽，然后將澄清的鈉鹽溶液加入N-異丙基丙烯酰胺和N，N’-二甲基丙烯酰胺溶液中。用純化的氮氣吹掃混合物15分鐘。將APS(0.254g，4.0mol％的單體進料)和AET.HCl(0.244g，2.16mmol，4.0mol％的單體進料)溶解在5.0mL超純水中。將溶液緩慢地加入單體溶液中并不停攪拌。所述反應(yīng)在氮氣中于27℃下進行48小時。完成時，通過加入過量的氯化鈉來沉淀粗產(chǎn)物并在真空下干燥。將粗產(chǎn)物溶解在乙醇中，使用透過分子量為2000的膜(Spectra/Por)對超純水然后對乙醇滲析。蒸發(fā)乙醇之后收集純化產(chǎn)物。
通過1H NMR(Bruker AVANCE 400)和傅立葉變換紅外(PerkinElmer Spectrum 2000，KBr)分光光度法表征聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過凝膠滲透色譜法(GPC、水、聚苯乙烯標(biāo)樣)在THF(洗脫速率1ml/min)中于25℃下確定聚合物的分子量。使用升降溫速度為3℃/分鐘的TA2920調(diào)制DSC設(shè)備(CT，USA)進行差示掃描量熱(DSC)試驗。使用TGA 7(Perkin Elmer，USA)進行熱失重分析。
iii)酸堿滴定和氨基測定進行酸堿滴定來估計羧酸基和共聚物的pKa。簡要地，將100mg共聚物溶解在10mL超純水中并且用0.01 N NaOH滴定，使用酚酞作為指示劑。通過這種滴定方法在加入堿的過程中不斷測量pH還可以測定聚合物的表觀分配系數(shù)pKa。從pH-堿體積的曲線中，以當(dāng)量點處堿的體積一半時的pH來計算pKa。通過分光光度測定來估計聚合物中的游離胺基。將已知量的聚合物溶解在2.0mL含0.01 M TNBS的碳酸氫鈉水溶液(2.0w/v％)中。在40℃下保持溶液2小時，然后冷卻并稀釋到特定體積。通過使用UV-VIS分光光度計(UV-2501PC，Shimadzu)在345nm以L-丙胺酸作為標(biāo)準(zhǔn)，測定樣品中用TNBS得到的胺官能團的量。
iv)透射率測量通過監(jiān)控作為溫度函數(shù)的光透射率變化來測定不同pH值的緩沖液中聚合物的LCST。在緩沖液例如中性的鄰苯二甲酸鹽緩沖液(pH5.0)、PBS(pH6.0、6.6和7.4)以及pH9.0和10.0的堿性硼酸鹽緩沖液中制備樣品溶液(0.5wt％)。所有緩沖液使用154mM的離子強度制備。在500nm處用UV-VIS分光光度計測量聚合物溶液的光透射率，使用溫度控制儀(TCC-240A，Shimadzu)控制樣品細(xì)胞溫度。加熱速率設(shè)定為0.1℃/分鐘。在顯示光透射率為50％的溫度下測定聚合物溶液的LCST值。還在10(w/v)％牛血清蛋白(BSA作為模型蛋白質(zhì))的存在下研究蛋白質(zhì)對LCST的影響。
v)熒光測量通過熒光光譜使用芘作為探針測定PBS(pH7.4)中聚合物的CMC值。將等分的芘溶液(1.54×10-5M的丙酮溶液，400μl)加入10mL容量瓶中，然后蒸發(fā)丙酮。在PBS中制備濃度為1.0×10-5-1.0g/L的聚合物溶液。然后將10mL聚合物水溶液加入含有芘殘基的容量瓶中。應(yīng)該注意到，所有樣品溶液包含6.16×10-7M相同濃度的過量芘。將溶液在室溫(20℃)下平衡24小時。然后在室溫下在LS50B閃光光譜儀(Pekin Elmer，USA)上記錄聚合物溶液的熒光光譜。用340nm的激發(fā)波長記錄350-500nm的發(fā)射光譜。激發(fā)和發(fā)射帶寬都設(shè)定為5nm。從芘發(fā)射光譜，分析作為聚合物濃度函數(shù)的第三帶(391nm，I3)與第一帶(371nm，I1)的強度(峰高)比率(I3/I1)。CMC值取自曲線變形的切點與通過低濃度點的水平切線的交叉點。
vi)制備空白的和裝載藥物的核-殼納米顆粒制備空白核-殼納米顆粒來研究pH和溫度對納米顆粒的尺寸的影響。將聚合物溶解在濃度為0.5(w/v)％的二甲基乙酰胺中，然后在室溫下使用透過分子量為2000的膜(Spectra/Por)分別對0.02wt％HCl和0.02wt％NaOH滲析24小時。在用0.45μm注射過濾器過濾后將得到的納米顆粒溶液凍干，并且在進一步分析之前儲存在4.0℃下。將DOX裝載到核-殼納米顆粒中，使用F.Kohori et al.[supra]報道的類似方案。簡要地，用3mL DMAc中的2摩爾過量三乙胺來中和7.5mg DOX，然后攪拌溶液至藥物溶解。然后將15mg聚合物溶解在溶液中。將混合物對500mL去離子水滲析48小時。過濾并且凍干裝載DOX的納米顆粒。為了測定DOX的裝載水平，將已知量的裝載DOX的納米顆粒溶解在1mL甲醇中然后用PBS稀釋。使用UV-VIS分光光度計在485nm估計DOX濃度?；赑BS(pH7.4)的DOX得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算藥物裝載。
