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一種凈化三聚氰胺的層析柱及含有該層析柱的試劑盒及利用該試劑盒凈化三聚氰胺的方法

文檔序號:3483360閱讀:259來源:國知局
一種凈化三聚氰胺的層析柱及含有該層析柱的試劑盒及利用該試劑盒凈化三聚氰胺的方法
【專利摘要】本發(fā)明為一種用于牛奶、奶粉和雞蛋等動物源性食品中三聚氰胺殘留樣品凈化的試劑盒,由凈化三聚氰胺的免疫親和層析柱,淋洗液,洗脫液,再生液,平衡保存液組成;該凈化三聚氰胺的免疫親和層析柱裝載的吸附劑是由固相載體和與其偶聯(lián)的三聚氰胺多克隆抗體組成;所述三聚氰胺多克隆抗體是以三聚氰胺半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原得到的;所述三聚氰胺半抗原是三聚氰胺結(jié)構(gòu)類似物4,6-二氨基-1,3,5-三嗪-2-乙酸。本發(fā)明的凈化方法結(jié)合色譜法或者色譜串聯(lián)質(zhì)譜法高效檢測三聚氰胺的含量,具有高選擇性,且方法操作簡單,凈化效果好,避免雜質(zhì)對測定結(jié)果產(chǎn)生的干擾,免疫親和色譜柱可重復(fù)使用,降低分析成本和環(huán)境污染。
【專利說明】一種凈化三聚氰胺的層析柱及含有該層析柱的試劑盒及利用該試劑盒凈化三聚氰胺的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種三聚氰胺免疫親和色譜柱的制備和使用方法,屬于免疫親和層析及三聚氰胺檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]三聚氰胺(Melamine)(化學式:C3H6N6),俗稱密胺、蛋白精,IUPAC命名為“ 1,3,5-三嗪-2,4,6-三氨基”,是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物,被用作化工原料。它是白色單斜晶體,幾乎無味,微溶于水(3.lg/L常溫),可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶等,不溶于丙酮、醚類、對身體有害,不可用于食品加工或食品添加物。
[0003]三聚氰胺是制造三聚氰胺甲醛的原料。該樹脂常用于制造日用器皿、裝飾貼面板、織物整理劑等,在日常生活中最常見的應(yīng)用是塑料碗碟。這類器皿的物理性質(zhì)非常類似陶瓷,堅硬不變形但又不像陶瓷那樣易碎。而且標有“不可以在微波爐中使用”的警示,因為三聚氰胺甲醛加熱超過120°C后有可能散發(fā)毒性。三聚氰胺還可以與乙醚配合作紙張?zhí)幚睚RU,在一些涂料中作交聯(lián)劑,以及阻燃化學處理劑等。
[0004]三聚氰胺本身為低毒性,三聚氰胺對大鼠的半數(shù)致死量為每千克3248mg。一般成年人身體會排出大部分的三聚氰胺,不過如果與三聚氰酸并用,會形成無法溶解的氰尿酸三聚氰胺,造成嚴重的腎結(jié)石。已經(jīng)有報道稱,三聚氰胺在人體的消化過程中,特別是在胃酸的作用下,自身即可能部分轉(zhuǎn)化為三聚氰酸,而與未轉(zhuǎn)化部分形成結(jié)晶。一項毒物學研究也證實回收的受污染寵物飼料中,三聚氰酸與三聚氰胺并用,是造成貓嚴重腎衰竭的主因。長期攝取三聚氰胺可能造成生殖能力損害、膀胱或腎結(jié)石、膀胱癌等。
[0005]食品工業(yè)中常常需要測定食品的蛋白質(zhì)含量,由于直接測量蛋白質(zhì)技術(shù)上比較復(fù)雜,所以常用一種叫做凱氏定氮法的方法,通過測定氮原子的含量來間接推算食品中蛋白質(zhì)的含量。由于三聚氰胺(含氮量66%)與蛋白質(zhì)(平均含氮量16%)相比含有更高比例的氮原子,所以被一些造假者利用,添加在食品中以造成食品蛋白質(zhì)含量較高的假象,從而造成諸如2007年美國寵物食品污染事件和2008年中國毒奶粉事件等嚴重的食物安全事故。
