與gp41蛋白結(jié)合的多肽、多肽芯片、其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一組與gp41蛋白結(jié)合的多肽、多肽芯片、其制備方法和應(yīng)用。該組多肽與gp41蛋白有很強(qiáng)的特異性結(jié)合能力，能夠?qū)崿F(xiàn)了對gp41蛋白在低濃度時的檢測。該多肽芯片利用表面等離激元共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)原理制備而成，當(dāng)所有該組多肽分子均與目標(biāo)發(fā)生結(jié)合時，判斷gp41蛋白存在，減少了實驗過程中假陽性結(jié)果。此外，本發(fā)明還提供包含該組多肽的藥物組合物。本發(fā)明在HIV感染引起的疾病的診斷方面有重要應(yīng)用價值。
【專利說明】與gp41蛋白結(jié)合的多肽、多肽芯片、其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及與gp41蛋白結(jié)合的多肽、多肽芯片、其 制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 獲得性免疫缺陷綜合征（Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)是因為 感染人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV)而導(dǎo)致免疫缺陷，并發(fā)一 系列機(jī)會性感染及腫瘤等的綜合征。它是一類流行較廣，致死率高的疾病。在當(dāng)前仍然缺 少普適的治療方法的情況下，盡早地發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒，及時地診斷病癥，阻斷傳播途 徑,對于減少其危害有著重要的意義。
[0003] HIV可以感染多種細(xì)胞，包括在表面表達(dá)⑶4分子的T4淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和 樹突狀細(xì)胞等。⑶4分子是HIV入侵細(xì)胞的受體，而糖蛋白gp41介導(dǎo)了 HIV病毒與⑶4細(xì) 胞的融合，從而使HIV進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。以gp41分子為藥物設(shè)計靶點，可能是實現(xiàn)對HIV有效 檢測與治療獲得性免疫缺陷綜合征的一種途徑。
[0004] 基于gp41的分子結(jié)構(gòu)，目前已經(jīng)開發(fā)出了多種相關(guān)的抑制劑與單克隆抗體，并有 些基于這些抗體的芯片產(chǎn)生。但是目前用于檢測gp41蛋白的單克隆抗體芯片存在以下問 題：
[0005] (1)使用的單克隆抗體與gp41蛋白的相互作用力較弱，造成對gp41蛋白的檢出限 較低，傳統(tǒng)的gp41單克隆抗體制備的芯片檢出限高于200nM ;
[0006] (2)由于僅基于一種或少數(shù)幾種gp41單克隆抗體的陽性結(jié)果進(jìn)行判斷，導(dǎo)致實驗 過程中較多假陽性結(jié)果的產(chǎn)生；
[0007] (3) gp41單克隆抗體芯片很容易因抗體的構(gòu)象變化導(dǎo)致抗體失活，芯片失效；
[0008] (4) gp41單克隆抗體的成本較高，導(dǎo)致gp41單克隆抗體芯片的成本難以降低，大 規(guī)模應(yīng)用受到限制。
[0009] 因此，針對gp41蛋白，開發(fā)出檢出限低、特異性高、性能穩(wěn)定及成本較低的芯片， 對于HIV病毒的檢測具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明人經(jīng)過大量實驗和創(chuàng)造性勞動，得到了一組多肽，并發(fā)現(xiàn)這組多肽與gp41 蛋白有很強(qiáng)的特異性結(jié)合能力，能夠制備成多肽芯片或藥物組合物等，應(yīng)用于診斷或輔助 性診斷HIV感染引起的疾病。
[0011] 本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0012] 在第一方面，本發(fā)明提供一種與gp41蛋白結(jié)合的多肽，所述多肽具有選自SEQ ID NO :1?7所示的氨基酸序列：