vii)動態(tài)光散射(DLS)分析使用配備有He-Ne激光束(670nm)的ZetaPals(Brookhaveninstruments corporations，CA，USA)分析不同pH下制造的核-殼納米顆粒的尺寸。每個測量重復(fù)5次，并找到良好的一致性。從5次測量中得到平均值。還在各種溫度下測量納米顆粒的尺寸來研究納米顆粒的相可逆性。通過測量在含有10(w/v)％牛血清蛋白(BSA)的PBS(pH7.4)中納米顆粒的尺寸來監(jiān)控重新分散的凍干納米顆粒的穩(wěn)定性。
viii)透射電子顯微鏡(TEM)檢測通過TEM分析核-殼納米顆粒的形態(tài)。將新鮮制備的包含0.01(w/v)％磷鎢酸的納米顆粒溶液的液滴放置在涂布聚合物膜的銅網(wǎng)上，并且在室溫下空氣干燥。在JEM-2010顯微鏡上用200keV的電子動能進行TEM觀察。
ix)細(xì)胞毒性研究在stock濃度下制備聚合物溶液。這些溶液用0.22μm注射過濾器滅菌并且用PBS(pH7.4)和生長培養(yǎng)基稀釋得到最終濃度為10、100、300和400μgmL-1的聚合物。使用聚(L-賴氨酸)和濃度為33.3μgmL-1的PEG(Mw 8,000)分別作為陽性和陰性對照物。使用PBS(pH7.4)作為空白樣品。
將L929小鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)在補充的Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium(DMEM，10％牛胎血清，1％L-谷氨酸酯，1％青霉素-鏈霉素)(GibcoBRL)中，并在37℃，5％CO2下培養(yǎng)。將細(xì)胞以每孔10,000個細(xì)胞接種到96孔板上。然后將板放回培養(yǎng)箱并且使細(xì)胞生長至融合。在開始檢驗的早上，用150μl預(yù)先制備的生長培養(yǎng)基-樣品混合物替換孔中的培養(yǎng)基。然后將板放回培養(yǎng)箱并且保持在37℃，5％CO2下24、48和72小時。對于暴露周期，每天早上用新鮮的等分溶液替換各個孔中的混合物。每個板每個樣品測量八次。各個暴露周期使用三個板，每個樣品重復(fù)一共24次。
在指定的暴露周期之后使用新鮮的生長培養(yǎng)基和20μL等分的MTT溶液置換各個孔中的混合物。然后將板放回培養(yǎng)箱并且保持在37℃，5％CO2下再3小時。然后除去各個孔中的生長培養(yǎng)基和過量的MTT。然后向各個孔中加入150μL DMSO來溶解紫色甲臜結(jié)晶。從各個孔中取出100μL等分溶液然后轉(zhuǎn)移到新的96孔板上。隨后將新的板在550nm和690nm下化驗。甲臜結(jié)晶的吸光度讀數(shù)取自690nm下的讀數(shù)減去550nm下的讀數(shù)。結(jié)果表示為空白的吸光度的百分比，其包含加入生長培養(yǎng)基的比較體積的PBS。
x)體外藥物釋放研究在pH6.0、6.6和7.4下研究納米顆粒的DOX釋放。將特定量的裝載DOX的凍干納米顆粒分散在200μl的各個緩沖液中并且在放到透過分子量為2000的滲析膜(Spectra/Por)之前穩(wěn)定30分鐘。然后將滲析袋在37℃下浸入pH6.0、6.6和7.4的25mL PBS中。以特定的時間間隔取出樣品，使用本實施例的A段(vi)中所述的UV-VIS分光光度計分析藥物濃度。
B)結(jié)果和討論
i)聚合物合成與表征表1給出了所述共聚物的合成和表征的總結(jié)。在這些反應(yīng)中，NIPAAm/DMAAm的進料摩爾比改變，但是10-十一碳烯酸的含量固定。在0.2mol％和0.4m0l％的單體進料下使用CTA。通過硫醇自由基引發(fā)聚合，硫醇自由基根據(jù)下式由AET.HCl與過硫酸鹽的反應(yīng)產(chǎn)生2RSH+S2O8-2→2RS-+2HSO-4其中R代表氨乙基。此外已知硫醇基是有效的鏈轉(zhuǎn)移劑[Greeg et al.，J.Am.Chem.Soc.70(1948)3740-3743]。因此在這種情況下，通過AET.HCl與單體進料的摩爾比和引發(fā)聚合與鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)的有效性來控制所產(chǎn)生的鏈的長度。這種通過氧化還原系統(tǒng)中硫醇自由基的引發(fā)機制已經(jīng)建立[Khune et al.，Polym.Prpr.22(1981)76-77]。另外，對于用這種引發(fā)對制備的聚合物，各個聚合物分子中的胺官能團的平均數(shù)估計為1.3-1.7。結(jié)果稍微高于估計值，這可能是由于聚合物的平均分子量是計算得來所致。觀察到反應(yīng)介質(zhì)的pH進一步降低，這顯示酸性HSO-4的產(chǎn)生。通過GPC測定的分子量顯示，增加的CTA含量引起分子量的降低，這與G. Bokas et al.[supra]報道的一致。
