用于選擇并產(chǎn)生含有至少兩種不同結(jié)合實體的定制高度選擇性和多特異性靶向?qū)嶓w的方 ...的制作方法
【專利摘要】本文中報道了一種用于產(chǎn)生雙特異性抗體的方法，包括步驟：孵育(i)在20個C末端氨基酸殘基范圍內(nèi)包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO:01)的抗體Fab片段或scFv抗體，(ii)包含全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈和Fc重鏈的單臂抗體，其中全長抗體重鏈和全長抗體輕鏈是形成抗原結(jié)合位點的同族抗體鏈，其中全長抗體重鏈和Fc重鏈通過形成抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個二硫鍵彼此共價連接，并且其中Fc重鏈在其N末端具有寡甘氨酸氨基酸序列，和(iii)分選酶A。
【專利說明】用于選擇并產(chǎn)生含有至少兩種不同結(jié)合實體的定制高度選 擇性和多特異性祀向?qū)嶓w的方法及其用途
[0001] 本文中報道了通過使用轉(zhuǎn)膚酶如分選酶A選擇并產(chǎn)生多特異性實體的方法，其中 可W彼此獨立地選擇特異性，和該種方法用于產(chǎn)生新的定制多特異性抗體的用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 單克隆抗體在當今的醫(yī)學領域中具有巨大治療潛能并且發(fā)揮重要作用。在最近十 年期間，制藥業(yè)中的一個明顯趨勢已經(jīng)是開發(fā)單克隆抗體（mAb)和抗體化-融合多膚（可結(jié) 晶片段-融合多膚）作為跨多樣臨床環(huán)境的治療劑，包括腫瘤學、慢性炎性疾病、移植、傳染 病、也血管醫(yī)學或眼科疾病（Carter, 1?.,化1:腳6 Reviews Immunology 6(2006)343-357; Qian, A. C.和 Carter, 1口.，化1:山"6 Reviews Immunology 10(2010)301-316)。
[0004] 治療性抗體的臨床效率主要依賴于兩種官能性；i)由Fv域介導的祀特異性結(jié)合， 和ii)免疫介導的效應子功能如由抗體化區(qū)介導的ADCC(抗體依賴的細胞介導細胞毒 性）、CDC (補體依賴的細胞毒性）和ADCP (抗體依賴的細胞吞瞻作用）。IgG類別的免疫球 蛋白的化區(qū)包含較鏈區(qū)和兩個恒定結(jié)構(gòu)域（C肥和C冊）?；瘏^(qū)還與新生化化受體相互作 用并且因而決定抗體在體內(nèi)的半壽期。較鏈區(qū)是抗體分子的臂形成Y樣結(jié)構(gòu)的區(qū)域，所述 Y樣結(jié)構(gòu)使得分子中在此處的靈活性成為可能。一種或多種IgG亞類在二硫鍵數(shù)目和較鏈 區(qū)長度方面不同。
[0005] 與抗體化區(qū)相關的效應子功能隨抗體類別和亞類變動并且包括例如抗體通過其 化區(qū)與細胞上特定化受體（FcR)結(jié)合，該觸發(fā)多種生物學反應（參見例如Jiang, X.-R.等 人，Nature Reviews Drug Discovery 10 (2011) 101-110 ；Presta, L. G. , Current Opinion in Immunology 20 (2008)460-470)〇
[0006] 構(gòu)成融合多膚或綴合物的抗體或化區(qū)的較鏈區(qū)參與至少部分的抗體功能如抗原 結(jié)合和Fc區(qū)介導的抗體效應子功能。盡管抗原結(jié)合（尤其二價親合抗體結(jié)合）取決于特定 /天然較鏈區(qū)的靈活性、長度和空間取向，化區(qū)介導的效應子功能依賴于抗體的類別和亞 類。與其他IgG抗體的二價相比，對一些人IgG4抗體觀察到的功能性單價是顯示化區(qū)參與 抗原結(jié)合特性的另一個例子（Salfeld，J.G.，化Uire Biotechnology 12(2007) 1369-1372; Presta,L.G.,Qi;rrent Opinion in Immunology 20(2008)460-470)。
[0007] Levary，D. A.等人報道由分選酶A催化的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)融合（PLOSONE 6(2011)) "Madej，M. P.等人報道了將抗表皮生長因子受體抗體工程化成單鏈樣式并通過分 選酶A介導的蛋白質(zhì)連接標記炬iotechnol.Bioeng. 109(2012) 1461-1470)。Ta，H.T.等人 報道了酶促單鏈抗體加標簽過程作為也血管疾病中祀向的分子成像和細胞歸巢的通用方 法（Cir. Res. 109(2011)365-373)。Popp, M.等人報道使用分選酶產(chǎn)生和破壞膚鍵-蛋白 質(zhì)工程（Angew. Chem. Int. Ed.化g. 50(2011)5024-5032)。在 W0 2010/087994 中報道了用于 連接的方法及其用途。
[0008] 發(fā)明簡沐
[0009] 本文中報道了提供定制的高度特異性治療性分子用于治療需要治療的患者中的 疾病如癌癥的方法，其中治療性分子適應于患者的疾病特征和/或患者的基因型/表型。
[0010] 通過考慮患者的帶疾/患病細胞的基因型/表型而產(chǎn)生定制分子，實現(xiàn)該種適應 性。
[0011] 在第一步驟中，確定意在用治療性分子祀向的細胞基因型/表型（例如疾病特異 性細胞表面抗原的存在和數(shù)目/量）。該可W例如使用英光標記的單特異性（治療或診 斷）抗體，通過例如來自如血液和/或活組織檢查材料的患者細胞的細胞成像技術如免疫 組織化學染色（IHC，免疫組織化學）實現(xiàn)。備選地，可W在用標記的治療性或診斷性抗體 染色后使用基于FACS的方法，分析細胞的基因型/表型。還可W使用體內(nèi)成像技術W確定 患者的疾病相關細胞的基因型/表型，所述體內(nèi)成像技術包括光學成像、分子成像、英光成 像、生物發(fā)光成像、MRI、陽T、SPECT、CT和活體內(nèi)顯微術。取決于患者的疾病相關細胞的確 定的基因型/表型，可W /選擇定制的祀向/結(jié)合實體組合并且將它們在治療性分子中組 合。該種治療性分子可W例如是雙特異性抗體。
[0012] 該類定制治療性分子i)將是高度特異的，ii)將具有良好功效，并且iii)與常規(guī) 選擇的治療劑相比，將引起更少副作用。該可W通過W下方式實現(xiàn)：授予治療性分子改進的 祀向作用和/或改進的定制遞送特性，例如對其預期作用位點的治療性有效負載。
[0013] 可W通過與常規(guī)選擇的治療性分子相比祀向治療分子的更高/增加的選擇性和/ 或特異性實現(xiàn)改善治療性分子遞送至其作用位點，如例如癌細胞。治療性分子包含與不同 抗原（例如兩個不同表面標志物）或與相同抗原上的不同表位（例如相同表面標志物上的 兩個不同表位）特異性結(jié)合的至少兩種實體。
[0014] 可W通過兩種祀向?qū)嶓w與其各自祀/表位同時結(jié)合，實現(xiàn)定制治療性分子的增加 的選擇性和/或特異性，即通過親合力效應實現(xiàn)。特別適合的是對其各自祀/表位具有低 親和力至中等親和力的兩種結(jié)合實體的組合。另外，脫祀結(jié)合大幅度減少或可W甚至完全 消除。
[0015] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可W使用分選酶A，利用在第一結(jié)合實體如基于da巧in結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實 體、基于抗運載蛋白（anticalin)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于T細胞受體片段樣scTCR結(jié)構(gòu)域 的結(jié)合實體、基于駱駝VH結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于第十纖連蛋白3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于 生膊蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于巧黏著蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于ICAM結(jié)構(gòu)域的結(jié)合 實體、基于肌聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于GCSF-R結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于細胞因子受 體結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于糖巧酶抑制劑結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于超氧化物歧化酶結(jié)構(gòu)域 的結(jié)合實體或在其C末端氨基酸序列區(qū)域中包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID N0:01，其中 XI可W是任何氨基酸殘基）的抗體片段（Fab或scFv片段）和包含與同族全長輕鏈配對 的全長抗體重鏈的單臂抗體片段（OA-Fc) W及在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m = 2、或3、或 4、或5)的抗體重鏈化區(qū)多膚之間的酶促綴合反應，提供定制雙特異性祀向和結(jié)合分子。
[0016] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)采用如本文中報道的方法，可W定制例如特異性針對細胞（如癌細胞） 表面上存在的兩種表面標志物的雙特異性抗體。由于結(jié)合特異性由起始組分單獨提供，所 W可W單純通過確定細胞上（如細胞癌細胞上）存在的表面標志物并且通過酶促過程綴 合與該些表面標志物或其各自配體特異性結(jié)合的各個抗體片段，定制多特異性祀向和結(jié) 合分子。由于通過分選酶A進行酶促綴合，所W得到的雙特異性抗體W存在氨基酸序列 LPX1TG(SEQ ID N0:01，其中XI可W是任何氨基酸殘基）為特征。
[0017] 如本文中報道的一個方面是用于產(chǎn)生多特異性結(jié)合分子的方法，所述方法包括步 驟；賠育
[001引 扣）在20個0末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨基酸序列1口《口6 669 10^:01，其中乂1 可W是任何氨基酸殘基）的第一結(jié)合實體，
[0019] (ii)包含全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈和抗體重鏈化區(qū)多膚的抗體片段，
[0020] W此全長抗體重鏈和全長抗體輕鏈是同族抗體鏈并且其可變結(jié)構(gòu)域?qū)Γ╒H和化） 形成抗原結(jié)合位點，
[0021] W此全長抗體重鏈和抗體重鏈化區(qū)多膚通過形成抗體較鏈區(qū)的一個或多個二硫 鍵彼此共價連接，并且
[0022] W此抗體重鏈化區(qū)多膚在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m = 2、或3、或4、或5)氨基 酸序列，
[0023] 和
[0024] (iii)分選酶 A
[00巧]并且因而產(chǎn)生多特異性結(jié)合分子。
[0026] 如本文中報道的一個方面是用于產(chǎn)生多特異性結(jié)合分子的方法，所述方法包括W 下步驟
[0027] (i)確定存在于含有細胞的樣品中的細胞表面標記物和i)選擇其至少第一細胞 表面標記物和第二細胞表面標記物，或ii)選擇與多特異性結(jié)合分子的結(jié)合特異性數(shù)目相 對應的其多種細胞表面標記物，
[002引 扣）賠育（a)與第一細胞表面標記物或其配體特異性結(jié)合，并且在20個C末端氨 基酸殘基內(nèi)包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID N0:01，其中XI可W是任何氨基酸殘基）的第 一結(jié)合實體，化）包含全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈和抗體重鏈Fc區(qū)多膚的抗體片段，W此 全長抗體重鏈和全長抗體輕鏈是同族抗體鏈并且其可變結(jié)構(gòu)域?qū)Γ╒H和VL)形成與第二細 胞表面標記物或其配體特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點，W此全長抗體重鏈和抗體重鏈化區(qū) 多膚通過形成抗體較鏈區(qū)的一個或多個二硫鍵彼此共價連接，并且W此抗體重鏈化區(qū)多 膚在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m= 2、或3、或4、或5)氨基酸序列，和（C)分選酶A
[0029] 并且因而產(chǎn)生多特異性結(jié)合分子。
[0030] 如本文中報道的一個方面是從通過W下方式在單個多特異性結(jié)合分子中組裝的 結(jié)合實體集合/文庫中選擇至少兩種結(jié)合實體用作治療劑的方法：賠育（a)與第一表位或 抗原特異性結(jié)合和在20個C末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO:01，其 中XI可W是任何氨基酸殘基）的第一結(jié)合實體，（b)包含全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈和抗 體重鏈化區(qū)多膚的抗體片段，W此全長抗體重鏈和全長抗體輕鏈是同族抗體鏈并且其可 變結(jié)構(gòu)域?qū)Γ╒H和VL)形成與第二表位或抗原特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點，W此全長抗體 重鏈和抗體重鏈化區(qū)多膚通過形成抗體較鏈區(qū)的一個或多個二硫鍵彼此共價連接，并且 W此抗體重鏈化區(qū)多膚在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m = 2、或3、或4、或5)氨基酸序列， 和（C)分選酶A酶。該種活性劑具有改進的祀向/遞送特性。
[0031] 如本文中報道的一個方面是用于產(chǎn)生雙特異性抗體的方法，所述方法包括步驟： 賠育
[0032] (1)在20個0末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨基酸序列1口《口6 669 10^:01，其中乂1 可W是任何氨基酸殘基）的抗體Fab片段或scFv抗體，
[0033] (ii)包含全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈和抗體重鏈化區(qū)多膚的單臂抗體片段，
[0034] W此全長抗體重鏈和全長抗體輕鏈是彼此互補的同族抗體鏈并且其可變結(jié)構(gòu)域 對（VH和VL)形成抗原結(jié)合位點，
[0035] W此全長抗體重鏈和抗體重鏈化區(qū)多膚通過形成抗體較鏈區(qū)的一個或多個二硫 鍵彼此共價連接，并且
[0036] W此抗體重鏈化區(qū)多膚在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m = 2、或3、或4、或5)氨基 酸序列，
[0037] 和
[0038] (iii)分選酶 A
[0039] 并且因而產(chǎn)生雙特異性抗體。
[0040] 如本文中報道的一個方面是用于產(chǎn)生雙特異性抗體的方法，所述方法包括W下步 驟
[0041] (i)確定存在于含有細胞的樣品中的細胞表面標記物并且選擇其至少第一細胞表 面標記物和第二細胞表面標記物，