[0013] (l)GGLDAIRAQQDL (SEQ ID NO ：1)；
[0014] (2)GGSNDSLRQIWNDTTWMRWRDRI (SEQ ID NO :2);
[0015] (3)GGIDSLIRRSQN (SEQ ID NO ：3)；
[0016] (4) GGffRRLDSLCLFSYDDLDRLL (SEQ ID NO ：4)；
[0017] (5) GGTDIVRLLGDDGffRALDY (SEQ ID NO ：5)；
[0018] (6)GGSQRLDNS (SEQ ID NO :6);和
[0019] (7)GGNNLLDAIRAQQDL (SEQ ID NO ：7)〇
[0020] 所述多肽可以通過人工化學(xué)合成制得，其與gp41蛋白有很強(qiáng)的特異性結(jié)合能力。
[0021] 在第二方面，本發(fā)明提供一種多肽芯片，其包括固定于固相載體上的、能夠與gp41 蛋白結(jié)合的多肽，所述多肽具有選自SEQ ID NO :1?7所示的氨基酸序列。
[0022] 所述多肽芯片上的多肽與gp41蛋白有很強(qiáng)的特異性結(jié)合能力，可以用于gp41蛋 白的檢測，并據(jù)此判斷HIV病毒的感染情況。
[0023] 在本發(fā)明一個實施方案中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :1?7所示，即包 含上述七條多肽。
[0024] 在第三方面，本發(fā)明提供一種如第二方面所述的多肽芯片的制備方法，利用表面 等離激元共振（Surface Plasmon Resonance, SPR)原理，所述方法包括：
[0025] (1)對固相載體進(jìn)行預(yù)處理，形成備用固相載體；
[0026] (2)將稀釋好的所述多肽點樣到所述備用固相載體上。
[0027] 在本發(fā)明一個實施方案中，所述步驟（1)具體包括：
[0028] (Ia)在SPR芯片表面通過共價鍵，修飾上一層含羧基的硫醇分子自組裝層；
[0029] (Ib)以乙醇清洗SPR芯片表面兩次；
[0030] (Ic)使用碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺活化SPR芯片表面，使醇分子自組裝層上 的羧基形成不穩(wěn)定的琥珀酰亞胺酯；
[0031] (Id)以乙醇清洗SPR芯片表面兩次。
[0032] 在本發(fā)明一個實施方案中，所述步驟（2 )還包括對所述多肽進(jìn)行預(yù)處理，及點樣后 的處理；具體地，所述步驟（2)包括：
[0033] (2a)將鏈霉親和素與N端修飾生物素的多肽分子按摩爾比為1 :1的比例混合，且 混合后鏈霉親和素的質(zhì)量濃度為lmg/mL，形成鏈霉親和素-多肽混合液；
[0034] (2b)將0· 2 μ L鏈霉親和素-多肽混合液滴在SPR芯片表面，以gp41的單克隆抗 體作為陽性對照，取〇. 2 μ L滴在SPR芯片表面；
[0035] (2c)以乙醇胺封閉表面未參與反應(yīng)的琥珀酰亞胺酯與雙硫醇上的羧基；
[0036] (2d)以乙醇清洗SPR芯片表面兩次；
[0037] (2e)將SPR芯片用微流控膜封裝，裝入SPR儀器中；
[0038] (2f)以0· 5% (體積比）磷酸與I X PBS (磷酸鹽緩沖液)反復(fù)交替清洗SPR芯片表 面，直到SPR芯片表面的固定相SPR信號保持平穩(wěn)為止；
[0039] (2g)以IXPBS作為解離相，以0. 5%(體積比）磷酸作為重生液，測試SPR芯片對 gp41的IXPBS溶液的響應(yīng)。
[0040] 本發(fā)明還提供一種多參數(shù)檢測樣品中g(shù)p41蛋白的方法，包括如下步驟：
[0041] (1)同時記錄所述多肽芯片上所設(shè)計的多肽在通過樣品時的SPR信號；
[0042] (2)當(dāng)七條多肽（SEQ ID NO :1?7)都能產(chǎn)生吸附峰信號時，證明樣品中存在 gp41。
[0043] 本發(fā)明提供的與gp41蛋白有強(qiáng)相互作用的多肽序列，其一級結(jié)構(gòu)序列中同源性 較低，可能對應(yīng)于gp41蛋白表面不同的結(jié)合位點。只有當(dāng)七條多肽分子均與目標(biāo)發(fā)生結(jié)合 時，才判斷gp41蛋白的存在，這在一定程度上減少了實驗過程中假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。