所有三種聚合物的1H NMR光譜具有類似的圖案。圖2示出CDCl3中聚合物III(NIPAAm∶DMAAm∶UA＝3.50∶1.50∶0.50)的典型1HNMR光譜。鏈轉(zhuǎn)移劑存在下NIPAAm、DMAAm和10-十一碳烯酸的共聚的成功由δ5.4-6.6處乙烯質(zhì)子信號的缺失得以證實。δ1.5-1.8(信號a+a’)和δ2.1-2.4(信號b+b’)處的寬峰分別是NIPAAm和DMAAm基團中-CH2-和-CH-基團的質(zhì)子的結(jié)果。還觀察到來自異丙基(分別為δ4.0處-CHMe2和δ1.15處-CHMe2，信號d和e)和δ2.9(信號f)處-NMe2基團的其它質(zhì)子信號，它們的化學(xué)位移類似于單體的化學(xué)位移。由信號e和信號f的融合率估計m/n比率，其近似等于兩種單體的進料比率。這意味著，兩種單體在聚合反應(yīng)中具有類似的反應(yīng)性。圖3示出聚合物III的FT-IR譜。其在約1647cm-1(vc＝0)和1548cm-1(vc-N)處顯示來自NIPAAm和DMAAm片段的強吸收。10-十一碳烯酸片段中vc＝0的吸收出現(xiàn)在約1713cm-1。通過酸堿滴定分析(表1)估計UA的含量位44.2mg/g的聚合物II。聚合物II的pKa為約6.8。聚合物在水和常用有機溶劑(CHCl3、CH2Cl2、丙酮和THF等)中都表現(xiàn)出良好的溶解度。
ii)聚合物的LCST和pH與蛋白質(zhì)的影響PNIPAAm在水中表現(xiàn)出限定良好的32℃的LCST?？梢酝ㄟ^導(dǎo)入疏水或親水單體來調(diào)節(jié)LCST。在這個研究中合成的聚合物包含聚(10-十一碳烯酸)作為疏水片段。因此，環(huán)境pH可以通過羧酸基來影響10-十一碳烯酸片段的疏水性，其可以最終影響聚合物的LCST。圖4-6示出各個pH值的緩沖液中濃度為0.5wt％的聚合物的光透射率作為溫度的函數(shù)變化。從DLS分析可知，緩沖液中的聚合物自組裝成濃度為0.5wt％的核-殼納米顆粒。由具有4.00∶1.00∶0.5的NIPAAm/DMAAm/UA比率的聚合物I自組裝的核-殼納米顆粒的LCST在pH6.0、6.6和7.4時分別為32.5、33.0和33.2℃(圖4)。然而，在pH5.0時，LCST戲劇性地降至27.8℃。在聚合物II具有增加長度的親水DMAAm片段(NIPAAm∶DMAAm∶UA＝3.75∶1.25∶0.5)的情況下，與聚合物I相比，在所有pH值下核-殼納米顆粒的LCST均增加(圖5)。pH值對聚合物II納米顆粒的LCST有顯著影響。例如，在pH9.0和7.4時，發(fā)現(xiàn)LCST分別為40.5和38.5℃，高于正常體溫。然而，在pH6.6和5.0時，LCST分別下降至35.5℃和35.2℃，大大低于正常體溫。如果納米顆粒具有良好分離的核-殼結(jié)構(gòu)或核足夠堅硬，則納米顆粒的LCST應(yīng)該不受環(huán)境pH的影響，因為pH敏感性部分在疏水片段中。由這些聚合物制成的核-殼納米顆?？梢运缮⒍逊e。因此，納米顆粒的核可以很好地接近外界環(huán)境。隨著外界環(huán)境pH的增加，10-十一碳烯酸片段中羧酸基團進一步去質(zhì)子化，并且因此降低了10-十一碳烯酸片段的疏水性。這可能引起聚合物的LCST增加，并且因此引起納米顆粒的LCST增加。盡管聚合物I和聚合物II具有類似的羧酸基團含量，但羧酸基團的去質(zhì)子化對聚合物II的pH敏感性的影響明顯大于對聚合物I的影響。這可能是因為聚合物I的分子量更高的緣故?；旌响仉S著分子量的增加而降低，因為跨越LCST的熱動力相分離是由低混合熵引起的[Stile et al.Biomacromolecules 3(2002)591-600；Lessard et al.，Can.J.Chem.79(2001)1870-1874]。這暗示分子量是影響聚合物pH敏感性的重要因素。
親水片段長度的進一步增加導(dǎo)致如圖6所示較高的LCST。在聚合物中，具有3.5∶1.75∶0.5的NIPAAm/DMAAm/UA比率的聚合物III在所有pH條件下提供最高LCST的核-殼納米顆粒，高于正常體溫。例如，聚合物III納米顆粒的LCST在pH11.0、7.4、6.6、6.0和5.5時分別為43.0、43.0、41.0、40.7和39.0℃。聚合物III納米顆粒的LCST還取決于pH。然而，它的溫度敏感性低。這可能由于DMAAm的稀釋作用所致，也就是說，共聚物中的PNIPAAm片段很好的分離并且被高摩爾比的DMAAm片段所稀釋，這可以減少相鄰的NIPAAm的酰胺基之間分子內(nèi)氫鍵。結(jié)果，共聚物的溫度響應(yīng)性低[Liu et al.，J.App.Poly.Sci.90(2003)3563-3568；Katsumoto et al.，J.Phys.Chem.A.106(2002)3429-3435]。