[0042] (U)賠育（a)在20個C末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO: 01，其中XI可W是任何氨基酸殘基）的抗體F油片段或scFv抗體，W此F油片段或scFv 抗體與第一細胞表面標記物或其配體特異性結(jié)合，（b)包含全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈和 抗體重鏈化區(qū)多膚的單臂抗體片段，W此全長抗體重鏈和全長抗體輕鏈是彼此互補的同 族抗體鏈并且其可變結(jié)構(gòu)域?qū)Γ╒H和VL)形成與第二細胞表面標記物或其配體特異性結(jié)合 的抗原結(jié)合位點，W此全長抗體重鏈和抗體重鏈化區(qū)多膚通過形成抗體較鏈區(qū)的一個或 多個二硫鍵彼此共價連接，并且W此抗體重鏈化區(qū)多膚在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m = 2、或3、或4、或5)氨基酸序列，和（C)分選酶A
[0043] 并且因而產(chǎn)生雙特異性抗體。
[0044] 如本文中報道的一個方面是用于確定多特異性結(jié)合分子的結(jié)合實體的組合的方 法，所述方法包括W下步驟
[0045] (i)確定多種多特異性結(jié)合分子的結(jié)合特異性和/或選擇性和/或親和力和/或 效應子功能和/或體內(nèi)半壽期，W此在多種多特異性結(jié)合分子中包含結(jié)合實體的每種（可 能）的組合，
[0046] 并且
[0047] (ii)選擇具有合適的結(jié)合特異性和/或選擇性和/或親和力和/或效應子功能和 /或體內(nèi)半壽期的多特異性結(jié)合分子并且因而確定抗原結(jié)合位點的組合。
[0048] 如本文中報道的一個方面是用于確定抗原結(jié)合位點的組合的方法，包括W下步驟
[0049] (i)確定通過如下方式制備的多種雙特異性抗體的結(jié)合特異性和/或選擇性和/ 或親和力和/或效應子功能和/或體內(nèi)半壽期：組合（a)第一多種抗體F油片段或scFv抗 體片段的每個成員，W此每個成員在20個C末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO:01，其中XI可W是任何氨基酸殘基），W此F油片段或scFv抗體與第一表位或抗原 特異性結(jié)合，與化）多種包含全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈和抗體重鏈Fc區(qū)多膚的單臂抗 體片段的每個成員，W此全長抗體重鏈和全長抗體輕鏈是彼此互補的同族抗體鏈并且其可 變結(jié)構(gòu)域?qū)Γ╒H和VL)形成與第二表位或抗原特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點，W此全長抗體 重鏈和抗體重鏈化區(qū)多膚通過形成抗體較鏈區(qū)的一個或多個二硫鍵彼此共價連接，并且 W此抗體重鏈化區(qū)多膚在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m = 2、或3、或4、或5)氨基酸序列， 和（C)分選酶A
[0050] 并且
[0051] (ii)選擇具有合適的結(jié)合特異性和/或選擇性和/或親和力和/或效應子功能和 /或體內(nèi)半壽期的雙特異性抗體并且因而確定抗原結(jié)合位點的組合。
[0052] 在一個實施方案中，結(jié)合實體彼此獨立地選自基于darpin結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基 于抗運載蛋白（anticalin)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于T細胞受體片段樣scTCR結(jié)構(gòu)域的結(jié) 合實體、基于駱駝VH結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于第十纖連蛋白3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于生 膊蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于巧黏著蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于ICAM結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實 體、基于肌聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于GCSF-R結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于細胞因子受體 結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于糖巧酶抑制劑結(jié)構(gòu)域的結(jié)合實體、基于超氧化物歧化酶結(jié)構(gòu)域的 結(jié)合實體，或抗體片段如Fab或scFv片段。
[0053] 在全部方面的一個實施方案中，多特異性結(jié)合分子是雙特異性抗體，和/或第一 結(jié)合實體是抗體Fab片段或scFv抗體。
[0054] 在一個實施方案中，組合的特征在于；將抗體F油片段或scFv抗體片段和包含全 長抗體重鏈、全長抗體輕鏈和抗體重鏈化區(qū)多膚的抗體片段與分選酶A賠育。
[00巧]在一個實施方案中，F(xiàn)油片段或scFv抗體片段在20個C末端氨基酸殘基內(nèi)包含 氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID N0:01，其中XI可W是任何氨基酸殘基）。
[0056] 在一個實施方案中，單臂抗體片段的全長抗體重鏈和全長抗體輕鏈是同族抗體鏈 并且其可變結(jié)構(gòu)域?qū)Γ╒H和VL)形成與第二表面標記物特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點，W此 全長抗體重鏈和抗體重鏈化區(qū)多膚通過形成抗體較鏈區(qū)的一個或多個二硫鍵彼此共價連 接，并且抗體重鏈化區(qū)多膚在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m = 2、或3、或4、或5)氨基酸序 列。
[0057] 在全部方面的一個實施方案中，抗體F油片段或scFv抗體在20個C末端氨基酸 殘基內(nèi)包含氨基酸序列G"SLPX1TG(SEQ ID N0:02,其中XI可W是任何氨基酸殘基，n = 1、 2或扣。
[0058] 在全部方面的一個實施方案中，抗體F油片段或scFv抗體在20個C末端氨基酸 殘基內(nèi)包含氨基酸序列GSLPX1TGGSGS(SEQ ID N0:03,其中XI可W是任何氨基酸殘基）。
[0059] 在全部方面的一個實施方案中，抗體F油片段或scFv抗體在20個C末端氨基酸 殘基內(nèi)包含氨基酸序列GGGSLPX1TGGSGS(SEQ ID N0:04,其中XI可W是任何氨基酸殘基）。
[0060] 在全部方面的一個實施方案中，抗體F油片段或scFv抗體在20個C末端氨基酸 殘基內(nèi)包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGSGS(SEQ ID N0:05,其中XI可W是任何氨基酸殘基）， W此X2可W是除G之外的任何氨基酸殘基。
[0061] 在全部方面的一個實施方案中，抗體F油片段或scFv抗體在20個C末端氨基酸 殘基內(nèi)包含氨基酸序列G"SLPX1TGGSGSX3(SEQ ID N0:06,其中XI可W是任何氨基酸殘基， n = 1、2或3)，W此X3是氨基酸序列標簽。
[0062] 在全部方面的一個實施方案中，抗體Fab片段或scFv抗體在20個C末端氨基酸殘 基內(nèi)包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGSGSX3(SEQ ID N0:07,其中XI可W是任何氨基酸殘基）， W此X2可W是除G之外的任何氨基酸殘基，并且W此X3是氨基酸序列標簽。
[0063] 在全部方面的一個實施方案中，抗體重鏈化區(qū)多膚在其N末端包含兩個甘氨酸殘 基。
[0064] 在全部方面的一個實施方案中，單臂抗體片段在其重鏈的N末端包含氨基酸序列 GGCPX4C(SEQ ID N0:08)，W此 X4 是 S 或 P。
[0065] 在全部方面的一個實施方案中，XI是E。
[0066] 如本文中報道的一個方面是通過如本文中報道的方法獲得的多特異性結(jié)合分子。
[0067] -個方面是在其重鏈之一中包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID N0:01，其中XI可W 是任何氨基酸殘基）的多特異性結(jié)合分子。
[0068] 在一個實施方案中，多特異性結(jié)合分子在其重鏈之一中包含氨基酸序列 GnSLPXlTG(SEQ ID N0:02,其中XI可W是任何氨基酸殘基，n = 1、2或3)。
[0069] 在一個實施方案中，多特異性結(jié)合分子在其重鏈之一中包含氨基酸序列 G"SLPX1TGGCPX4C(SEQ ID N0:09,其中XI可W是任何氨基酸殘基，其中X4可W是S或P，n =1、2 或 3)。
[0070] 在一個實施方案中，多特異性結(jié)合分子在其重鏈之一中包含氨基酸序列 X2GSLPX1TGGCPX4C(SEQ ID N0:10,其中XI可W是任何氨基酸殘基，其中X4可W是S或巧， W此X2可W是除G之外的任何氨基酸殘基。
[0071] 如本文中報道的一個方面是通過如本文中報道的方法獲得的雙特異性抗體。
[0072] -個方面是在其重鏈之一中包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID N0:01，其中XI可W 是任何氨基酸殘基）的雙特異性抗體。
[0073] 在一個實施方案中，雙特異性抗體在其重鏈之一中包含氨基酸序列 GnSLPXlTG(SEQ ID N0:02,其中XI可W是任何氨基酸殘基，n = 1、2或3)。
[0074] 在一個實施方案中，雙特異性抗體在其重鏈之一中包含氨基酸序列 G"SLPX1TGGCPX4C(SEQ ID N0:09,其中XI可W是任何氨基酸殘基，其中X4可W是S或P，n =1、2 或 3)。
[0075] 在一個實施方案中，雙特異性抗體在其重鏈之一中包含氨基酸序列 X2GSLPX1TGGCPX4C(SEQ ID側(cè)：10，其中《1可^是任何氨基酸殘基，其中《4可^是8或巧， W此X2可W是除G之外的任何氨基酸殘基。
[0076] 如本文中報道的一個方面是包含如本文中報道的多特異性結(jié)合分子的藥物制劑。
[0077] 如本文中報道的一個方面是如本文中報道的多特異性結(jié)合分子在制造藥物中的 用途。
[0078] 在一個實施方案中，該藥物用于治療癌癥。
[0079] 如本文中報道的一個方面是用于治療患有癌癥的個體的方法，所述方法包括向該 個體施用有效量如本文中報道的多特異性結(jié)合分子。
[0080] 如本文中報道的一個方面是用于摧毀個體中癌細胞的方法，所述方法包括向該個 體施用有效量如本文中報道的多特異性結(jié)合分子。
[0081] 如本文中報道的一個方面是包含如本文中報道的雙特異性抗體的藥物制劑。
[0082] 如本文中報道的一個方面是如本文中報道的雙特異性抗體在制造藥物中的用途。
[0083] 在一個實施方案中，該藥物用于治療癌癥。
[0084] 如本文中報道的一個方面是用于治療患有癌癥的個體的方法，所述方法包括向該 個體施用有效量如本文中報道的雙特異性抗體。
[0085] 如本文中報道的一個方面是用于摧毀個體中癌細胞的方法，所述方法包括向該個 體施用有效量如本文中報道的雙特異性抗體。在如本文中報道的全部方面的一個實施方案 中，化區(qū)是人化區(qū)或其變體。
[0086] 在一個實施方案中，人抗體化區(qū)是人IgGl亞類的，或人IgG2亞類的，或人IgG3 亞類的，或人IgG4亞類的。
[0087] 在一個實施方案中，抗體化區(qū)是人IgGl亞類的或人IgG4亞類的人抗體化區(qū)。
[0088] 在一個實施方案中，人抗體化區(qū)包含至少在W下氨基酸位置228、233、234、235、 236、237、297、318、320、322、329和/或331中一個處天然存在氨基酸殘基向不同殘基的突 變，其中抗體化區(qū)中的殘基根據(jù)Kabat的抓索引編號。
[0089] 在一個實施方案中，人抗體化區(qū)包含在第329位置處天然存在氨基酸殘基的突變 和至少一個氨基酸殘基向不同殘基的至少一個其他突變，所述至少一個氨基酸殘基選自包 含在第228、233、234、235、236、237、297、318、320、322和331位置的氨基酸殘基的組，其中 化區(qū)中的殘基根據(jù)K油at的抓索引編號。與未修飾的（野生型）化區(qū)相比，該些特定氨基 酸殘基的變化導致化區(qū)的效應子功能改變。
[0090] 在一個實施方案中，與包含相應野生型IgG化區(qū)的綴合物相比，人抗體化區(qū)針對 人化Y RIIIA、和/或化Y RIIA和/或化Y RI具有減低的親和力。
[0091] 在一個實施方案中，人抗體化區(qū)中第329位置處的氨基酸殘基用甘氨酸、或精氨 酸、或大到足W摧毀化區(qū)內(nèi)部脯氨酸夾層的氨基酸殘基置換。
[0092] 在一個實施方案中，人抗體化區(qū)中天然存在氨基酸殘基的突變是W下至少一種： S228P、E233P、L234A、L235A、L23祀、N297A、N297D、P329G 和 / 或 P331S。
[0093] 在一個實施方案中，如果抗體化區(qū)屬于人IgGl亞類，則突變是L234A和L235A，或 如果抗體化區(qū)屬于人IgG4亞類，則突變是S228P和L235E。
[0094] 在一個實施方案中，抗體化區(qū)包含突變P329G。
[0095] 在一個實施方案中，抗體化區(qū)在第一重鏈化區(qū)多膚中包含突變T366W并且在第 二重鏈化區(qū)多膚中包含突變T366S、L368A和Y407V，其中根據(jù)K油at的抓索引編號。
[0096] 在一個實施方案中，抗體化區(qū)在第一重鏈化區(qū)多膚中包含突變S354C并且在第 二重鏈化區(qū)多膚中包含突變Y349C。
[0097] 本發(fā)明的連施方式的具體描沐
[0098] I.定父
[0099] 在本說明書和權(quán)利要求中，免疫球蛋白重鏈化區(qū)中殘基的編號是K油at的抓索 弓I編號化abat, E. A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda,MD(1991)，NIH 化blication 91-3242,所述文獻通過引用的方式明確并入本文）。
[0100] 術語"改變"指例如至少包含化區(qū)的化化結(jié)合部分的抗體或融合多膚的親本氨 基酸序列中突變、添加或缺失一個或多個氨基酸殘基W獲得變體抗體或融合多膚。
[0101] 術語"氨基酸突變"指在親本氨基酸序列的氨基酸序列中的修飾。示例性修飾包括 氨基酸置換、插入和/或缺失。在一個實施方案中，氨基酸突變是置換。術語"在某位置的 氨基酸突變"指置換或缺失指定的殘基或相鄰于指定的殘基插入至少一個氨基酸殘基。術 語"相鄰于指定的殘基插入"指在一個至兩個殘基內(nèi)部插入該殘基。插入可W相對于指定 的殘基是N末端或C末端。