[0006]2007年3月中旬以來,美國發(fā)生4000多起貓、狗等寵物死亡事件,被認定是寵物食品中含有的三聚氰胺所致。2008年的三聚氰胺奶粉事件中,約30萬嬰幼兒受到影響,有6例死亡報道。這一事件發(fā)生之后,我國政府對食品中的三聚氰胺污染進行了嚴格的監(jiān)管,但仍不時曝出有奶粉或飼料產(chǎn)品檢出三聚氰胺陽性。2009年末,上海市食品安全聯(lián)席會議辦公室公布消息稱上海熊貓乳品有限公司由于涉嫌生產(chǎn)和銷售含三聚氰胺的乳制品而被監(jiān)管部門依法查處。就在上述消息發(fā)布的三周前,陜西金橋乳業(yè)有限公司也被相關(guān)部門查出5.25噸問題奶粉,其中11袋275公斤奶粉的三聚氰胺含量超標。2010年初,貴州衛(wèi)生廳發(fā)布了經(jīng)檢測后發(fā)現(xiàn)三聚氰胺含量超標的食品“黑名單”,包括來自遼寧和河北的兩個廠家生的冰棒和山東某乳品公司的牛奶。2011年4月,重慶市公安局查獲了一批重達26噸由內(nèi)蒙古某乳業(yè)公司供給重慶某雪糕生產(chǎn)商的三聚氰胺超標的原料奶粉,抓獲5名涉案人員,刑拘3人。2012年,農(nóng)業(yè)部在全國30個省(區(qū)、市)進行了飼料產(chǎn)品的質(zhì)量安全監(jiān)測工作。抽檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)河南某飼料廠的魚粉產(chǎn)品和山東省某畜牧科技公司的水解羽毛粉產(chǎn)品中含有三聚氰胺。這些問題的不斷出現(xiàn),表明三聚氰胺進入食品體系的可能性仍然存在,仍需要保持對三聚氰胺的嚴格監(jiān)控狀態(tài)。
[0007]美國食品和藥品管理局(FDA)于2007年5月25日發(fā)布的風險評估報告指出:人體可容忍的三聚氰胺每日攝取量(tolerable daily intake, TDI)為0.63 mg/ (kg.d)。2008年10月3日,F(xiàn)DA把TDI值調(diào)整到0.063 mg/ (kg.d)(對應(yīng)健康無害的攝取量)。2009年6月農(nóng)業(yè)部公告第1218號規(guī)定飼料原料和飼料產(chǎn)品中三聚氰胺限量值為2.5mg/kg。2011年4月,我國衛(wèi)生部、農(nóng)業(yè)部等5部委發(fā)公告規(guī)定嬰兒配方食品中三聚氰胺的限量值為lmg/kg,其他食品中三聚氰胺的限量值為2.5mg/kg。2012年7月,國際食品法典委員會第35屆會議審查通過了液態(tài)嬰兒配方食品中三聚氰胺限量標準,液態(tài)嬰兒配方食品中三聚氰胺限量為0.15mg/kg。
[0008]目前,三聚氰胺的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜質(zhì)譜法(GC-MS),液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等,但這些方法前處理過程均比較繁瑣,如GC法需要衍生化,過程復(fù)雜,后經(jīng)常規(guī)的SPE柱凈化和分離,存在著凈化效果差,有機溶劑摻雜,所需時間長等缺點。免疫親和技術(shù)是90年代在分析領(lǐng)域發(fā)展起來的新技術(shù),免疫親和柱(IAC)是利用免疫親和層析原理制作的分離分析預(yù)裝柱,由于抗原與抗體作用的高度特異性,待測樣品通過IAC柱后能有效,快速,靈敏,準確的去除絕大部分雜質(zhì)從而凈化富集目標物。但是,用免疫親和柱凈化基質(zhì)中的三聚氰胺雖有文獻報道,但文獻中所用的多克隆抗體制備方法復(fù)雜,本專利采用商品化試劑4,6- 二氨基-1,3,5-三嗪-2-乙酸作為半抗原,制備三聚氰胺的多克隆抗體,其制備方法簡單,抗體得率和滴度高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種凈化三聚氰胺的免疫親和色譜柱,及由其為主組成的凈化三聚氰胺的試劑盒,用于牛奶、奶粉和雞蛋等動物源性食品中三聚氰胺殘留樣品凈化。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種凈化三聚氰胺的試劑盒,由凈化三聚氰胺的免疫親和色譜柱,淋洗液,洗脫液,再生液,平衡保存液和海綿托架所組成;所述凈化三聚氰胺的免疫親和色譜柱是將三聚氰胺多克隆抗體包埋于固相載體上而后作為填料裝柱而成;所述的三聚氰胺多克隆抗體是以4,6-二氨基-1,3,5-三嗪-2-乙酸為半抗原與載體蛋白偶聯(lián)而成的完全抗原為免疫原得到的三聚氰胺兔多克隆抗體;