使用聚合物II研究蛋白質(zhì)對LCST的影響。如圖7所示，10wt％BSA的存在不改變核-殼納米顆粒的LCST。
這些結(jié)果表明，聚合物可以設(shè)計成具有不同的LCST值，其在變化的pH環(huán)境下高于或低于正常體溫。由所有三種聚合物自組裝的核-殼納米顆粒事實上表現(xiàn)出pH依賴性的LCST，其可以主要由聚合物的疏水片段中羧酸基團的離子化或去離子化所引起。納米顆粒的LCST受到NIPAAm/DMAAm的摩爾比的很大影響。具體而言，聚合物II納米顆粒的LCST在正常生理環(huán)境(pH7.4)中高于正常體溫，但在微酸環(huán)境中低于正常體溫。這意味著，納米顆粒在生理環(huán)境中可溶且穩(wěn)定，但在酸性環(huán)境中不穩(wěn)定/凝聚?？梢岳眠@種獨特的性質(zhì)使藥物靶向腫瘤組織或環(huán)境特征酸性的細(xì)胞內(nèi)部。
iii)聚合物II的CMCCMC是表征核-殼納米顆粒穩(wěn)定性的重要參數(shù)。大于CMC，則兩性聚合物分子可以自組裝成核-殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒。通過熒光光譜使用芘作為探針研究水中聚合物II納米顆粒的疏水微環(huán)境。監(jiān)控I3/I1的比率作為聚合物濃度的函數(shù)。圖8示出聚合物II的I3/I1圖。當(dāng)芘位于更疏水的環(huán)境中時得到較高的比率[Dong et al. Can.J.Chem.62(1984)2560-2565]。可以利用芘的這種特性來研究核-殼納米顆粒的形成和變形。測定CMC值為約10.0mg/L。注意到，形成核-殼納米顆粒之后I3/I1的變化小。這可能是因為由于羧基的存在和/或UA片段的不充分疏水性導(dǎo)致核松散堆積。
iv)由pH和溫度變化引起的聚合物II納米顆粒的尺寸變化發(fā)現(xiàn)聚合物II納米顆粒的尺寸是pH依賴性的。在0.02wt％HCl溶液中，聚合物II納米顆粒的平均直徑為約319nm，在0.02wt％NaOH溶液中，納米顆粒的尺寸降至240nm。在酸性溶液中形成的明顯較大的納米顆粒尺寸表明，由于低pH時UA的較高疏水性，使得酸性溶液中的納米顆粒包含較高程度的凝聚。另一方面，高pH時去離子化的羧酸基的排斥引起較低程度的凝聚，產(chǎn)生較小尺寸。裝載DOX的納米顆粒的平均尺寸為160-200nm左右，如圖9所示具有窄尺寸分布。從TEM圖(圖10)可見，在固體狀態(tài)下納米顆粒的尺寸為約50-60nm，這可能是由于聚合物的游離親水片段的折疊以及聚合物鏈的脫水所致。同時，觀察到納米顆粒在pH7.4、37℃(低于LCST)時穩(wěn)定并且尺寸為265nm左右。將溶液加熱到40℃(高于LCST)，由于凝聚使得尺寸增加至約988nm。在冷卻時凝聚物重新分散并且尺寸降低到原始水平。在pH6.6時觀察到納米顆粒的類似現(xiàn)象。這些結(jié)果進一步支持以下事實，即核-殼納米顆粒是pH和溫度敏感性的。pH和溫度響應(yīng)是可逆的。
在含有10(w/v)％BSA的PBS(pH7.4)中研究裝載藥物的核-殼納米顆粒的穩(wěn)定性。用BSA試驗7小時之后尺寸稍微增加(從104到164nm)。最初的尺寸增加可能由于凍干納米顆粒的水合作用。水合作用之后，尺寸恢復(fù)到原始水平并在接下來的3小時保持不變。這表明納米顆粒在BSA存在時是穩(wěn)定的。
v)聚合物II的細(xì)胞毒性研究將L929細(xì)胞暴露于濃度為10-400mg/L(ppm)的聚合物中。從圖11可見，與陰性對照相比較，聚合物II樣品沒有表現(xiàn)出任何明顯的細(xì)胞毒性。72小時后，所有聚合物II的樣品表現(xiàn)出比陽性對照小的細(xì)胞毒性。
vi)體外釋放在用于本研究中的制造條件下，DOX的實際裝載水平為約2.7重量％。在模擬腫瘤pH的微酸環(huán)境(pH6.0和6.6)下和生理環(huán)境(PBS，pH7.4)下進行體外藥物釋放研究。圖12示出DOX的釋放曲線。pH7.4、37℃時納米顆粒的藥物釋放明顯緩慢，僅為最初爆發(fā)的約18％。這種最初爆發(fā)可能由于存在于納米顆粒殼內(nèi)的藥物分子所致。然而，在pH6.0和6.6、37℃時藥物釋放相當(dāng)快。在研究的48小時內(nèi)藥物釋放了約70％。另外，觀察到裝載藥物的納米顆粒在pH7.4時很好的分散在緩沖液中，但在pH6.0和6.6時凝聚和沉積在滲析袋的底部。這些結(jié)果表明，所述納米顆粒實際上是pH敏感的，pH從7.4到6.6或6.0的微小變化導(dǎo)致裝載藥物的核-殼納米顆粒的變形和沉淀，由此釋放包封的藥物內(nèi)含物。另外，在pH7.4和6.0時研究DOX從滲析袋的釋放。沒有觀察到pH的顯著影響，其進一步證實了DOX從納米顆粒的pH依賴性釋放主要由于納米顆粒的pH反應(yīng)，而不是由于藥物的溶解性。