[0102] 術語"氨基酸置換"指將預先確定的親本氨基酸序列中的至少一個氨基酸殘基 替換為不同的"替換"氨基酸殘基。該替換殘基或多個殘基可W是"天然存在的氨基酸殘 基"（即由遺傳密碼編碼）并且選自；丙氨酸（Ala);精氨酸（Arg);天冬醜胺（Asn);天冬 氨酸（Asp);半脫氨酸（切S);谷氨醜胺（Gin);谷氨酸（Glu);甘氨酸（Gly);組氨酸化is); 異亮氨酸（lie);亮氨酸（Leu);賴氨酸（Lys);甲硫氨酸（Met);苯丙氨酸（Phe);脯氨酸 (Pro);絲氨酸（Ser);蘇氨酸訂虹）；色氨酸訂巧）；酪氨酸（Tyr);和額氨酸（Val)。在一個 實施方案中，替換殘基不是半脫氨酸。本文的氨基酸置換定義中還涵蓋用一種或多種非天 然存在的氨基酸殘基置換。"非天然存在的氨基酸殘基"指除上文所列的那些天然存在氨基 酸殘基之外，能夠共價結(jié)合多膚鏈中相鄰（一個或多個）氨基酸殘基的殘基。非天然存在 的氨基酸殘基的例子包括正亮氨酸、鳥氨酸、正額氨酸、高絲氨酸、aib和其他氨基酸殘基類 似物，如在Ellman等人，Meth.化zym. 202 (1991) 301-336中描述的那些。為了產(chǎn)生該類非 天然存在的氨基酸殘基，可W使用Noren等人（Science 244(1989) 182)和/或Ellman等 人（上文）的方法。簡而言之，該些方法涉及用非天然存在的氨基酸殘基化學活化激活阻 抑tRNA，隨后體外轉(zhuǎn)錄并翻譯RNA。也可W通過化學地合成膚并隨后使該些膚與重組產(chǎn)生 的多膚如抗體或抗體片段融合，將非天然存在的氨基酸慘入膚中。
[0103] 術語"氨基酸插入"指將至少一個額外的氨基酸殘基慘入預先確定的親本氨基酸 序列中。盡管插入通常將由插入一個或兩個氨基酸殘基組成，但是本申請構(gòu)思更大的"膚插 入"，例如插入約3個至約5個或甚至至多約10個氨基酸殘基。插入的（一個或多個）殘 基可W是如上文定義天然存在或非天然存在的。
[0104] 術語"氨基酸缺失"指在氨基酸序列中的預定位置處移除至少一個氨基酸殘基。
[0105] 在本申請范圍內(nèi)無論何時提到氨基酸改變，它總是人為的氨基酸改變并且不是隨 機氨基酸修飾。
[0106] 術語"氨基酸序列標簽"指通過具有特異性結(jié)合特性的膚鍵彼此連接的氨基酸殘 基的序列。在一個實施方案中，氨基酸序列標簽是親和標簽或純化標簽。在一個實施方案 中、氨基酸序列標簽選自Arg標簽、Hi S標簽、FLAG標簽、3xFlag標簽、Str巧標簽、納米標簽、 SBP標簽、c-myc標簽、S標簽、巧調(diào)蛋白結(jié)合膚、纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域、GST 標簽或MBP標簽。在一個實施方案中，氨基酸序列標簽選自SEQ ID N0:11(RRRRR)、或SEQ ID N0:12(RRRRRR)、或 SEQ ID N0:13(HHHHHH)、或 SEQ ID N0:14(邸HLIHNVHKEFHAHAHNK)、 或 SEQ ID NO: 15 值Y邸孤DK)、或 SEQ ID NO: 16 值Y邸皿GDY邸皿IDY邸孤DK)、或 SEQ ID ^:17(4胖冊口9尸66)、或569 10^:18師5冊9陽1()、或569 10^:19(]\?￥64胖11；4時、或569 ID NO: 20 (MDVEAWLGARVPLVET)、或沈Q ID NO: 21 (MD邸TTGWRGGHVVEGLAGELE化RARLEHHPQG QRE巧、或 SEQ ID N0:22(EQKLISE邸L)、或 SEQ ID N0:23(KETAAAK陽RQHMDS)、或 SEQ ID N 0:24 (KRRWKKNFIAVSAANRF邸ISSSGAL)、或 SEQ ID NO: 25 (纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域）、或 SEQ ID NO: 26 (纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域）、或 SEQ ID NO: 27 (TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYK化QPHTSLA GWEP SNVPALW化曲、或 SEQ ID NO: 28 (GST 標簽）、或 SEQ ID NO: 29 (MBP 標簽）。
[0107] 術語"抗體片段"指包含完整抗體的一部分的非完整抗體的分子，其結(jié)合與完整抗 體結(jié)合的抗原?？贵w片段的例子包括但不限于Fv、F油、F油'、F油' -SH、F(油'）2、雙體抗體、 線性抗體、單鏈抗體分子（例如scFv)、和從抗體片段形成的多特異性抗體。
[010引 抗體片段包括但不限于F油、F油'、F油'-SH、F(油'）2、Fv和scFv片段和下文描述 的其他片段。關于某些抗體片段的綜述，見化dson，P.J.等人，化t. Med. 9 (2003) 129-134。 關于 scFv 片段的綜述，見例如 Plueckthun, A.,引自 Hie Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg 和 Moore (編著），（Springer-Verlag, New York (1994), 第 269-315 頁；還見 WO 93/16185 ;US 5, 571，894 和 US 5,587,458。關于包含救援受體 (salvage rec巧tor)結(jié)合表位殘基和具有增加的體內(nèi)半壽期的F油和F(油'）2片段的討 論，見 US 5,869,046。
[0109] 雙體抗體是具有兩個抗原結(jié)合位點的抗體片段，所述兩個抗原結(jié)合位 點可W是雙價或雙特異性的。見，例如，EP 0404097 ;W0 1993/01161 ;Hudson，P. J.等人，化 t.Med.9(2003) 129-l：M;和 Holliger，P.等人，Proc.化 tl.Acad.Sci. USA 90(1993)6444-6448。H體抗體和四體抗體還在Hudson，P. J.等人，化t. Med. 9(2003) 129-134)中描述。
[0110] 單結(jié)構(gòu)域抗體是包含抗體的全部或一部分重鏈可變結(jié)構(gòu)域或全部或一部分 輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體片段。在某些實施方案中，單結(jié)構(gòu)域抗體是人單結(jié)構(gòu)域抗體 (Domantis, Inc. , Waltham, MA ;參見例如美國專利號 6, 248, 51 她 1)。
[0111] 可W通過多種技術產(chǎn)生抗體片段，所述多種技術包括但不限于蛋白酶解消化完整 抗體W及由重組宿主細胞（例如，大腸桿菌或瞻菌體）產(chǎn)生，如本文所述。
[0112] 術語"雙特異性抗體"指可W與第一抗原或表位并且與第二抗原或表位特異性結(jié) 合的抗原結(jié)合分子，W此第一抗原或表位不同于第二抗原或表位。
[0113] 雙特異性抗體樣式例如在 W0 2009/080251、W0 2009/080252、W0 2009/080253、W0 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792 和 WO 2010/145793 中描述。
[0114] 術語"抗體依賴的細胞介導細胞毒性"，簡寫為"ADCC"，指細胞介導的反應，所述反 應中表達FcR的非抗原特異性細胞毒細胞（例如天然殺傷細胞（NK細胞）、嗜中性粒細胞和 巨瞻細胞）通過與免疫球蛋白化區(qū)結(jié)合識別祀細胞并隨后造成祀細胞溶解。用于介導ADCC 的主要細胞即NK細胞，僅表達化Y RIII，而單核細胞表達化Y RI、化Y RII和化Y RIII。 造血細胞上的化1?表達匯總于 Ravetch 和 Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492 的第 464頁上的表3中。
[011引術語"抗體依賴的細胞吞瞻作用"，簡寫為短"ADCP"，指一種過程，其中通過與免疫 球蛋白化區(qū)結(jié)合的吞瞻性免疫細胞（例如巨瞻細胞、嗜中性粒細胞或樹突細胞）藉此完整 或部分地內(nèi)化抗體包覆的細胞。
[0116] 術語"與化受體結(jié)合"指例如在BIAcore?測定法（Pharmacia Biosensor AB,化psala,瑞典）中化區(qū)與化受體結(jié)合。
[0117] 在BIAcore?測定法中，化受體與表面結(jié)合并且通過表面等離子體共振（SPR)測 量對分析物（例如包含化區(qū)的融合多膚或抗體）的結(jié)合。結(jié)合的親和力由術語ka(締合 常數(shù)；化區(qū)融合多膚或綴合物締合W形成化區(qū)/化受體復合體的速率常數(shù)）、kd(解離常 數(shù)；化區(qū)融合多膚或綴合物從化區(qū)/化受體復合體解離的速率常數(shù)）和KD化d/ka)定義。 備選地，可W就共振信號高度和解離行為方面，將SPR傳感圖的結(jié)合信號與參比物的響應 信號直接比較。
[0118] 術語"Clq"指包含免疫球蛋白化區(qū)的結(jié)合位點的多膚。Clq連同兩種絲氨酸蛋白 酶Clr和C1 一起形成復合物C1，補體依賴細胞毒性（CDC)途徑的第一組分。人Clq可W例 如從加利福尼亞州圣迭戈如idel商購。
[0119] 術語"C肥結(jié)構(gòu)域"指抗體重鏈多膚的約從抓位置231延伸至抓位置340的部 分（根據(jù)Kabat的抓編號體系）。在一個實施方案中，C肥結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列AP化L GGPSV化FPPKP邸TLMISRWEVTCVWDVS肥D陽VKFNW YVDGVEVHNAKTKPREE犯STYRWSVLTVL冊DWL NGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID N0:30)。C肥結(jié)構(gòu)域的獨特性在于它不與另一個 結(jié)構(gòu)域緊密配對。相反，兩個N連接的分枝的糖鏈間插在完整天然化區(qū)的兩個C肥結(jié)構(gòu)域 之間。已經(jīng)推測糖可W提供結(jié)構(gòu)域-結(jié)構(gòu)域配對作用的替代并且有助于穩(wěn)定C肥結(jié)構(gòu)域。 Burton, Mol. Immunol. 22(1985) 161-206〇
[0120] 術語"C冊結(jié)構(gòu)域"指抗體重鏈多膚的約從抓位置341延伸至抓位置446的部分。 在一個實施方案中，C冊結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列GQPREPQVYTLPPS畑化TKNQV化TCLVKGFYPS DIAVEWESNGQ 陽NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM肥AL HNHYTQK化化SPG (沈Q ID N0:31)。
[0121] 術語抗體的"類別"指其重鏈擁有的恒定結(jié)構(gòu)域或恒定區(qū)的類型。人類中存在五 個主要類別的抗體；IgA、I曲、I班、IgG和IgM，并且該些類別中的幾種可W進一步劃分成亞 類（同種型），例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。對應于不同類別免疫球蛋白的 重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱作a、5、e、y和y。
[0122] 術語"補體依賴的細胞毒性"，簡寫為"CDC"，指引起細胞死亡的機制，其中結(jié)合祀 的化區(qū)融合多膚或綴合物的化區(qū)激活一系列酶促反應，W祀細胞膜中形成孔為終結(jié)。一 般，抗原-抗體復合物如抗體包覆的祀細胞上的那些，結(jié)合并激活補體組分Clq，后者轉(zhuǎn)而 激活補體級聯(lián)，導致祀細胞死亡。補體活化還可W導致補體組分沉積在祀細胞表面上，該通 過結(jié)合白細胞上的補體受體（例如，CR3)促進ADCC或ADCP。
[0123] 術語"效應子功能"指歸因于抗體化區(qū)的那些生物活性，該些活性隨抗體亞類變 動?？贵w效應子功能的例子包括；Clq結(jié)合和補體依賴的細胞毒性（CDC);化受體結(jié)合；抗 體依賴的細胞介導細胞毒性（ADCC);吞瞻（ADCP);下調(diào)細胞表面受體（例如，B細胞受體）； 和B細胞活化。該種功能可W例如通過化區(qū)與具有吞瞻活性或溶解活性的免疫細胞上的 化受體結(jié)合或通過化區(qū)與補體系統(tǒng)的組分結(jié)合來實現(xiàn)。
[0124] 活性劑（例如，藥物制劑）的"有效量"指W需要的劑量并持續(xù)需要的時間段，有 效實現(xiàn)所需治療性或預防性結(jié)果的量。
[0125] 術語"減少的效應子功能"指與對照分子（例如具有野生型化區(qū)的多膚）相比， 減少與分子相關的特定效應子功能（例如ADCC或CDC)至少20%。術語"強烈減少的效應 子功能"指與對照分子相比，減少與分子相關的特定效應子功能（例如ADCC或CDC)至少 50%。
[0126] 術語"化區(qū)"指免疫球蛋白的C末端區(qū)域?；瘏^(qū)是包含兩個二硫鍵連接的抗體重 鏈片段（重鏈化區(qū)多膚鏈）的二聚體分子。化區(qū)可W通過木瓜蛋白酶消化或IdeS消化或 膜蛋白酶消化完整（全長）抗體產(chǎn)生或可W重組產(chǎn)生。
[0127] 從全長抗體或免疫球蛋白可獲得的化區(qū)至少包含全長重鏈的殘基226 (切s)至C 末端，并且因此包含一部分較鏈區(qū)和2個或3個恒定結(jié)構(gòu)域，即C肥結(jié)構(gòu)域、C冊結(jié)構(gòu)域和 I班類和IgM類抗體上的另外/額外的CH4結(jié)構(gòu)域。從US 5, 648, 260和US 5, 624, 821已 知，修飾化區(qū)中限定的氨基酸殘基產(chǎn)生表型效應。
[0128] 構(gòu)成兩個相同或不相同抗體重鏈片段的二聚體化區(qū)的形成由所包含的C冊結(jié)構(gòu) 域的非共價二聚化介導（對于涉及的氨基酸殘基，參見例如化11'Acqua, Biochem. 37 (1998 )9266-9273)。通過在較鏈區(qū)中形成二硫鍵，共價地穩(wěn)定化區(qū)（參見例如化ber等人，化化re 264 (1976) 415-420 ;Thies 等人，J. Mol. Biol. 293 (1999) 67-79)。為 了破壞 C冊-C冊結(jié)構(gòu)域 相互作用的二聚化而在C冊結(jié)構(gòu)域內(nèi)部引入氨基酸殘基變化并未不利地影響新生化受體 (化化）結(jié)合，原因在于參與C冊-C冊結(jié)構(gòu)域二聚化的殘基的位置在C冊結(jié)構(gòu)域的內(nèi)界面上， 而參與化區(qū)-化化相互作用的殘基位于C肥-C冊結(jié)構(gòu)域外部。
[0129] 與化區(qū)的效應子功能相關的殘基位于如對全長抗體分子所測定的較鏈區(qū)、C肥結(jié) 構(gòu)域和/或C冊結(jié)構(gòu)域中?；瘏^(qū)相關/介導的功能是：
[0130] (i)抗體依賴的細胞毒性（ADCC)，
[013。 m)補體（Clq)結(jié)合、激活和補體依賴的細胞毒性仰C)，
[0132] (iii)吞瞻/清除抗原-抗體復合物，
[0133] (iv)在一些情況下釋放細胞因子，和
[0134] (V)抗體和抗原-抗體復合物的半壽期/清除率。
[0135] 通過化區(qū)與效應子功能特異性分子或受體相互作用，啟動化區(qū)相關的效應子功 能。大多數(shù)情況下，IgGl亞類抗體可W實現(xiàn)受體激活，而IgG2亞類和IgG4亞類抗體不具 有效應子功能或具有有限的效應子功能。
[0136] 激發(fā)效應子功能的受體是化受體類型（和亞型化cyRI、化yRn和化yRIII。 可W通過在下部較鏈區(qū)中引入?yún)⑴c化Y R和Clq結(jié)合的特定氨基酸變化如L234A和/或 L235A，減少與IgGl亞類相關的效應子功能。另外，某些氨基酸殘基，尤其位于C肥結(jié)構(gòu)域 和/或C冊結(jié)構(gòu)域中的殘基，與抗體分子或化區(qū)融合多膚在血流中的循環(huán)半壽期相關。循 環(huán)半壽期由化區(qū)與新生化受體（化化）的結(jié)合決定。
[0137] 化區(qū)糖結(jié)構(gòu)上存在的唾液酸殘基參與化區(qū)的抗炎介導活性（參見例如 Anthony, R.M.等人，Science 320(2008)373-376)。
[0138] 抗體恒定區(qū)中氨基酸殘基的編號根據(jù)K油at的抓索引進行化油at, E.A.等 人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 片反，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)，NIH Publication 913242)〇