[0044] 在第四方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如第一方面所述 的多肽，還可以包括任選的可藥用載體。
[0045] 在第五方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的多肽、如第二方面所述的多肽芯 片或如第四方面所述的藥物組合物在制備用于診斷或輔助性診斷HIV感染引起的疾病的 藥物中的應(yīng)用。
[0046] 本發(fā)明的有益效果為：
[0047] (1)本發(fā)明提供的多肽與gp41蛋白的親和力強(qiáng)，實現(xiàn)了對gp41蛋白在低濃度時的 檢測，基于所述多肽制備的多肽芯片可以檢出50nM的gp41蛋白，而傳統(tǒng)的gp41單克隆抗 體制備的芯片檢出限高于200nM，本發(fā)明多肽芯片可輔助臨床準(zhǔn)確診斷HIV相關(guān)疾??；
[0048] (2)本發(fā)明提供的多肽芯片只有當(dāng)七條多肽分子均與目標(biāo)發(fā)生結(jié)合時，才判斷 gp41蛋白的存在，這在一定程度上減少了實驗過程中假陽性結(jié)果的產(chǎn)生；
[0049] (3)本發(fā)明提供的多肽相比gp41單克隆抗體的穩(wěn)定性高，不會發(fā)生由于構(gòu)象變化 導(dǎo)致的失活，芯片的效期更長；
[0050] (4)本發(fā)明提供的多肽相比gp41單克隆抗體成本更低，可以大規(guī)模應(yīng)用；
[0051] (5)本發(fā)明提供的多肽對于gp41相關(guān)疾病的多肽類先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)和預(yù)測，提 供藥物母核的設(shè)計模型，并為已有的藥物結(jié)構(gòu)改造提供參考依據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)；
[0052] (6)本發(fā)明提供的靶向gp41分子的多肽序列可以被應(yīng)用于通過酶聯(lián)免疫吸附方 法、表面等離激元共振技術(shù)、石英振動微天平技術(shù)分析、飛行時間質(zhì)譜及等溫滴定微量熱檢 測gp41 ;此外，本發(fā)明提供的靶向gp41分子的多肽可以經(jīng)過量子點修飾、熒光素基團(tuán)修飾 及辣根過氧化物酶修飾等用于酶聯(lián)免疫吸附、熒光發(fā)射光譜及紫外吸收光譜等分析方法中 檢測gp41分子。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0053] 圖1為基于本發(fā)明開發(fā)的多肽41-1?41-7、24_5及gp41單克隆抗體與gp41的 結(jié)合解離過程的SPR曲線。其中：圖Ia為gp41單克隆抗體與gp41結(jié)合解離過程的SPR曲 線，已扣除陰性對照24-5對gp41的SPR信號；圖Ib為24-5、鏈霉親和素（SA)共混合體系 與gp41結(jié)合解離過程的SPR曲線；圖Ic為41-1、SA共混合體系與gp41結(jié)合解離過程的 SPR曲線，已扣除陰性對照24-5對gp41的SPR信號；圖Id為41-2、SA共混合體系與gp41 結(jié)合解離過程的SPR曲線，已扣除陰性對照24-5對gp41的SPR信號；圖Ie為41-3、SA共 混合體系與gp41結(jié)合解離過程的SPR曲線，已扣除陰性對照24-5對gp41的SPR信號；圖 If為41-4、SA共混合體系與gp41結(jié)合解離過程的SPR曲線，已扣除陰性對照24-5對gp41 的SPR信號；圖Ig為41-5、SA共混合體系與gp41結(jié)合解離過程的SPR曲線，已扣除陰性對 照24-5對gp41的SPR信號；圖Ih為41-6、SA共混合體系與gp41結(jié)合解離過程的SPR曲 線，已扣除陰性對照24-5對gp41的SPR信號；圖Ii為41-7、SA共混合體系與gp41結(jié)合解 離過程的SPR曲線，已扣除陰性對照24-5對gp41的SPR信號。其中，" 表示gp41濃度 為12. 9nM對應(yīng)的曲線；" _ "表示gp41濃度為25. 4nM對應(yīng)的曲線；"*，，表示gp41濃度 為50. 7nM對應(yīng)的曲線；表示gp41濃度為IOlnM對應(yīng)的曲線；"?，，表示gp41濃度為 203nM對應(yīng)的曲線。