C)總結(jié)通過與游離胺末端基團的自由基溶液聚合合成具有各種組成的兩性三元共聚物聚(N-異丙基丙烯酰胺-co-N，N’-二甲基丙烯酰胺-xo-10-十一碳烯酸)。由具有3.75∶1.25∶0.5的NIPAAm/DMAAm/UA比率的聚合物自組裝的核-殼納米顆粒在pH7.4時具有大于正常體溫而在微酸環(huán)境中遠(yuǎn)小于正常體溫的LCST。聚合物在最高72小時的周期中不顯示明顯的細(xì)胞毒性。裝載DOX的納米顆粒在pH7.4、37℃時是穩(wěn)定的，并且尺寸為約160-200nm。然而，在pH6.0和6.6時，納米顆粒的結(jié)構(gòu)變形，從而釋放包封的藥物分子。這些特性可以幫助選擇性地積累納米顆粒并且選擇性地在酸性腫瘤組織中釋放藥物。合成的聚合物的又一個優(yōu)點是，具有游離的胺官能團，其可以通過連接用于活性靶向的生物信號來進一步修飾聚合物。
實施例2合成具有葉酸靶向基團的聚(N-異丙基丙烯酰胺-co-N，N-二甲基丙烯酰胺-co-10-十一碳烯酸[P(NIPAAm-co-DMAAm-co-UA)]A)試驗部分i)材料通過實施例1中描述的自由基聚合來合成聚(N-異丙基丙烯酰胺-co-N，N-二甲基丙烯酰胺-co-10-十一碳烯酸)[P(NIPAAm-co-DMAAm-co-UA)，聚合物II]。二水合葉酸、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、二甲亞砜(DMSO)購自Sigma，Aldrich。紫杉醇購自Merck。
ii)葉酸與P(NIPAAm-co-DMAAm-co-UA)的結(jié)合和葉酸與接枝有膽固醇的P(NIPAAm-co-DMAAm-co-UA)的結(jié)合通過下列方法制備葉酸的NHS酯(NHS-葉酸酯)葉酸(5g，溶解在100mL DMSO加2.5mL三乙胺中)與N-羥基丁二酰亞胺(2.6g)在DCC(4.7g)存在下室溫反應(yīng)過夜。通過過濾除去副產(chǎn)物-二環(huán)己基脲(如圖13所示方案2)。為了結(jié)合葉酸和聚合物II(聚-FA)，將DMSO中活化的NHS-葉酸酯加入PBS(pH7.4)緩沖液中的聚合物II中，在室溫下不斷攪拌5小時(圖14，方案3)。通過PBS(pH7.4)緩沖液存在下的滲析純化結(jié)合葉酸的聚合物24小時，隨后使用透過分子量為2000的滲析膜(Spectra/Por)對超純水滲析24小時。將聚合物凍干并且儲存在密封的容器中待用。葉酸還與接枝有膽固醇的聚合物II(聚-CH-FA)結(jié)合。通過將用NHS活化的聚合物II(過程類似于通過使用1∶2∶2摩爾比的聚合物II、NHS和DCC來活化葉酸的過程)與等摩爾濃度的膽固醇在水醇溶液中室溫反應(yīng)48小時(圖15，方案4)來合成接枝有膽固醇的聚合物II(聚-CH)。
通過1H NMR(Bruker AVANCE 400)和傅立葉變換紅外(PerkinElmer Spectrum 2000，KBr)分光光度法測定聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。使用升降溫速度為3℃/分鐘的TA2920調(diào)制DSC設(shè)備(CT，USA)進行差示掃描量熱(DSC)試驗。
iii)制備裝載藥物的聚合物-CH-FA核-殼納米顆粒如下將多柔比星裝載到核-殼納米顆粒中將7.5mg或5.0mgDOX溶解在3mL DMAc或DMF中，同時攪拌。然后將15mg聚合物溶解在溶液中。將混合物對500mL去離子水滲析48小時。為了測定DOX裝載水平，將已知量的裝載DOX的納米顆粒溶解在1mL甲醇中，然后用PBS稀釋。利用UV-VIS估計DOX濃度。通過用紫杉醇-一種水溶性抗癌藥物裝載核-殼納米顆粒進行初步研究。簡要地，將15mg聚合物和2.5mg紫杉醇溶解在3mL DMF中，在超純水存在下滲析聚合物藥物溶液24小時。裝載藥物的納米顆粒通過0.45μm 孔徑大小的盤狀過濾器過濾并且凍干。為了測定紫杉醇的裝載水平，通過將納米顆粒溶解在1mL氯仿中來從聚合物納米顆粒提取紫杉醇，通過加入2mL二乙醚來沉淀聚合物。離心后，收集上清液，干燥并且通過HPLC(水，型號2690，C8 15×4.6cm柱)分析。流動相由20mM醋酸銨、乙腈和甲醇以35∶45∶20的體積比組成。在甲醇中以5-100ppm的濃度制備標(biāo)準(zhǔn)紫杉醇溶液。
B)結(jié)果和討論葉酸成功地與聚合物II和接枝膽固醇的聚合物II結(jié)合。這通過NMR研究證實(圖16和17)。葉酸成功結(jié)合的證據(jù)為，在δ6.6-6.8和δ7.5-7.7處存在來自葉酸分子中芳香族質(zhì)子2、6和3、5質(zhì)子信號(圖14，方案3)。還通過來自膽固醇的5個CH3基團的質(zhì)子信號(δ0.6-1.1)證實膽固醇結(jié)合到聚合物II上。