[0139] 術語"人化區(qū)"指人源免疫球蛋白重鏈的C末端區(qū)域，其至少含有一部分的較鏈 區(qū)、C肥結(jié)構(gòu)域和C冊結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，人IgG抗體重鏈化區(qū)從約G1U216、或從 約切s226或從約Pro230延伸至重鏈的駿基端。然而，抗體化區(qū)的C末端賴氨酸（Lys447) 可W存在或可W不存在。
[0140] 術語"變體化區(qū)"指因至少一個"氨基酸改變/突變"而與"天然"或"野生型"Fc 區(qū)氨基酸序列不同的氨基酸序列。在一個實施方案中，與天然化區(qū)或與親本多膚的化區(qū) 相比，變體化區(qū)具有至少一個氨基酸突變，例如從約1個至約10個氨基酸突變，并且在一 個實施方案中，在天然化區(qū)中的或在親本多膚的化區(qū)中具有約1個至約5個氨基酸突變。 在一個實施方案中，（變體）化區(qū)與野生型化區(qū)和/或與親本多膚的化區(qū)具有至少約80% 同源性，并且在一個實施方案中，變體化區(qū)具有至少約90%同源性，在一個實施方案中，變 體化區(qū)具有至少約95%同源性。
[0141] 如本文中報道的變體化區(qū)由所含的氨基酸改變定義。因此，例如，術語P329G 指相對于親本（野生型）化區(qū)在氨基酸位置329處具有脯氨酸至甘氨酸突變的變體化 區(qū)。野生型氨基酸的身份可W是未指定的，在該種情況下前述變體稱作329G。對于在本 發(fā)明中討論的全部位置，根據(jù)抓索引進行編號。抓索引或如K油at或抓編號方案中 的抓索引指抓抗體的編號巧delman等人，Proc.化tl. Acad. Sci. USA 63(1969)78-85， 因而通過引用的方式完整并入）。改變可W是添加、缺失或突變。術語"突變"指 天然存在氨基酸的變化W及非天然存在氨基酸的變化，參見例如US 6, 586, 207、 W0 98/48032、W0 03/073238、US 2004/0214988、W0 2005/35727、W0 2005/74524， CMn，J.W.等人，J. Am. Chem.Soc. 124 (2002) 9026-9027 ;CMn，J.W.和 Schultz，P. G.，ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137 ;Chin，J.W.等人，PICAS 化ited States of America 99 (2002) 11020-11024 ; W及 Wang, L.和 Schultz, P. G.，Chem. (2002) 1-10 (全部文獻均通 過引用的方式完整并入本文）。
[0142] IgGl亞類的野生型人化區(qū)的多膚鏈具有W下氨基酸序列：
[0143] CPPCPA 陽化 GGPSVFLFPPKP 邸 TLMISRT 陽 VTCVVVDVS 肥 DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVS 化 TVLHQDWLNG 邸 YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS 畑化 TKNQV 化 TCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF 化 YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK 化化 SPGK( 沈Q ID NO ;32).
[0144] 帶有突變L234A、L235A的IgGl亞類的變體人化區(qū)的多膚鏈具有W下氨基酸序 列：
[0145] CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP邸TLMISRT陽VTCVVVDVS皿DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVS 化 TVL 冊 DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS 畑化 TKNQV 化 TCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF 化 YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK 化化 SPGK( 沈Q ID NO ; 33).
[0146] 帶有T366S、368A和Y407V突變的IgGl亞類的變體人化區(qū)的多膚鏈具有W下氨 基酸序列：
[0147] CPPCPAP化LGGPSVFLFPPKP邸TLMISRT陽VTCVVVDVS皿DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVS 化 TVL 冊 DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPS 畑化 TKNQVSLSCAVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF 化 VSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM 肥 ALHNHYT0K 化化 SPGK( 沈0 ID NO ; 34).
[0148] 帶有T366W突變的IgGl亞類的變體人化區(qū)的多膚鏈具有W下氨基酸序列：
[0149] CPPCPAP化LGGPSVFLFPPKP邸TLMISRT陽VTCVVVDVS皿DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVS 化 TVL 冊 DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPC 畑化 TKNQVSLW 化 VKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF 化 YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM 肥 ALHNHYTQK 化化 SPGK( 沈Q ID NO ;35).
[0150] 帶有L234A、L235A和T366S、368A及Y407V突變的IgGl亞類的變體人化區(qū)的多 膚鏈具有 W 下氨基酸序列；CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP 邸 TLMISRT 陽 VTCVVVDVS 肥 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS化TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPS畑 ELTKNQV 化 SCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVU)SDGSWLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM 肥 AU1 NHYTQK化化SPGK(SEQ ID N0;36).
[015。 帶有L234A、L235A和T366W突變的IgGl亞類的變體人化區(qū)的多膚鏈具有W下氨 基酸序列：
[0152] CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP邸TLMISRT陽VTCVVVDVS皿DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVU1QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPKKTISKAKGQPREPQVYTUPCW^TKNQVSLW&VKG FYPSDIAVE 肥 SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF 化 YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM 肥 ALHNHYTQK 化化 SPGK( 沈Q ID NO ; 37).
[0153] 帶有P329G突變的IgGl亞類的變體人化區(qū)的多膚鏈具有W下氨基酸序列：
[0154] CPPCPAP化LGGPSVFLFPPKP邸TLMISRT陽VTCVVVDVS皿DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVS化TVL 冊 DWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS 畑化TKNQV 化TCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF 化 WKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM 肥 ALHNHYTQK 化化 SPGK( 沈Q ID NO ; 38).
[0巧日]帶有L234A、L235A和P329G突變的IgGl亞類的變體人化區(qū)的多膚鏈具有W下氨 基酸序列：
[0156] CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP邸TLMISRT陽VTCVVVDVS皿DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVS化TVL 冊 DWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS 畑化TKNQV 化TCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF 化 YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM 肥 ALHNHYTQK 化化 SPGK( 沈Q ID NO ;39).
[0157] 帶有P239G和T366S、368A和Y407V突變的IgGl亞類的變體人化區(qū)的多膚鏈具 有W下氨基酸序列：
[0158] CPPCPAP化LGGPSVFLFPPKP邸TLMISRT陽VTCVVVDVS皿DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVS 化 TVL 冊 DWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPS 畑化 TKNQVSLSCAVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF 化 VSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM 肥 ALHNHYTQK 化化 SPGK( 沈Q ID NO ;40).
[0159] 帶有P329G和T366W突變的IgGl亞類的變體人化區(qū)的多膚鏈具有W下氨基酸序 列：
[0160] CPPCPAP化LGGPSVFLFPPKP邸TLMISRT陽VTCVVVDVS皿DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVS 化 TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPI 邸 TISKAKGQPREPQVYTLPPC 畑化 TKNQVSLW 化 VKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM 肥 ALHNHYTQK 化化 SPGK( 沈Q ID NO ;41).
[0161] 帶有 L234A、L235A、P329G 及 T366S、368A 和 Y407V 突變的 IgGl 亞類的變體人 Fc 區(qū)的多膚鏈具有W下氨基酸序列：
[0162] CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP邸TLMISRT陽VTCVVVDVS皿DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVS 化 TVL 冊 DWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPS 畑化 TKNQVSLSCAVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF 化 VSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM 肥 ALHNHYTQK 化化 SPGK( 沈Q ID NO ;42).
[0163] 帶有L234A、L235A、P329G和T366W突變的IgGl亞類的變體人化區(qū)的多膚鏈具有 W下氨基酸序列：
[0164] CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKP邸TLMISRT陽VTCVVVDVS皿DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVS 化 TVL 冊 DWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPC 畑化 TKNQVSLW 化 VKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF 化 YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM 肥 ALHNHYTQK 化化 SPGK( 沈Q ID NO ;43).
[0165] IgG4亞類的野生型人化區(qū)的多膚鏈具有W下氨基酸序列：
[0166] CPSCPAP邸LGGPSVFLFPPKP邸TLMISRT陽VTCVVVDVS犯DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVL冊DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS犯EMTKNQV化TCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF化rei^LTVDKSRWQEGNVFSCSVM 肥 ALHNHYTQK 化化化 GK( 沈Q ID NO ;44).
[0167] 帶有S228P和L23祀突變的IgG4亞類的變體人化區(qū)的多膚鏈具有W下氨基酸序 列：
[0168] CPPCPAP邸EGGPSVFLFPPKP邸TLMISRT陽VTCVVVDVS犯DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVS化TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS犯EMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVU)SDGSWLre 化 TVDKSRWQEGNVFSCSVM 肥 ALHNHYTQK 化化 SLGK( 沈Q ID NO ;45).
[0169] 帶有S228P、L23祀和P329G突變的IgG4亞類的變體人化區(qū)的多膚鏈具有W下氨 基酸序列：
[0170] CPPCPAP邸EGGPSVFLFPPKP邸TLMISRT陽VTCVVVDVS犯DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVS化TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS犯EMTKNQV化TCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVU)SDGSWLre 化 TVDKSRWQEGNVFSCSVM 肥 ALHNHYTQK 化化 SLGK( 沈Q ID NO ;46).