[0054] 圖2為基于本發(fā)明開發(fā)的多肽41-1?41-7及gp41單克隆抗體與4. 2 μ g/mL的 gp41和p24解離過程中的平衡態(tài)下吸附量的SPR相應(yīng)值，其中，" _ "表示4. 2 μ g/mL p24 對應(yīng)的柱狀圖；" O "表示4. 2 μ g/mL gp41對應(yīng)的柱狀圖。

【具體實施方式】
[0055] 下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理 解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用 試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0056] 實施例1 :檢測溶液中的gD41與芯片表面多狀的結(jié)合解離動力學(xué)討稈
[0057] 1、按照表1所示的序列合成多肽，實驗中按照需要稀釋成合適的濃度。
[0058] 表1合成的多肽
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 一種與gp41蛋白結(jié)合的多肽，其特征在于，所述多肽具有選自SEQ ID NO :1?7所 示的氨基酸序列。
2. -種多肽芯片，其特征在于，所述多肽芯片包括固定于固相載體上的、能夠與gp41 蛋白結(jié)合的多肽，所述多肽具有選自SEQ ID NO :1?7所示的氨基酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽芯片，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :1?7所示。
4. 一種如權(quán)利要求2或3所述的多肽芯片的制備方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 對固相載體進(jìn)行預(yù)處理，形成備用固相載體； (2) 將稀釋好的所述多肽點樣到所述備用固相載體上。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（1)具體包括： (la) 在SPR芯片表面通過共價鍵，修飾上一層含羧基的硫醇分子自組裝層； (lb) 以乙醇清洗SPR芯片表面兩次； (lc) 使用碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺活化SPR芯片表面，使醇分子自組裝層上的羧 基形成不穩(wěn)定的琥珀酰亞胺酯； (ld) 以乙醇清洗SPR芯片表面兩次。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（2)還包括對所述多肽進(jìn)行 預(yù)處理，及點樣后的處理；具體地，所述步驟（2)包括： (2a)將鏈霉親和素與N端修飾生物素的多肽分子按摩爾比為1 :1的比例混合，且混合 后鏈霉親和素的質(zhì)量濃度為lmg/mL，形成鏈霉親和素-多肽混合液； (2b)將0. 2 μ L鏈霉親和素-多肽混合液滴在SPR芯片表面，以gp41的單克隆抗體作 為陽性對照，取0. 2 μ L滴在SPR芯片表面； (2c)以乙醇胺封閉表面未參與反應(yīng)的琥珀酰亞胺酯與雙硫醇上的羧基； (2d)以乙醇清洗SPR芯片表面兩次； (2e)將SPR芯片用微流控膜封裝，裝入SPR儀器中； (2f)以0. 5% (體積比）磷酸與1 XPBS反復(fù)交替清洗SPR芯片表面，直到SPR芯片表面 的固定相SPR信號保持平穩(wěn)為止； (2g)以1XPBS作為解離相，以0. 5%(體積比）磷酸作為重生液，測試SPR芯片對gp41 的1 XPBS溶液的響應(yīng)。
7. -種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含如權(quán)利要求1所述的多肽。
8. -種如權(quán)利要求1所述的多肽、如權(quán)利要求2或3所述的多肽芯片或如權(quán)利要求7 所述的藥物組合物在制備用于診斷或輔助性診斷HIV感染引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K7/08GK104292303SQ201310298420
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】王琛, 王晨軒, 王艷梅, 朱勁松, 楊延蓮 申請人:國家納米科學(xué)中心