從實施例1可見，聚合物II在pH7.4時的LCST為38.5℃，其在pH6.6時降至35.5℃。這是由于隨著pH的變化聚合物的質(zhì)子化和去質(zhì)子化所導(dǎo)致，這改變了聚合物的疏水性。pH7.4時，聚-FA和聚合物II的LCST沒有明顯區(qū)別。然而，在pH6.6時LCST增加，并且溫度敏感性降低(圖18)。這可能由于在此pH時葉酸提高了聚合物的親水性。然而，在pH5.0時，聚合物的溶解度低且溶液混濁。所述聚合物的LCST降至36℃且溫度敏感性較高(未示出數(shù)據(jù))。這可能是由于葉酸具有pH5.4左右的pKa，其羧基官能團在pH5.0時質(zhì)子化，增加了聚合物的疏水性。由于LCST在pH5.0時低于正常體溫(核內(nèi)體中)，使得這種特性可以幫助藥物細(xì)胞內(nèi)遞送，這可以幫助破壞核內(nèi)體膜。當(dāng)膽固醇與聚合物II結(jié)合時，如圖19所示，聚合物的LCST在pH7.4時是35.7℃，低于聚合物II的LCST。這是因為接枝膽固醇增加了聚合物的疏水性，降低了LCST。另一方面，聚-CH-FA的LCST在pH7.4和pH6.6時分別是39.0和34.5℃(圖20)。這可能是由于通過導(dǎo)入膽固醇引起的聚合物的疏水性增加恰好被葉酸分子所補充。
將ATCC L929細(xì)胞暴露于濃度為10-100mg/L(ppm)的聚合物。從圖21可見，與陰性對照物[聚(乙二醇)]相比，聚-CH-FA樣品沒有表現(xiàn)出任何顯著的細(xì)胞毒性。然而，所有聚-CH-FA樣品比陽性對照物[聚(L-賴氨酸)]的細(xì)胞毒性小。
使用典型的滲析方法制備聚-CH-FA的空的和裝載藥物的核-殼納米顆粒。選擇鹽酸多柔比星和紫杉醇作為水溶性和水不溶性藥物。研究溶劑對多柔比星的藥物裝載的影響。通過使用DMAc，藥物裝載為4.31重量％時包封效率為12.9％。顆粒的平均直徑為約265nm。然而，在使用DMF作為溶劑的滲析方法情況下，藥物裝載降至0.6％，包封效率為2.4％，平均顆粒尺寸為100-160nm。后一配方中藥物裝載的減少可能是由于DMF的溶解度(12.1 cal/cm3)比DMAc(10.8cal/cm3)高，這可能有助于在包封之前使藥物漏出。降低的顆粒尺寸可能有助于降低藥物裝載。
將紫杉醇裝載到平均直徑為96nm的核-殼納米顆粒中，包封效率為13.0％，藥物裝載為1.9％。紫杉醇是熔點為220℃的結(jié)晶藥物(圖22)。紫杉醇的熔點在包封至納米顆粒中之后消失，指示藥物是分子分布的。
C)總結(jié)合成對腫瘤細(xì)胞具有活性靶向信號(葉酸)的核-殼納米顆粒。所述納米顆粒保持pH敏感特性并且擁有低細(xì)胞毒性。將兩種抗癌藥物裝載到核-殼納米顆粒內(nèi)?？梢酝ㄟ^改變制造條件控制藥物的顆粒尺寸和裝載水平。
實施例3合成結(jié)合多柔比星的聚(N-異丙基丙烯酰胺-co-N，N-二-甲基丙烯酰胺-co-10-十一碳烯酸)[P(NIPAAm-co-DMAAm-co-UA)]
i)多柔比星與共聚物的結(jié)合聚合物II還可以與含有反應(yīng)性官能團的藥物結(jié)合。多柔比星通過碳二亞胺化學(xué)而結(jié)合(圖23)，其中多柔比星的胺官能團與聚合物II的羧基官能團結(jié)合，如圖24所示。簡要地，通過將用NHS活化的聚合物II(過程類似實施例2中描述的葉酸的活化)與多柔比星(濃度為聚合物II的兩倍)在磷酸緩沖液(pH7.4)中室溫反應(yīng)48小時，合成結(jié)合多柔比星的聚合物II(聚-DOX)。在超純水存在下使用2000分子量透過的滲析膜滲析48小時后得到血紅色產(chǎn)物，然后凍干。通過凝膠滲透色譜法確認(rèn)聚合物II的分子量增加，從Mw9,051、Mn6,781至Mw11,129、Mn9,118，如圖25所示停留時間也增加了。此外，結(jié)合物的差示掃描量熱顯示，多柔比星202℃的熔點沒有出現(xiàn)轉(zhuǎn)化(如圖26所示)，這暗示藥物是聚合物鏈的一部分。
ii)由結(jié)合多柔比星的聚合物II制備膠束在藥物結(jié)合到聚合物鏈上之后，觀察到聚合物在水中相對不可溶。嘗試使用這種聚合物通過滲析和溶劑蒸發(fā)方法制備核-殼納米顆粒(膠束)。發(fā)現(xiàn)由于聚合物更加疏水，因此滲析不是合適的方法，導(dǎo)致聚合物的沉淀或形成800-1000nm的較大顆粒。然而，通過使用溶劑蒸發(fā)方法，能夠產(chǎn)生平均直徑為280nm的膠束。溶劑蒸發(fā)的過程如下將15mg結(jié)合的聚合物溶解在4mL的二甲基乙酰胺和1mL二氯甲烷中，將聚合物溶液在20mL超純水中乳化并且超聲波處理5分鐘。蒸發(fā)溶劑，離心溶液并且測量顆粒尺寸。藥物與膠束的結(jié)合改變了引起聚合物溫度敏感性的pH。觀察到在大于38℃時(大于LCST)顆粒尺寸降低，這可能是由于pH7.4時溫度敏感性片段折疊所致。發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象是可逆的和可再現(xiàn)的(圖27)。