[0171] 術語"化受體"，簡寫為"FcR"，指與化區(qū)結(jié)合的受體。在一個實施方案中， FcR是天然序列人化R。另外，在一個實施方案中，F(xiàn)cR是結(jié)合IgG抗體的化R(化Y受 體）并且包括受體化yRI、化yRII、和化yRIII亞類，包括其等位變體及備選地包括 其剪接形式。化yRII受體包括化yRIIA("激活性受體"）和化yRIIB("抑制性受 體"），它們具有主要在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)城內(nèi)不同的相似氨基酸序列。激活性受體化yRIIA 在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體酪氨酸的激活基序（ITAM)。抑制性受體化yRIIB 在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序（ITIM)(參見例如Daiil'on, M. , Annu. Rev. Immunol. 15 (1997) 203-234)?；??綜述于 Ravetch 和 Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492，Capel 等人，Immunomethods 4(1994)25-34，de Haas 等人， J. L油.Clin. Med. 126 (1995) 330-341中。本文中的術語"化R"涵蓋其他化R，包括將來待鑒 定的那些。該術語還包括新生兒受體，化化，其負責母源IgG轉(zhuǎn)移至胎兒（參見例如Guyer 等人，J. Immunol. 117 (1976) 587 ;Kim 等人，J. Immunol. 24 (1994) 249)。
[017引術語叩C Y受體"，簡寫為"Fc Y R"，指結(jié)合IgG抗體化區(qū)并且由化Y R基因編碼 的蛋白家族的任何成員。在人類中，該個家族包括但不局限于化Y RI (CD64)，包括同工型 化Y RIA、化Y RIB和化Y RIC ;化Y RII (CD32)，包括同工型化Y RIIA(包括同種異型H131 和 R131)、化 Y RIIB (包括化 Y RIIB-1 和化 Y RIIB-2)和化 Y RIIC，W及化 Y RIII (CD16)， 包括同工型化y RIIIA(包括同種異型V158和F158)和化y RIIIB(包括同種異型 化 Y RIIB-NA1 和化 Y RIIB-NA2)(參見例如 Jefferis 等人，Immunol. Lett. 82 (2002) 57-65， 通過引用的方式完整并入），W及任何未發(fā)現(xiàn)的人化yRs或化yR同工型或同種異型。 化yR可W來自任何生物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠化yR包括但不限 于化 yRI(CD64)、化yRII(CD32)、化yRIII(CD16)和化yRIII-2(CD16-2) W及任何未 發(fā)現(xiàn)的小鼠化yR或化yR同工型或同種異型。參與化區(qū)-Fc yR相互作用的氨基酸 殘基是 234-239 (下部較鏈區(qū)）、265-269 炬/C 環(huán)）、297-299 值/E 環(huán)）和 327-332 (F/G)環(huán) (Sondermann 等人，化Uire 406 (2000) 267-273)。導致化 Y RI、化 Y RIIA、化 Y RIIB 和 / 或 化Y RIIIA的結(jié)合/親和力降低的氨基酸突變包括N297A(同時伴隨降低的免疫原性和延 長的半壽期結(jié)合 / 親和力）（Routledge 等人，Transplantation 60(1995)847 sRriend 等 人，Transplantation 68 (1999) 1632 ;Shields 等人，J. Biol. Qiem. 276 (2001) 6591-6604)、 殘基 233-236 (Ward 和 Ghetie.Ilier. Immunol. 2 (1995) 77 ;Armour 等人，Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624)。US 7, 355, 008 和 US 7, 381，408 中描述了一些示例性氨 基酸置換。
[0173] 術語"新生化受體"，簡寫為"化化"，指結(jié)合I gG抗體化區(qū)并且至少部分地 由化化基因編碼的蛋白質(zhì)?；蒞來自任何生物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔 和猴。如本領域已知，有功能的化化蛋白包含兩種多膚，經(jīng)常稱作重鏈和輕鏈。輕鏈是 目-2-微球蛋白并且重鏈由化化基因編碼。除非本文中另外指出，否則化化或化化蛋白 指化化重鏈與目-2-微球蛋白的復合物?；瘏^(qū)與化化的相互作用的氨基酸殘基在C肥 結(jié)構(gòu)域和C冊結(jié)構(gòu)域的交界附近。化區(qū)-化化接觸殘基均在單條IgG重鏈內(nèi)部。涉及的 氨基酸殘基是 248、250-257、272、285、288、290-291、308-311 和 314(全部在 C肥結(jié)構(gòu)域 中）和氨基酸殘基385-387、428和433-436(全部在C冊結(jié)構(gòu)域中）。導致對化化的結(jié) 合/親和力增加的氨基酸突變包括T256A、T307A、E380A和M34A(Shields等人，J. Biol. Chem. 276(2001)6591-6604)。
[0174] 術語"全長抗體"指具有與天然抗體結(jié)構(gòu)基本上相同的結(jié)構(gòu)和氨基酸序列的抗體 W及包含如本文中報道的化區(qū)的多膚。
[01巧]術語"全長抗體重鏈"指W N末端至C末端方向包含抗體可變結(jié)構(gòu)域、第一恒定結(jié) 構(gòu)域、抗體重鏈較鏈區(qū)、第二恒定結(jié)構(gòu)域和第H恒定結(jié)構(gòu)域的多膚。
[0176] 術語"抗體重鏈化區(qū)"指包含抗體重鏈較鏈區(qū)、第一恒定結(jié)構(gòu)域和第二恒定結(jié)構(gòu) 域的多膚。
[0177] 術語"全長抗體輕鏈"指W N末端至C末端方向包含抗體可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu) 域的多膚。
[0178] 術語"較鏈區(qū)"指抗體重鏈多膚的部分，所述部分在野生型抗體重鏈中連接CH1 結(jié)構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域，例如根據(jù)K油at的抓編號體系從約位置216至約位置230,或根據(jù) K油at的抓編號體系從約位置226至約位置230。可W通過與IgGl亞類序列的較鏈區(qū)半 脫氨酸殘基比對，確定其他IgG亞類的較鏈區(qū)。
[0179] 較鏈區(qū)正常情況下是由具有相同氨基酸序列的兩條多膚組成的二聚體分子。 較鏈區(qū)通常包含約25個氨基酸殘基并且是柔性的，允許抗原結(jié)合區(qū)獨立地移動。較 鏈區(qū)可W再劃分成H個結(jié)構(gòu)域；上部、中部和下部較鏈結(jié)構(gòu)域（參見例如Roux等人， J. Immunol. 161(1998)4083)。
[0180] 術語化區(qū)的"下部較鏈區(qū)"指C末端緊鄰于較鏈區(qū)的一段氨基酸殘基，即根據(jù) K油at的抓編號化區(qū)殘基233至239。
[0181] 術語"野生型化區(qū)"指與自然界中存在的化區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。 野生型人化區(qū)包含天然人IgGl化區(qū)（非A同種異型和A同種異型），天然人IgG2化區(qū)、天 然人IgG3化區(qū)和天然人IgG4化區(qū)及其天然存在的變體。
[0182] 術語"個體"或"對象"指哺乳動物。哺乳動物包括但不限于馴化動物（例如，奶 牛、羊、貓、犬和馬）、靈長類（例如，人和非人靈長類如猴）、兔和曬齒類（例如，小鼠和大 鼠）。在某些實施方案中，個體或?qū)ο笫侨恕?br> [0183] 相對于參考多膚序列的"氨基酸序列同一性百分數(shù)（％ )"定義為比對序列并根據(jù) 需要引入空位W實現(xiàn)最大序列同源性百分數(shù)并且不考慮任何保守性置換作為序列同一性 的部分之后，候選序列中與參考多膚序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分數(shù)。為 了確定氨基酸序列同一性百分數(shù)的比對可W按本領域能力范圍內(nèi)的多種方式實現(xiàn)，例如， 使用可公開獲得的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megali即值NASTAR)軟件。本 領域技術人員可W確定用于比對序列的適宜參數(shù)，包括為實現(xiàn)正在比較的全長序列范圍內(nèi) 最大比對所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比較計算機程序ALIGN-2產(chǎn) 生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比較計算機程序由Genentech，Inc.授權(quán)，并且 源代碼已經(jīng)隨用戶文檔提交至華盛頓特區(qū)美國版權(quán)辦公室，在那里它W美國版權(quán)登記號 TX呪 10087 登記。ALIGN-2 程序從 Genentech, Inc. , South San Rrancisco,加利福尼亞州 可公開獲得或可W從源代碼匯編。應當將ALIGN-2程序匯編在UNIX操作系統(tǒng)（包括數(shù)字 式UNIX V4.0D)上使用。全部序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設定并且不變動。
[0184] 在使用ALIGN-2比較氨基酸序列的情況下，如下計算給定氨基酸序列A與、同或針 對給定氨基酸序列B (該可W備選地描述為與、同或針對給定氨基酸序列B具有或包含某個 氨基酸序列同一性％的給定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％是：
[0185] 100 乘 W 分數(shù) X/Y
[0186] 其中X是由序列比對程序ALIGN-2在該程序的A和B比對結(jié)果中評定為相同匹配 的氨基酸殘基的數(shù)目，并且其中Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)。將可W理解在氨基酸序列A 的長度不等于氨基酸序列B的長度時，A相對于B的氨基酸序列同一性％將不等于B相對 于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特別聲明，否則本文所用的全部氨基酸序列同一性 值％如緊接前段中所述那樣使用ALIGN-2計算機程序獲得。
[0187] 術語"藥物制劑"指一種制備物，所述制備物處于該類形式從而允許其中所含的活 性成分的生物活性有效，并且不含有對于將會施用該制劑的對象不可接受地有毒的額外組 分。
[018引"可藥用載體"指藥物制劑中除活性成分之外的對對象無毒的成分。可藥用載體包 括但不限于緩沖劑、賦形劑、穩(wěn)定劑或防腐劑。
[0189] 術語"患者的表型"指在一類來自患者的細胞中細胞表面受體的組成。該組成可W 是定性W及定量組成。確定/給出基因型的細胞可W是單個細胞或包含多個細胞的樣品。
[0190] 術語"位置"指氨基酸殘基在多膚的氨基酸序列中的位置。可W將位置依次或根 據(jù)建立的格式（例如用于抗體編號的Kabat的抓索引）編號。
[01W] 術語"改變的叩cR結(jié)合親和力或ADCC活性指與親本多膚（例如包含野生型化區(qū) 的多膚）相比，具有增強或削弱的化R結(jié)合活性和/或ADCC活性的多膚。與化R "具有增 加的結(jié)合"的變體多膚W比親本或野生型多膚更低的解離常數(shù)（即更好/更高的親和力） 結(jié)合至少一種化R。與FcR "具有降低的結(jié)合"的變體多膚W比親本或野生型多膚更高的解 離常數(shù)（即更差/更低的親和力）結(jié)合至少一種化R。顯示降低的化R結(jié)合的該類變體可 W擁有極少或不可評估的化R結(jié)合，例如，與野生型或親本IgG化區(qū)相比0 - 20%的化R結(jié) 合。
[0192] 與親本或野生型多膚相比W "減少的親和力"結(jié)合化R的多膚是當多膚變體和親 本多膚的量在結(jié)合測定法中（基本上）大致相同時，與親本多膚相比，W (實質(zhì)地）減少的 結(jié)合親和力結(jié)合上文鑒定的任一種或多種化R的多膚。例如，與其中測定化R結(jié)合親和力 的親本多膚相比，F(xiàn)cR結(jié)合親和力減少的多膚變體可W在FcR結(jié)合親和力方面顯示1. 15倍 至約100倍、例如1. 2倍至約50倍減少。
[0193] 在人效應細胞存在下比親本多膚更低效地"介導抗體依賴的細胞介導細胞毒性 (ADCC)"的包含變體化區(qū)的多膚是該樣的多膚，其中當測定法中所用的變體多膚和親本多 膚的量（基本上）大致相同時，所述多膚在體外或在體內(nèi)在介導ADCC方面（實質(zhì)地）更 低效。通常，將使用如本文中公開的體外ADCC測定法鑒定該類變體，但是構(gòu)思了用于確定 ADCC活性的其他測定法或方法，例如在動物模型中確定等。在一個實施方案中，變體在介導 ADCC方面（例如在本文中公開的體外測定法中）比親本更低效約1. 5倍至約100倍，例如 約2倍至約50倍。
[0194] 術語"受體"指能夠結(jié)合至少一種配體的多膚。在一個實施方案中，受體是具有胞 外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和任選地其他結(jié)構(gòu)域（例如跨膜結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和/或膜銷定物） 的細胞表面受體。本文所述的測定法中待評價的受體可W是完整受體或者其片段或衍生物 (例如包含受體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域與一種或多種異源多膚融合的融合蛋白）。另外，待評價其結(jié) 合特性的受體可W存在于細胞中或是分離的并任選地包被在測定法平板或某些其他固體 相上。
[019引如本文所用，"治療"（和其語法變型如"治療"或"治療"）指意欲改變正在治療的 個體的天然過程的臨床介入，并且可W為了預防或在臨床病理學過程期間進行。想要的治 療效果包括，但不限于防止疾病出現(xiàn)或復發(fā)、減輕癥狀、減小疾病的任何直接或間接病理學 后果、防止轉(zhuǎn)移、降低病情進展速率、改善或緩和疾病狀態(tài)，W及緩解或預后改善。在一些實 施方案中，本發(fā)明的抗體用來延緩疾病發(fā)展或用來減慢疾病的進展。
[0196] II.定吿I恪特異十牛結(jié)合分子
[0197] 在大多數(shù)基于細胞的疾病中，通過基于抗體的受體分子結(jié)合祀向疾病相關細胞是 一個有前景的方案。然而，臨床上相關的表面受體（=祀）的表達水平在患者間不同并且 基于標準化抗體的藥物的功效因此非常不同。該特別適用于其作用模式為同時祀向兩個不 同表位/受體的雙特異性結(jié)合分子和多特異性結(jié)合分子的特異性。
[019引一個有前景的方法是?？跒橄鄳颊叩木唧w/單個情況設計藥物（該里，雙特異 性結(jié)合分子或多特異性結(jié)合分子）。
[0199] 就表達的細胞表面分子（如受體）的數(shù)目和種類而言，來自個體的每個細胞是不 同的。對于癌細胞和非癌細胞，尤其如此。因此，細胞可W由呈遞的細胞表面分子表征。
[0200] 基于患者的疾病相關性細胞上臨床上相關的表面受體的表達譜數(shù)據(jù)，一系列的結(jié) 合實體（例如F油片段）特別地從文庫選出并且組合成多特異性結(jié)合分子作為患者特異性 藥物。基于例如表面受體的表達水平和并且因此個體患者的需要和表型，相對于相應的疾 病相關性細胞如例如腫瘤細胞，具體地選擇該些選擇的結(jié)合分子。
[0201] 該種表征可W通過基于體外和體內(nèi)的細胞成像技術實現(xiàn)。體內(nèi)成像技術例如包括 光學成像、分子成像、英光成像、生物發(fā)光成像、MRI、PET、SPECT、CT和活體內(nèi)顯微術。體外 成像技術例如包括用例如識別特定細胞表面標記物的英光標記的抗體對患者細胞的免疫 組織化學染色和通過顯微術分析英光信號。備選地，可W在用標記的治療性或診斷性抗體 染色后使用基于FACS的方法，分析細胞的基因型/表型。
[020引在一個實施方案中，通過基于FACS的方法確定患者來源的細胞的基因型/表型。 在一個實施方案中，通過使用英光標記的診斷抗體或治療性抗體確定細胞表面標記物。在 一個實施方案中，使用英光標記的治療性抗體。
[0203] 某些疾病可能與特定細胞表面分子的數(shù)目變化或與新細胞表面分子的出現(xiàn)相關。
[0204] 患有該種疾病的個體將在某些范圍中顯示疾病和/或個體特異性細胞表面標記 物樣式。
[0205] 應當考慮該一點W向此類個體提供定制的祀向療法。
[0206] 已知針對細胞表面分子及其配體的許多治療性抗體，所述治療性抗體可W用于選 擇和構(gòu)建定制的多特異性祀向?qū)嶓w，如Rituxan/Mab化era/利妥昔單抗、2H7/奧瑞珠單抗 (Ocrelizum油）、Zevalin/ 替伊莫單抗 Qbrizumom油）、Arze;rra/ 奧法木單抗（Ofatumum油） (CD20)、化L2/依帕珠單抗、奧英妥珠單抗（Ino化zom油）（CD22)、Zenapax/達克珠單抗、 Simulect/己利昔單抗炬asilixim油）（CD25)、赫賽汀/曲妥珠單抗、帕妥珠單抗化er2/ ERBB2)、Mylotarg/吉妥珠單抗（CD33)、Raptiva/依法珠單抗（Cdlla)、愛必妥巧rbitux)/ 西妥昔單抗巧GFR，表皮生長因子受體）、IMC-1121B(VEGF受體2)、Tys油ri/那他珠單抗 (a 4目1和a 4目7整聯(lián)蛋白的a 4亞基）、ReoPro/阿昔單抗（Abcixim油）（甜1扣-甜Ila 和av目3整聯(lián)蛋白）、Orthoclone 0KT3/莫羅單抗CD3 (CD3)、Benlysta/貝利單抗 (Belimum油）（BAFF)、Tolerx/0teliximab(CD3)、Soliris/ 依庫珠單抗巧culizum油）（巧補 體蛋白）、Acte皿a/巧珠單抗（Tocilizumab)(比-6R)、化norex/依決洛單抗巧pCAM,上皮細 胞黏附分子）、CEA-CAM5/拉貝珠單抗（Ubetuzum油）（CD66/CEA，癌胚抗原）、CT-11 (PD-1， 編程死亡-1T 細胞抑制性受體，CD-d279)、肥24G11 (c-Met 受體）、SAR3419 (CD19)、IMC-A12/ 西妥木單抗（Cixutumum油）（IGF-1R、膜島素樣生長因子1受體）、MEDI-575(PDGF-R、血小板 衍生生長因子受體）、CP-675、206/曲美木單抗（Tremelimum油）（細胞毒性T淋己細胞抗原 4)、R05323441 (胎盤生長因子或 PGF)、HGS1012/ 馬帕木單抗（Mapatumumab) (TRA比-R1)、 SGN-70 (CD70)、維多汀-35) / 貝倫妥單抗炬rentuxim油）（CD30)、和 ARH460-16-2 (CD44)。
[0207] 已知用于確定例如患者的樣品中存在的細胞表面標記物的不同方法。一個示例性 方法基于英光激活的細胞分選（FACS)，尤其，特異性染色和分選的細胞群體的分析。在該種 方法中，通過W下方式實現(xiàn)樣品（細胞群體）的表型分型：使用針對該些標志物的英光標記 抗體，任選地包括細胞群體中表面標志物的統(tǒng)計分布，就呈遞的細胞表面標記物分析單個 細胞。特別合適的是使用出于該個目的已經(jīng)用英光標記物標記的治療性抗體，因為該確保 后一種定制的多特異性結(jié)合分子將與診斷性抗體相同的表位結(jié)合。如本文中報道的多特異 性結(jié)合分子/雙特異性抗體可w用于制備藥物，所述藥物用于治療例如腫瘤學疾病、也血 管疾病、傳染病、炎性疾病、自身免疫疾病、代謝（例如，內(nèi)分泌）疾病或神經(jīng)學（例如神經(jīng) 變性）疾病。該些疾病的示例性非限制例子是阿爾茨海默病、非霍奇金淋己瘤、B細胞急性 和慢性淋己樣白血病、Burkitt淋己瘤、霍奇金淋己瘤、多毛細胞白血病、急性和慢性髓樣白 血病、T細胞淋己瘤和白血病、多發(fā)性骨髓瘤、膠質(zhì)瘤、Waldenstrom巨球蛋白血癥、癌（如 口腔癌、胃腸道癌、結(jié)腸癌、胃癌、肺氣道（pulmonary tract)癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列 腺癌、子宮癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、膀脫癌、膜癌、骨癌、肝臟癌、膽囊癌、腎癌、皮膚癌、睪 丸癌）、黑色素瘤、肉瘤、膠質(zhì)瘤、和皮膚癌、急性特發(fā)性血小板減少性紫薇、慢性特發(fā)性血小 板減少性紫薇、皮肌炎、Sydenham舞蹈病、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、風濕熱、 多內(nèi)分泌腺綜合征、大瘡性類天瘡瘡、糖尿病、Henoch-Schonlein紫薇、鏈球菌感染后腎炎、 結(jié)節(jié)性紅斑、化kayasu動脈炎、阿狄森病、類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、肉樣瘤病、潰瘍性 結(jié)腸炎、多形性紅斑、IgA腎病、結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎、強直性脊柱炎、肺出血腎炎綜合征、閉 塞性血栓性脈管炎、Sjogren綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化、橋本氏甲狀腺炎化ashimoto's thyroiditis)、甲狀腺毒癥、硬皮病、慢性活動性肝炎、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、尋 常天瘡瘡、韋格納肉芽腫?。╓egener' S granulomatosis)、膜性腎病、肌萎縮側(cè)索硬化、脊 髓巧（t油es dorsalis)、巨細胞動脈炎/多肌痛、惡性貧血、快速進展性腎小球腎炎、銀屑 病或纖維化肺泡炎。
[020引許多細胞表面標記物及其配體是已知的。例如已經(jīng)報道癌細胞表達至少一種W下 細胞表面標記物和/或配體，包括但不限于碳酸酢酶IX、a-胎蛋白、a-輔肌動蛋白-4、 A3(A33 抗體特異性的抗原）、ART-4、B7、Ba-733、BAGE、化E3 抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、 CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CDla、CD2、CD3、CD4、CDS、CD8、CD1-1A、CD14、CD15、CD16、 CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、 CD40L、CD45、CD46、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、 CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CXCR4、CXCR7、 CX化 12、HIF-^a、結(jié)腸特異性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-met、DAM、EGFR、 EGFRvIII、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、葉酸受體、G250 抗原、GAGE、GROB、 HLA-DR、HMl. 24、人絨毛膜促性腺素釋放激素（HCG)及其亞基、肥R2/neu、HMGB-1、低氧誘 導因子 OHF-l)、服P70-2M、服T-2 或 la、IGF-1R、IFN-y、IFN-a、IFN-目、比-2、比-4R、 IL-6R、IL-13R、比-15R、IL-17R、比-18R、IL-6、比-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、 膜島素樣生長因子-1 (IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/即T、巨瞻細胞移行 抑制因子（MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ES0-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、 MIP-IB、MIF、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、膜腺癌 黏蛋白、胎盤生長因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磯酸酶、PSA、FRAME、PSM、PIGF、ILGF、 ILGF-IR、比-6、比-25、RS5、RANTES、TlOl、SAGE、SlOO、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、生 膊蛋白、TRAIL受體、TNF-a、化抗原、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、VEGFR、 邸-B纖連蛋白、WT-1、17-1A抗原、補體因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成標志物、bcl-2、 bd-6、KRAS、cMET、癌基因標志物和癌基因產(chǎn)物（例如參見，Sensi等人，Clin. Cancer Res. 12(2006)5023-5032 ;Parmiani,等人，J. Immunol. 178(2007) 1975-1979 ;Novellino 等 人，Cancer Immunol. Immunother. 54 (2005) 187-207)。
[0209] 因此，識別特定細胞表面受體（包括其配體）的抗體可W用于特異性和選擇性祀 向并結(jié)合至許多/多種與疾病相關的細胞表面標記物。細胞表面標記物是位于例如與信號 傳導事件或配體結(jié)合相關的細胞（例如疾病相關細胞）的表面上的多膚。
[0210] 在一個實施方案中，為了治療癌癥/腫瘤，使用祀向腫瘤相關抗原的多特異性結(jié) 合分子 / 雙特異性抗體，如在化rberman, "Immunodia即osis of Cancer", Fleisher (編 著），"The Clinical Biochemistry of Cancer",第 347 頁（American Association of Clinical Chemists (1979))中和在 US 4，150，149;US 4, 361，544 和 US 4, 444, 744 中報道 的那些。
[0211] 關于腫瘤相關抗原（TAA)的報告包括Miz址ami等人OJaUire Med. 11(2005)992-997) ;Hatfield 等人（Curr. Cancer Drug Targets 5(2005)229-248); Vallbohmer 等人（J Clin. Oncol. 23 (2005) 3536-3544)和 Ren 等人（Ann. Surg. 242 (2005) 55-63)，每篇文獻就鑒定的TAA而言通過引用方式并入本文。
[0212] 在疾病涉及淋己瘤、白血病或自身免疫疾病的情況下，祀向的抗原可W選自 CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、 CD40L、CD46、CD54、CD67、CD74、CD79a、CD80、CD126、CD138、CD154、CXCR4、B7、MUC1 或 la、歷1. 24、HLA-DR、生膊蛋白、VEGF、P1GF、邸-B纖連蛋白、癌基因、癌基因產(chǎn)物（例如， c-met 或 PLAGL2)、CD66a-d、壞死抗原、比-2、T101、TAG、比-6、MIF、TRA比-R1 0R4)和 TRAIL-R2(DR5)。
[0213] 已知許多雙特異性抗體針對兩種不同祀如BCMA/CD3、處于組合的不同肥R家族 抗原巧GFR、肥R2、肥R3)、CD19/CD3、IL17RA/1L7R、比-6/比-23、比-1-目/1心8、比-6 或 比-6R/]X-21或比-21R,第一特異性針對選自Lewis X-結(jié)構(gòu)、Lewis b-結(jié)構(gòu)和Lewis廠結(jié) 構(gòu)、Globo H-結(jié)構(gòu)、KH1、化抗原、TF抗原的抗原的糖表位和黏蛋白、CD44、糖脂和糖銷脂 如Gg3、抓3、GD3、GD2、抓5、Gml、Gm2、唾液醜四糖基神經(jīng)醜胺的糖結(jié)構(gòu)并且第二特異性針 對選自EGFR、肥R2、肥R3和肥R4、GD2a的化bB受體酪氨酸激酶，所述第二特異性與下述第 二抗原結(jié)合位點組合，所述第二抗原結(jié)合位點與選自T-淋己細胞NK細胞、B-淋己細胞、樹 突細胞、單核細胞、巨瞻細胞、嗜中性粒細胞、間充質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞的免疫細胞、ANG2/ VEGF、VEGF/PDGFR-目、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)接納體 2/^03、？5祖/〔03、6?〔41/^03、選自 VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、化T3、C-FMS/CSF1R、RET、c-Met、EGFR、Her2/neu、肥R3、肥R4、 16尸3、？06。1?、(：-1^1、8〇?、整聯(lián)蛋白和匪？的抗原組合、與選自￥66。、66。、？16。、？06。、服尸和 血管生成素、ERBB-3/C-MET、ERBB-2/C-MET、EGF 受體 1/CD3、EGFR/肥R3、PSCA/CD3、C-MET/ CD3、內(nèi)皮唾液酸蛋白（endosialin)/CD3、EPCAM/CD3、IGF-1R/CD3、FAPALPHA/CD3、EGFR/ IGF-1R、IL17A/F、EGF受體1/CD3和CD19/CD16的水溶性配體締合。
[0214] 因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過使用如本文中報道的模塊化方法，可W提供定制的雙特異性 抗體治療性抗體。根據(jù)需要治療的個體的細胞上實際存在的細胞表面分子或根據(jù)與該種細 胞表面分子相互作用的配體，定制該些抗體。通過確定個體的細胞表面分子狀態(tài)，可W選擇 治療祀的定制組合。
[0215] 在通過組合2種單一治療性分子W同時祀向并結(jié)合至兩個不同表位而該樣定制 產(chǎn)生雙特異性治療劑的情況下，與單一治療性分子相比，可W期望加合/協(xié)同效應。
[0216] 通過使用已經(jīng)可獲得的單特異性治療性結(jié)合實體，如衍生自治療性抗體的那些， 可w實現(xiàn)所需多特異性結(jié)合分子的快速和簡便產(chǎn)生。
[0217] 該些親合力工程化的結(jié)合分子/抗體可W結(jié)合單個細胞上存在的兩種或更多種 細胞表面標記物。如果全部/兩種結(jié)合實體同時與細胞結(jié)合，則該種結(jié)合是唯一想要的。為 此目的，中等至低親合力抗體特別適合。在另一方面，該還允許在篩選過程期間排除較低特 異性的結(jié)合特異性組合。