實施例4合成嵌段共聚物聚(N-異丙基丙烯酰胺-co-N，N-二甲基丙烯酰胺)-b-聚(10-十一碳烯酸)[P(NIPAAm-co-DMAAm)-b-PUA]通過分別合成溫度敏感性/親水片段和pH敏感性脂肪酸片段，然后將它們結(jié)合產(chǎn)生如圖28和29(方案5和6)所示嵌段共聚物，來進行聚合物II的嵌段共聚物的合成。簡要地，合成溫度敏感性片段是通過使純化的N-異丙基丙烯酰胺和N，N-二甲基丙烯酰胺以3.75∶1.25的單體比率，在40mL乙醇中利用0.4mol％的鏈轉(zhuǎn)移劑、2-氨基乙硫醇鹽酸(AET.HCl)，在引發(fā)劑偶氮二異丁腈存在下于70℃反應(yīng)24小時。通過將聚合物溶解在氯仿中并且在二乙醚中沉淀來純化聚合物。通過GPC分析聚合物的分子量，發(fā)現(xiàn)Mw為11,221。另一方面，通過使單體的鈉鹽(0.097mol)在過硫酸銨(0.8g)存在下在水中于70℃反應(yīng)24小時來合成聚(10-十一碳烯酸)。在冷乙醇存在下沉淀聚合物。利用NHS在DCC存在下活化聚(10-十一碳烯酸)，所得產(chǎn)物進一步與溫度敏感性嵌段在水中在堿性pH下結(jié)合。聚合物分子量為Mw29,177(圖33)。通過測量LCST分析嵌段共聚物的pH和溫度敏感性。如圖31所示，確認(rèn)嵌段共聚物實際上是pH和溫度敏感性的。在PBS(pH7.4)中，嵌段共聚物的LCST為39.5℃，當(dāng)與聚(10-十一碳烯酸)嵌段時降至38.5℃。pH6.0時，嵌段共聚物表現(xiàn)出36.7℃的LCST。
權(quán)利要求
1.一種包含至少三類單體單元的共聚物，所述三類單體單元包括溫度敏感性單元，親水單元，和包含至少一個pH敏感性部分的疏水單元；其中所述疏水單體單元衍生自可共聚的不飽和脂肪酸。
2.權(quán)利要求1的共聚物，其中所述脂肪酸包含5-50個或更多的主鏈碳原子。
3.權(quán)利要求2的共聚物，其中所述脂肪酸包含一個碳-碳雙鍵(單不飽和)。
4.權(quán)利要求3的共聚物，其中所述脂肪酸選自(E)-9-十八碳烯酸、(Z)-9-十八碳烯酸、(Z)-11-十八碳烯酸、(E)-9-十六碳烯酸、(Z)-9-十六碳烯酸、(Z)-9-十四碳烯酸、(Z)-11-二十碳烯酸、(Z)-13-二十二碳烯酸和(Z)-15-二十四碳烯酸。
5.權(quán)利要求3的共聚物，其中所述脂肪酸是ω-1脂肪酸。
6.權(quán)利要求5的共聚物，其中所述脂肪酸選自4-戊烯酸、7-辛烯酸、10-十一碳烯酸、15-十六碳烯酸和19-二十碳烯酸。
7.權(quán)利要求2的共聚物，其中所述脂肪酸包含至少2個碳-碳雙鍵(多不飽和)。
8.權(quán)利要求7的共聚物，其中所述脂肪酸選自(E，E)-9，12-十八碳二烯酸、(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸、(E，E)-9，11-十八碳二烯酸、(Z，Z，Z)-9，12，15-十八碳三烯酸、(Z，Z，Z)-6，9，12-十八碳三烯酸、(Z，Z，Z，Z)-6，9，12，15-十八碳四烯酸、(Z，Z)-11，14-二十碳二烯酸、(Z，Z，Z)-5，8，11-二十碳三烯酸、(Z，Z，Z)-11，14，17-二十碳三烯酸、(Z，Z，Z)-8，11，14-二十碳三烯酸、(Z，Z，Z，Z)-8，11，14，17-二十碳四烯酸、(Z，Z，Z，Z)-5，8，11，14-二十碳四烯酸、(Z，Z，Z，Z，Z)-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸、(Z，Z)-13，16-二二十二碳二烯酸、(Z，Z，Z)-13，16，19-二十二碳三烯酸、(Z，Z，Z，Z)-7，10，13，16-二十二碳四烯酸、(Z，Z，Z，Z，Z)-4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸、(Z，Z，Z，Z，Z)-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸、(Z，Z，Z，Z，Z，Z)-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸和(Z，Z，Z，Z，Z，Z)-6，9，12，15，18，21-二十四碳六烯酸。
9.權(quán)利要求1的共聚物，其中所述溫度敏感性單體單元衍生自N-丙烯酰哌啶、N-叔丁基丙烯酰胺、N-哌啶基-甲基丙烯酰胺和N-異丙基丙烯酰胺。
10.權(quán)利要求1的共聚物，其中所述親水單體單元衍生自丙烯酸、丙烯酰胺、丙烯酸酯、吡咯烷酮、乙二醇及其取代的衍生物。
11.權(quán)利要求10的共聚物，其中丙烯酰胺選自丙烯酰胺(AAm)、N，N’-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)和N-(羥甲基)丙烯酰胺。
12.權(quán)利要求1的共聚物，還包含含有至少一個部分的端基，所述部分選自末端部分、配體、藥物、標(biāo)記物、放射免疫偶聯(lián)物、化學(xué)部分和間隔物。
13.權(quán)利要求12的共聚物，其中所述末端部分包含選自羥基、羧基和氨基的官能團。
14.權(quán)利要求13的共聚物，其中所述末端部分通過鏈轉(zhuǎn)移劑或基團轉(zhuǎn)移劑導(dǎo)入。
15.權(quán)利要求13的共聚物，其中所述末端部分通過活性聚合方法導(dǎo)入。
16.權(quán)利要求13的共聚物，其中所述末端部分是聚合物的單體單元的一部分。
17.權(quán)利要求14的共聚物，其中所述鏈轉(zhuǎn)移劑選自氯仿、四氯化碳、烷基硫醇、氨基乙硫醇、巰基丙酸、巰基琥珀酸、巰基乙醇酸、巰基乙醇及其仲醇、鹵代烷和氧化數(shù)小于5的磷酸鹽。
18.權(quán)利要求17的共聚物，其中所述烷基硫醇選自辛硫醇、癸硫醇、正十二硫醇或叔十二硫醇。
19.權(quán)利要求12的共聚物，其中所述配體直接連接至末端部分的官能團。
20.權(quán)利要求12的共聚物，其中所述配體通過間隔物連接至末端部分。
21.權(quán)利要求20的共聚物，其中所述間隔物包含超過10個主鏈原子。
22.權(quán)利要求21的共聚物，其中所述配體選自小的靶向分子、蛋白質(zhì)、肽和碳水化合物。
23.權(quán)利要求21的共聚物，其中所述間隔物包含聚(乙二醇)和聚(丙二醇)。
24.權(quán)利要求1的共聚物，其中所述共聚物是無規(guī)共聚物。
25.權(quán)利要求1的共聚物，其中所述共聚物是嵌段共聚物。
26.一種溫度和pH敏感性組合物，包含治療劑，和包含至少三類單體單元的共聚物，所述三類單體單元包括溫度敏感性單元，親水單元，和包含至少一個pH敏感性部分的疏水單元；其中所述疏水單體單元衍生自可共聚的不飽和脂肪酸。
27.權(quán)利要求26的組合物，其中所述治療劑選自抗癌藥物、抗炎藥物和治療神經(jīng)疾病的藥物。
28.權(quán)利要求27的組合物，其中所述抗癌藥物選自多柔比星、阿那曲唑、依西美坦、環(huán)磷酰胺、表柔比星、托瑞米芬、來曲唑、曲妥珠單抗、甲地孕酮、他莫昔芬、紫杉醇、多西他賽、卡培他濱、醋酸戈熱瑞林、羥基脲、紅霉素、環(huán)孢菌素和順鉑。
29.權(quán)利要求26的組合物，其中所述共聚物的分子量小于40,000。
30.權(quán)利要求26的組合物，其中在pH低于7.2時，所述共聚物的低臨界溶解溫度小于37℃。
31.權(quán)利要求26的組合物，其中在pH7.4(正常生理pH)時，所述共聚物的低臨界溶解溫度大于37℃。
32.權(quán)利要求26的組合物，其中所述共聚物中的溫度敏感性單體單元/親水單體單元/包含至少一個pH敏感性部分的疏水單體單元的摩爾比為約3.75∶1.25∶0.5。
33.一種對動物和人提供選擇的治療劑的方法，所述方法包括對所述動物或人施用溫度和pH敏感性組合物，所述組合物包含治療劑，和包含至少三類單體單元的共聚物，所述三類單體單元包含溫度敏感性單元，親水單元，和包含至少一個pH敏感性部分的疏水單元；其中所述疏水單體單元衍生自可共聚的不飽和脂肪酸；其中所述共聚物被安排在至少一個包含疏水核和親水殼的納米顆粒中；并且其中所述治療劑包含在所述疏水核中。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述組合物是口服遞送的。
35.權(quán)利要求33的方法，其中所述組合物是局部遞送的。
36.權(quán)利要求33的方法，其中所述組合物是靜脈內(nèi)遞送的。
37.權(quán)利要求33的方法，其中所述組合物是熱遞送的。
38.權(quán)利要求33的方法，其中所述組合物是腸道外遞送的。
39.權(quán)利要求33的方法，其中所述組合物是通過吸入遞送的。
40.權(quán)利要求33的方法，其中所述組合物是通過眼睛途徑遞送的。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含至少三類單體單元的共聚物，所述三類單體單元包含溫度敏感性單元；親水單元和包含至少一個pH敏感性部分的疏水單元；其中所述疏水單體單元衍生自可共聚的不飽和脂肪酸。
文檔編號C08F293/00GK1984935SQ200580023278
公開日2007年6月20日 申請日期2005年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月10日
發(fā)明者楊義燕, 庫馬列什·索皮馬思 申請人:新加坡科技研究局