[021引選擇的患者特異性的多特異性結(jié)合分子可W在多種細胞體外測定法/細胞樣品 中針對有關標準（例如最佳結(jié)合/結(jié)合配偶體、最佳接頭長度等）測試：
[0219] -確定磯酸酪氨酸激酶的磯酸化狀態(tài)
[0220] -確定C-化n N末端激酶（JNK)抑制作用
[0221] -確定分子誘導的調(diào)亡
[0222] -相對于多特異性結(jié)合分子用單特異性結(jié)合分子進行的結(jié)合測定法
[0223] -確定增殖抑制作用
[0224] 采用該種方法，可W產(chǎn)生定制的和因此高度有效率的治療性分子。該些分子將因 改進的祀向/遞送（例如腫瘤細胞的有效負載）而具有減少的副作用并且改進的對祀細胞 的祀向基于祀向組分（包含至少兩個結(jié)合分子）的更高選擇性和特異性。
[0225] 多特異性結(jié)合分子的更高選擇性和特異性歸因于通過兩個"低親和力結(jié)合物"的 組合所致的同時結(jié)合（親合力），該減少可能的"脫祀結(jié)合"。 。22引 化本專中根道的方法
[0227] 如本文中報道的一個方面是用于產(chǎn)生雙特異性抗體的方法，所述方法包括步驟： 賠育
[0228] (1)在20個0末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨基酸序列1口《口6 669 10^:01，其中乂1 可W是任何氨基酸殘基）的抗體Fab片段或scFv抗體，
[0229] (ii)包含全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈和抗體重鏈化區(qū)多膚的抗體片段，
[0230] W此全長抗體重鏈和全長抗體輕鏈是同族抗體鏈并且其可變結(jié)構(gòu)域?qū)Γ╒H和化） 形成抗原結(jié)合位點，
[0231] W此全長抗體重鏈和抗體重鏈化區(qū)多膚通過形成抗體較鏈區(qū)的一個或多個二硫 鍵彼此共價連接，并且
[0232] W此抗體重鏈化區(qū)在其N末端具有寡甘氨酸氨基酸序列，
[0233] 和
[0234] (iii)分選酶 A
[0235] 并且因而產(chǎn)生雙特異性抗體。
[0236] 如本文中報道的一個方面是用于產(chǎn)生雙特異性抗體的方法，所述方法包括W下步 驟
[0237] (i)確定在樣品中細胞表面上存在的表面標志物并且選擇其第一表面標記物和第 二表面標記物，
[023引 （U)賠育（a)在20個C末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID N0:01，其中XI可W是任何氨基酸殘基）的抗體Fab片段或scFv抗體片段，W此Fab片段 或scFv與第一表面標記物特異性結(jié)合，化）包含全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈和抗體重鏈 化區(qū)多膚的抗體片段，W此全長抗體重鏈和全長抗體輕鏈是同族抗體鏈并且其可變結(jié)構(gòu)域 對（VH和VL)形成與第二表面標記物特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點，W此全長抗體重鏈和抗 體重鏈化區(qū)多膚通過形成抗體較鏈區(qū)的一個或多個二硫鍵彼此共價連接，并且W此抗體 重鏈化區(qū)在其N末端具有寡甘氨酸氨基酸序列，和（C)分選酶A
[0239] 并且因而產(chǎn)生雙特異性抗體。
[0240] 如本文中報道的一個方面是用于確定抗原結(jié)合位點的組合的方法，包括W下步驟
[0241] (i)確定多種雙特異性抗體的結(jié)合特異性和/或親和力和/或效應子功能和/或 體內(nèi)半壽期，所述多種雙特異性抗體是通過組合第一多種抗體Fab片段或scFv抗體片段的 每個成員與包含全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈和抗體重鏈化區(qū)多膚的第二多種抗體片段 的每個成員制備的，
[0242] W此第一多種抗體與第一細胞表面分子特異性結(jié)合并且第二多種抗體與第二細 胞表面分子特異性結(jié)合，
[0243] 并且
[0244] (ii)選擇具有合適的結(jié)合特異性和/或親和力和/或效應子功能和/或體內(nèi)半壽 期的雙特異性抗體并且因而確定抗原結(jié)合位點的組合。
[0245] 在一個實施方案中，組合的特征在于；將抗體F油片段或scFv抗體片段和包含全 長抗體重鏈、全長抗體輕鏈和抗體重鏈化區(qū)多膚的抗體片段與分選酶A賠育。
[0246] 在一個實施方案中，F(xiàn)油片段或scFv抗體片段在20個C末端氨基酸殘基內(nèi)包含 氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID N0:01，其中XI可W是任何氨基酸殘基）。
[0247] 在一個實施方案中，單臂抗體片段的全長抗體重鏈和全長抗體輕鏈是同族抗體鏈 并且其可變結(jié)構(gòu)域?qū)Γ╒H和VL)形成與第二表面標記物特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點，全長 抗體重鏈和抗體重鏈化區(qū)多膚通過形成抗體較鏈區(qū)的一個或多個二硫鍵彼此共價連接， 并且抗體重鏈化區(qū)多膚在其N末端具有寡甘氨酸氨基酸序列。
[024引在全部方面的一個實施方案中，抗體F油片段或scFv抗體在20個C末端氨基酸 殘基內(nèi)包含氨基酸序列G"SLPX1TG(SEQ ID N0:02,其中XI可W是任何氨基酸殘基，n = 1、 2或扣。
[0249] 在全部方面的一個實施方案中，抗體Fab片段或scFv抗體在20個C末端氨基酸 殘基內(nèi)包含氨基酸序列GSLPX1TGGSGS(SEQ ID N0:03,其中XI可W是任何氨基酸殘基）。
[0巧0] 在全部方面的一個實施方案中，抗體F油片段或scFv抗體包含氨基酸序列 X2GSLPX1TGGSGS(SEQ ID N0:05,其中XI可W是任何氨基酸殘基），W此X2可W是除G之外 的任何氨基酸殘基。
[0巧1] 在全部方面的一個實施方案中，抗體F油片段或scFv抗體在20個C末端氨基酸 殘基內(nèi)包含氨基酸序列G"SLPX1TGGSGSX3(SEQ ID N0:06,其中XI可W是任何氨基酸殘基， n = 1、2或3)，W此X3是氨基酸序列標簽。
[0252] 在全部方面的一個實施方案中，抗體Fab片段或scFv抗體在20個C末端氨基酸殘 基內(nèi)包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGSGSX3(SEQ ID N0:07,其中XI可W是任何氨基酸殘基）， W此X2可W是除G之外的任何氨基酸殘基并且X3是氨基酸序列標簽。
[0253] 在全部方面的一個實施方案中，抗體重鏈化區(qū)多膚在其N末端包含兩個甘氨酸殘 基。
[0巧4] 在全部方面的一個實施方案中，單臂抗體化區(qū)在其重鏈化區(qū)多膚的N末端包含 氨基酸序列GGCPX4C (SEQ ID NO: 08)，其中X4是S或P。
[0巧日]在全部方面的一個實施方案中，XI是E。
[0巧6] 如本文中報道的一個方面是通過如本文中報道的方法獲得的多特異性結(jié)合分子/ 雙特異性抗體。
[0巧7] -個方面是在其重鏈之一中包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID N0:01，其中XI可W 是任何氨基酸殘基）的多特異性結(jié)合分子/雙特異性抗體。
[025引在一個實施方案中，多特異性結(jié)合分子/雙特異性抗體在其重鏈之一中包含氨基 酸序列GnSLPXlTG(SEQ ID N0:02,其中XI可W是任何氨基酸殘基，n = 1、2或3)。
[0259] 在一個實施方案中，多特異性結(jié)合分子/雙特異性抗體在其重鏈之一中包含氨基 酸序列G"SLPX1TGGCPX4C(SEQ ID N0:09,其中XI可W是任何氨基酸殘基，其中X4可W是S 或 P，n = 1、2 或 3)。
[0260] 在一個實施方案中，多特異性結(jié)合分子/雙特異性抗體在其重鏈之一中包含氨基 酸序列X2GSLPX1TGGCPX4C(SEQ ID NO: 10,其中XI可W是任何氨基酸殘基，其中X4可W是 S或巧，其中X2可W是除G之外的任何氨基酸殘基。
[0261] 在一個實施方案中，XI是E。
[0262] 如本文中報道的一個方面是包含如本文中報道的抗體/多特異性結(jié)合分子的藥 物制劑。
[0263] 如本文中報道的一個方面是如本文中報道的雙特異性抗體/多特異性結(jié)合分子 在制造藥物中的用途。
[0264] 在一個實施方案中，該藥物用于治療癌癥。
[0265] 如本文中報道的一個方面是用于治療患有癌癥的個體的方法，所述方法包括向該 個體施用有效量如本文中報道的雙特異性抗體/多特異性結(jié)合分子。
[0266] 如本文中報道的一個方面是用于摧毀個體中癌細胞的方法，所述方法包括向該個 體施用有效量如本文中報道的雙特異性抗體/多特異性結(jié)合分子。
[0267] 在如本文中報道的全部方面的一個實施方案中，化區(qū)是人化區(qū)或其變體。
[026引在一個實施方案中，人化區(qū)是人IgGl亞類的，或人IgG2亞類的，或人IgG3亞類 的，或人IgG4亞類的。在一個實施方案中，化區(qū)是人IgGl亞類的或人IgG4亞類的人化 區(qū)。
[0269] 在一個實施方案中，人化區(qū)包含至少在W下氨基酸位置228、233、234、235、236、 237、297、318、320、322、329和/或331中一個處天然存在氨基酸殘基向不同殘基的突變，其 中化區(qū)中的殘基根據(jù)K油at的抓索引編號。
[0270] 在一個實施方案中，人化區(qū)包含在第329位置處天然存在氨基酸殘基的突變和 至少一個氨基酸向不同殘基的至少一個其他突變，所述至少一個氨基酸選自包含在第228、 233、234、235、236、237、297、318、320、322和331位置的氨基酸殘基的組，其中化區(qū)中的殘 基根據(jù)K油at的抓索引編號。與未修飾的（野生型化C區(qū)相比，該些特定氨基酸殘基的變 化導致化區(qū)的效應子功能改變。
[0271] 在一個實施方案中，與包含相應野生型IgG化區(qū)的綴合物相比，人化區(qū)針對人 化yriiia、和/或化yRIIA和/或化yRI具有減低的親和力。
[0272] 在一個實施方案中，人化區(qū)中第329位置處的氨基酸殘基用甘氨酸、或精氨酸、或 大到足W摧毀Fc區(qū)內(nèi)部脯氨酸夾層的氨基酸殘基置換。
[0273] 在一個實施方案中，天然存在氨基酸殘基的突變是S228P、E233P、L234A、L235A、 L23祀、N297A、N297D、P329G和/或P331S。在一個實施方案中，如果該化區(qū)屬于人IgGl亞 類，則突變是L234A和L235A，或如果該化區(qū)屬于人IgG4亞類，則突變是S228P和L235E。 在一個實施方案中，該化區(qū)包含突變P329G。
[0274] 通過在化區(qū)中限定的位置組合兩種突變，可W實現(xiàn)化區(qū)相關效應子功能的徹底 減少。
[0275] 對激發(fā)效應子功能的化區(qū)的選擇依賴于多特異性結(jié)合分子/雙特異性抗體的預 期用途。
[0276] 如果想要的用途是功能性中和可溶性祀，則應當選擇不激發(fā)效應子功能的亞類或 變體。
[0277] 如果想要的用途是移除（可溶性）祀，則應當選擇激發(fā)效應子功能的亞類或變體。
[0278] 如果想要的用途是枯抗細胞結(jié)合的祀，則應當選擇不激發(fā)效應子功能的亞類或變 體。
[0279] 如果想要的用途是移除祀呈遞細胞，則應當選擇激發(fā)效應子功能的亞類或變體。
[0280] 可W通過調(diào)節(jié)化區(qū)-化化相互作用影響抗體或抗體化區(qū)綴合物的循環(huán)半壽期。
[0281] 可W通過所謂較鏈區(qū)氨基酸變化/置換實現(xiàn)抗體依賴的細胞介導細胞毒性 (ADCC)和補體依賴的細胞毒性（CDC)的最小化或甚至消除。
[0282] 可W通過所謂較鏈區(qū)氨基酸變化/置換實現(xiàn)經(jīng)典補體級聯(lián)激活的最小化或甚至 消除。
[0283] 抗體或抗體化區(qū)綴合物的循環(huán)半壽期的增加可W通過增加的對新生化受體的結(jié) 合實現(xiàn)，并且導致改進的功效、減少的劑量或施用頻率，或改進的向祀遞送?？贵w或抗體Fc 區(qū)綴合物的循環(huán)半壽期的減少可W通過減少的對新生化受體的結(jié)合實現(xiàn)，并且導致減少 的全身暴露或改進的祀比非祀結(jié)合比例。
[0284] 通常，如本文中報道的方法適用于產(chǎn)生包含野生型化區(qū)或改變的/變體化區(qū)的 抗體化區(qū)綴合物。
[0285] 在一個實施方案中，化區(qū)是人化區(qū)。
[0286] 在一個實施方案中，化區(qū)是"觀念性的"，并且盡管它不實際存在，但是抗體工程師 可W決定待使用的變體化區(qū)。
[0287] 在一個實施方案中，改變編碼抗體化區(qū)綴合物的化區(qū)部分的核酸分W產(chǎn)生編碼 抗體化區(qū)綴合物的變體化區(qū)部分的變體核酸序列。
[028引可W通過本領域已知的多種方法制備編碼抗體化區(qū)綴合物的化區(qū)部分的氨基酸 序列的核酸。該些方法包括，但不限于通過位點定向（或寡核巧酸介導）誘變、PCR誘變和 較早制備的編碼編碼抗體化區(qū)綴合物多膚的DNA的盒誘變來制備。
[0289] 化區(qū)與許多受體或配體相互作用，包括但不限于化受體（例如化Y RI、 FcyRIIA、化yRIIIA)、補體蛋白Clq和其他分子如蛋白A和蛋白G。該些相互作用是多 種效應子功能和下游信號傳導事件必需的，包括但不限于抗體依賴的細胞介導細胞毒性 (ADCC)、抗體依賴性細胞吞瞻作用（ADCP)和補體依賴細胞毒性（CDC)。
[0290] 在一個實施方案中，抗體化區(qū)綴合物（如采用如本文中報道的方法產(chǎn)生的）具有 至少一個或更多個W下特性：減少或消除的效應子功能（ADCC和/或CDC和/或ADCP)、減 少或消除的對化受體的結(jié)合、減少或消除的對Clq的結(jié)合，或減少或消除的毒性。
[0291] 在一個實施方案中，抗體化區(qū)綴合物（如采用如本文中報道的方法產(chǎn)生的）包含 具有至少兩個氨基酸突變、添加或缺失的野生型Fc區(qū)。
[0292] 在一個實施方案中，與包含野生型人化區(qū)的抗體或抗體化區(qū)綴合物相比，抗體化 區(qū)綴合物（如采用如本文中報道的方法產(chǎn)生的）對人化受體（化Y時和/或人補體受體 具有減少的親和力。
[0293] 在一個實施方案中，與包含野生型人化區(qū)的抗體或抗體化區(qū)綴合物相比，抗體化 區(qū)綴合物（如采用如本文中報道的方法產(chǎn)生的）包含對人化受體（化Y時和/或人補體 受體具有減少的親和力的化區(qū)。
[0294] 在一個實施方案中，抗體化區(qū)綴合物（如采用如本文中報道的方法產(chǎn)生的）對 化Y RI、化Y RII和/或化Y RIIIA至少之一具有減少的親和力。在一個實施方案中，對 化Y RI和化Y RIIIA的親和力減少。在一個實施方案中，對化Y RI、化Y RII和化Y RIIIA 的親和力減少。
[0295] 在一個實施方案中，對化Y RI、化Y RIIIA和Clq的親和力減少。
[0296] 在一個實施方案中，對化Y RI、化Y RII、化Y RIIIA和Clq的親和力減少。
[0297] 在一個實施方案中，與包含野生型化區(qū)的抗體或抗體化綴合物相比，抗體化區(qū) 綴合物（如采用如本文中報道的方法產(chǎn)生的）具有減少的ADCC。在一個實施方案中，與包 含野生型化區(qū)的化區(qū)融合多膚或綴合物誘導的ADCC相比，ADCC減少至少20%。
[029引在一個實施方案中，與包含野生型化區(qū)的抗體化區(qū)綴合物相比，抗體化區(qū)綴合 物（如采用如本文中報道的方法產(chǎn)生的）具有降低或消除的化區(qū)誘導的ADCC和CDC。
[0299] 在一個實施方案中，與包含野生型化區(qū)的OA-Fc區(qū)綴合物相比，抗體化區(qū)綴合物 (如采用如本文中報道的方法產(chǎn)生的）具有降低的ADCC、CDC和ADCP。
[0300] 在一個實施方案中，抗體化區(qū)綴合物在化區(qū)中包含至少一個氨基酸置換，所述氨 基酸置換選自包含 S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、P329G、和 P331S 的 組。
[0301] 在一個實施方案中，野生型化區(qū)是人IgGl化區(qū)或人IgG4化區(qū)。
[0302] 在一個實施方案中，除第329位置處的氨基酸殘基脯氨酸突變之外，抗體化區(qū)在 化區(qū)中包含與增加的抗體化區(qū)綴合物穩(wěn)定性相關的至少一個其他氨基酸殘基添加、突變 或缺失。
[0303] 在一個實施方案中，如果化區(qū)屬于IgG4亞類，則化區(qū)中的其他氨基酸殘基添加、 突變或缺失在化區(qū)的第228和/或235位置處。在一個實施方案中，第228位置處的氨基 酸殘基絲氨酸和/或第235位置處的氨基酸殘基亮氨酸由另一種氨基酸置換。在一個實施 方案中，抗體化區(qū)綴合物在第228位置處包含脯氨酸殘基（絲氨酸殘基至脯氨酸殘基的突 變）。在一個實施方案中，抗體化區(qū)綴合物在第235位置處包含谷氨酸殘基（亮氨酸殘基 至谷氨酸殘基的突變）。
[0304] 在一個實施方案中，化區(qū)包含H個氨基酸突變。在一個實施方案中，該H個氨基 酸突變是 P329G、S228P 和 L23祀突變（P329G/SPLE)。
[0305] 在一個實施方案中，如果化區(qū)屬于IgGl亞類，則化區(qū)中的其他氨基酸殘基添加、 突變或缺失在化區(qū)的第234和/或235位置處。在一個實施方案中，第234位置處的氨基 酸殘基亮氨酸和/或第235位置處的氨基酸殘基亮氨酸突變成另一種氨基酸。
[0306] 在一個實施方案中，化區(qū)在第234位置處包含氨基酸突變，其中亮氨酸氨基酸殘 基突變成丙氨酸氨基酸殘基。
[0307] 在一個實施方案中，化區(qū)在第235位置處包含氨基酸突變，其中亮氨酸氨基酸殘 基突變成丙氨酸氨基酸殘基。
[030引在一個實施方案中，化區(qū)包含在第329位置處的氨基酸突變，其中脯氨酸氨基酸 殘基突變成甘氨酸氨基酸殘基、在第234位置處的氨基酸突變，其中亮氨酸氨基酸殘基突 變成丙氨酸氨基酸殘基，和在第235位置處的氨基酸突變，其中亮氨酸氨基酸殘基突變成 丙氨酸氨基酸殘基。
[0309] 具有對化化增加的親和力的化區(qū)變體具有較長血清半壽期，并且該類分子將在 治療哺乳動物的方法中具有可用應用，其中需要所施用的抗體化區(qū)綴合物的長久全身性 半壽期，例如，W治療慢性疾病或病癥。
[0310] 具有降低的化化結(jié)合親和力的抗體化區(qū)綴合物具有較短血清半壽期，并且該類 分子將在治療哺乳動物的方法中具有可用應用，其中期望所施用的抗體Fc區(qū)綴合物的較 短全身性半壽期，例如，W避免毒性副作用或用于體內(nèi)診斷性成像應用。具有降低的化化 結(jié)合親和力的化區(qū)融合多膚或綴合物較不可能穿過胎盤，并且因此可W用于治療懷孕女 性中的疾病或病癥。
[0311] 在一個實施方案中，具有對化化改變的結(jié)合親和力的化區(qū)是在W下一個多個 氨基酸位置具有氨基酸改變的化區(qū)；238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、 305、307、309、311、312、317、：340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、 424、433、似4、435、436、439 和 / 或 447。
[0312] 在一個實施方案中，該化區(qū)是在氨基酸位置252、253、254、255、288、309、386、 388、400、415、433、435、436、439和/或447具有一個或多個氨基酸改變的化區(qū)。
[0313] 在一個實施方案中，顯示增加的對化化的結(jié)合的化區(qū)在氨基酸位置238、256、 265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424和 /或434包含一個或多個氨基酸改變。
[0314] 在一個實施方案中，化區(qū)是IgGl亞類的化區(qū)并且包含氨基酸突變P329G和/或 L234A 和 L235A。
[0315] 在一個實施方案中，化區(qū)是IgG4亞類的化區(qū)并且包含氨基酸突變P329G和/或 S228P 和 L235E。
[0316] 在一個實施方案中抗體化區(qū)在第一重鏈化區(qū)多膚中包含突變T366W并在第二重 鏈化區(qū)多膚中包含突變T366S、L368A和Y407V，其中根據(jù)K油at的抓索引編號。
[0317] 在一個實施方案中抗體化區(qū)在第一重鏈化區(qū)多膚中包含突變S354C并在第二重 鏈化區(qū)多膚中包含突變Y349C。 峽1引 體巧分洗酶A的酶化綴合
[0319] 可W通過使用分選酶A獲得包含單臂抗體（OA-Fc)和一個或多個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域 的雙特異性抗體。
[0320] 許多革蘭氏陽性細菌使用分選酶W將多種表面蛋白（包括毒力因子）共價地 銷定至它們的細胞壁（膚聚糖）上。分選酶是胞外膜結(jié)合酶。野生型金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)分選酶A(SdA)是具有N末端跨膜區(qū)的206個氨基酸的多膚。 在第一步驟中，分選酶A識別含有LPX1TG氨基酸序列基序的底物蛋白并且借助活性位點 切S切割T虹和Gly之間的醜胺鍵。該種膚切割反應產(chǎn)生分選酶A硫醋中間體。在第二步 驟中，通過親核性攻擊含有寡甘氨酸的第二底物多膚（對應于金黃色葡萄球菌中膚聚糖的 五甘氨酸單元）的氨基，消除硫醋醜基-酶中間體，導致共價連接的細胞壁蛋白和分選酶A 再生。在不存在寡甘氨酸親核體的情況下，醜基-酶中間體由水分子水解。
[0321] 分選酶介導的連接/綴合已經(jīng)開始用于多種蛋白質(zhì)工程和生物綴合目 的。該種新技術能夠?qū)⑻烊缓头翘烊还倌軋F引入加 LPX1TG標簽的重組或化學合 成的多膚。例子包括共價接合寡甘氨酸衍生化聚合物（例如PEG)、英光團、維生素 (例如生物素和葉酸）脂質(zhì)、糖、核酸、合成膚和蛋白質(zhì)（例如GFP) (Ts址i ji，S.和 Nagamune, T. ,ChemBio畑em 10(2009)787-798;Popp,M. W.-L.和 Ploe曲，H. L. ,Angew. Chem. Int. Ed. 50 (2011) 5024-5032)。
[0322] 已經(jīng)顯示氨基組分的H甘氨酸和甚至二甘氨酸基序足夠用于SrtA介導的連接步 驟（Clan 巧,K.W.等人，P 巧 tide Science 94(2010)385-396)。
[032引為了酶促綴合，可W使用缺少跨膜區(qū)的可溶性截短分選酶A(SdA;金黃 色葡萄球菌SrtA的氨基酸殘基60-206) (Ton-That, H.等人，Proc.化tl. Acad. Sci.USA 96(1999) 12424-12429;Ilangovan，H.等人，Proc.化 tl.Acad.Sci.USA 98 (2001) 6056-6061)。可W在大腸桿菌中產(chǎn)生截短的可溶性分選酶A變體。
[0324] 至少在其N末端之一包含寡甘氨酸佑m，m = 2、或3、或4、或W的抗體化區(qū)可W 從真核細胞（例如肥K293細胞、C冊細胞）表達并且從其上清液純化。
[0325] 在一條多膚鏈的C末端包含SrtA識別基序的結(jié)合實體（例如單鏈抗原結(jié)合多 膚如scFv、scF油或da巧in,或多鏈抗原結(jié)合多膚如dsFv或F油）可W從真核細胞（例如 肥K293細胞、C冊細胞）表達并且從其上清液純化。
[0326] 如本文中報道的一個方面是通過如下方式獲得的雙特異性抗體；使用酶分選酶A 將抗原結(jié)合多膚/結(jié)構(gòu)域（例如scFv或Fab)與單臂抗體變體（OA-Fc)綴合，其中分選酶識 別序列位于單鏈抗原結(jié)合多膚（例如scFv、scF油或da巧in)的C末端或多鏈抗原結(jié)合復 合體（例如dsFv或F油）的一條多膚鏈的C末端，并且其中二甘氨酸或H甘氨酸基序位于 單臂抗體變體（OA-Fc-Gm ;m = 2或3)的Fc-鏈的N末端處?？蒞通過使用（i)在其C末 端區(qū)域包含氨基酸序列G"SLPX1TG (SEQ IDN0:02,其中XI可W是任何氨基酸殘基，其中n = 1、2或3)的多膚、（ii)在其N末端包含寡甘氨酸的重鏈化區(qū)多膚和（iii)分選酶A，在酶 促綴合過程中W高產(chǎn)率獲得包含抗體F油片段（0A-化?F油）或scFv抗體片段（0A-化? scFv)的單臂抗體F油或scFv綴合物和單臂抗體（OA-Fc)。
[0327] 采用該種試劑組合，可W減少或甚至消除正常情況下在反應時間增加時出現(xiàn)的
[032引 i)將產(chǎn)物綴合物內(nèi)部的LPX1TG氨基酸序列識別為底物的逆反應，和/或
[0329] ii)封端水解多膚片段（通過由水而不由Gm-抗體化區(qū)親核體切割硫代醜基-結(jié) 合實體分選酶A中間體所產(chǎn)生的LPX1TG識別序列被切去或不切去的多膚）的產(chǎn)生。
[0330] 已經(jīng)測試了 C末端和N末端氨基酸序列組合的不同組合。
[0331] 更詳細地，作為示例性結(jié)合實體，使用抗體F油片段，并且作為示例性抗體化區(qū)， 使用單臂抗體化區(qū)（OA-化區(qū)=一對全長抗體重鏈及其同族輕鏈和重鏈抗體化區(qū)多膚）。 使用示例性轉(zhuǎn)膚酶分選酶A分別在抗體F油片段VH-CH1重鏈的C末端和在OA-Fc區(qū)N末 端綴合H種不同序列。獲得9種不同綴合物。在不同時間點確定偶聯(lián)反應的進程/效率。 為此目的，通過SDS-PAGE分析轉(zhuǎn)膚反應的等分試樣。從凝膠W密度測定方式估計連接的效 率。下表1中給出結(jié)果。 防33引 表1.
[0333]
【權(quán)利要求】
1. 用于產(chǎn)生雙特異性抗體的方法，包括步驟：孵育 (i) 在20個C末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID N0:01，其中XI可以 是任何氨基酸殘基）的抗體Fab片段或scFv抗體， (ii) 包含全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈，和抗體重鏈Fc區(qū)多肽的單臂抗體片段， 以此全長抗體重鏈和全長抗體輕鏈是彼此互補的同族抗體鏈并且其可變結(jié)構(gòu)域?qū)Γ╒H 和VL)形成抗原結(jié)合位點， 以此全長抗體重鏈和抗體重鏈Fc區(qū)多肽通過形成抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個二硫鍵彼 此共價連接，并且 以此抗體重鏈Fc區(qū)多肽在其N末端具有寡甘氨酸Gjmi 2、或3、或4、或5)氨基酸序 列， 和 (iii) 分選酶A 并且因而產(chǎn)生雙特異性抗體。
2. 用于產(chǎn)生雙特異性抗體的方法，包括以下步驟 (i)確定存在于含有細胞的樣品中的細胞表面標記物并且選擇其至少第一細胞表面標 記物和第二細胞表面標記物， (11)孵育（4在20個(：末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨基酸序列^^1了6(3￡〇10勵:01，其 中XI可以是任何氨基酸殘基）的抗體Fab片段或scFv抗體，以此Fab片段或scFv抗體與 第一細胞表面標記物或其配體特異性結(jié)合，（b)包含全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈，和抗體 重鏈Fc區(qū)多肽的單臂抗體片段，以此全長抗體重鏈和全長抗體輕鏈是彼此互補的同族抗 體鏈并且其可變結(jié)構(gòu)域?qū)Γ╒H和VL)形成與第二細胞表面標記物或其配體特異性結(jié)合的抗 原結(jié)合位點，以此全長抗體重鏈和抗體重鏈Fc區(qū)多肽通過形成抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個 二硫鍵彼此共價連接，并且以此抗體重鏈Fc區(qū)多肽在其N末端具有寡甘氨酸Gm(m = 2、或 3、或4、或5)氨基酸序列，和（c)分選酶A 并且因而產(chǎn)生雙特異性抗體。
3. 用于確定抗原結(jié)合位點的組合的方法，包括以下步驟 (i) 確定通過如下方式制備的多種雙特異性抗體的結(jié)合特異性和/或選擇性和/或親 和力和/或效應子功能和/或體內(nèi)半壽期：組合（a)第一多種抗體Fab片段或scFv抗體片 段的每個成員，以此每個成員在20個C末端氨基酸殘基內(nèi)包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID NO: 01，其中XI可以是任何氨基酸殘基），以此Fab片段或scFv抗體與第一表位或抗原特 異性結(jié)合，與（b)多種包含全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈，和抗體重鏈Fc區(qū)多肽的單臂抗體 片段的每個成員，以此全長抗體重鏈和全長抗體輕鏈是彼此互補的同族抗體鏈并且其可變 結(jié)構(gòu)域?qū)Γ╒H和VL)形成與第二表位或抗原特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位點，以此全長抗體重 鏈和抗體重鏈Fc區(qū)多肽通過形成抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個二硫鍵彼此共價連接，并且以 此抗體重鏈Fc區(qū)多肽在其N末端具有寡甘氨酸Gjm = 2、或3、或4、或5)氨基酸序列，和 (c)分選酶A組合 并且 (ii) 選擇具有合適的結(jié)合特異性和/或選擇性和/或親和力和/或效應子功能和/或 體內(nèi)半壽期的雙特異性抗體并且因而確定抗原結(jié)合位點的組合。
4. 雙特異性抗體，其通過根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法獲得。
5. 雙特異性抗體，在其重鏈之一中包含氨基酸序列LPX1TG(SEQ ID N0:01，其中XI可 以是任何氨基酸殘基）。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求4或5中任一項所述的 抗體，特征在于Fc區(qū)包含在第329位置處天然存在氨基酸殘基的突變和至少一個氨基酸殘 基向不同殘基的至少一個其他突變，所述至少一個氨基酸殘基選自包含在第228、233、234、 235、236、237、297、318、320、322和331位置處的氨基酸殘基的組，其中Fc區(qū)中的殘基根據(jù) Kabat的EU索引編號。與未修飾的（野生型）Fc區(qū)相比，這些特定氨基酸殘基的變化導致 Fc區(qū)的效應子功能改變。
7. 藥物制劑，包含根據(jù)權(quán)利要求4或權(quán)利要求5所述的雙特異性抗體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4或權(quán)利要求5所述的雙特異性抗體在制造藥物中的用途。
【文檔編號】C07K16/46GK104395339SQ201380033554
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2013年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月27日
【發(fā)明者】S·芬, E·科佩茨基, G·蒂芬塔勒 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司