所述固相載體為纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠,優(yōu)選為溴化氰活化的Sepharose 4B ;
所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白;
所述淋洗液為0.01M, ρΗ7.4,含0.05% Tween-20的PBS溶液;
所述洗脫液為甲醇一甘氨酸鹽酸溶液,甲醇:甘氨酸鹽酸溶液體積比為1:1 ;甘氨酸鹽酸溶液為甘氨酸7.5g,12mol/L鹽酸10mL,用高純水定容至500mL,甲醇500mL ;
所述再生液為含0.01%疊氮鈉、含0.05% Tween-20的0.01M, ρΗ7.4的PBS溶液; 所述平衡保存液為0.01Μ, ρΗ7.4的PBS溶液;
所述PBS緩沖液為IL溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g,十二水合磷酸氫二鈉2.86g,氯化鉀0.2g,氯化鈉8.8g。
[0011]用所述的凈化三聚氰胺的試劑盒凈化三聚氰胺殘留樣品的方法,步驟為:
1)樣品的前處理:參照國家標準GB/T22388-2008:稱取Ig的奶粉樣品于50mL塑料離心管中,加入8mL三氯乙酸和2mL乙腈,斡旋混勻后,再震蕩提取IOmin,然后以5000r/min離心5min,取上清液;
2)凈化:免疫親和色譜柱使用前用IOmL的PBS平衡保存液平衡;然后將步驟I)得到的上清液通過所述的免疫親和層析柱;然后用所述的淋洗液及超純水洗滌,再用所述的洗脫液洗脫,收集洗脫液經(jīng)0.22Mffl孔徑的有機濾膜過濾后即得到凈化的試樣液,用于后續(xù)儀器分析樣品中三聚氰胺含量。
[0012]本發(fā)明的免疫親和色譜柱基于免疫反應(yīng)和色譜原理,適合從各種基質(zhì)樣品(如奶粉、液態(tài)奶、雞蛋)中凈化三聚氰胺,便于后續(xù)分析。在所述免疫親和色譜柱中,三聚氰胺的多克隆抗體與S印harose 4B的偶聯(lián)率為72.57±1.70。動態(tài)柱容量為1046.3±17.2 ng/mL,絕對柱容量為121.5ng/mg IgG。,使用了 8次后柱容量為總柱容量的47%左右,保存期為半年。
[0013]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明的免疫親和色譜柱具有高選擇性,將抗體的非結(jié)合活性區(qū)域Fe端定向的包埋于載體,更好的保持抗體的活性,且方法操作簡單,凈化效果好,避免雜質(zhì)對測定結(jié)果產(chǎn)生的干擾,免疫親和色譜柱可重復(fù)使用,降低分析成本和環(huán)境污染。本發(fā)明的凈化方法結(jié)合色譜法可用于奶粉,液態(tài)奶,雞蛋等樣品中三聚氰胺的高效檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1三聚氰胺標準品的液相色譜圖(0.5Pg/mL)。
[0015]圖2空白牛奶樣品的液相色譜圖。
[0016]圖3在空白牛奶樣品中添加200ng/mL三聚氰胺的液相色譜圖。
[0017]圖4三聚氰胺不同濃度標準品的液相色譜標準曲線。
【具體實施方式】
[0018]為更好的理解本發(fā)明,下面結(jié)合具體的實施例來進一步闡明,應(yīng)理解,這些實施例僅用于說明本發(fā)明,而不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0019]實施例1三聚氰胺多克隆抗體的制備
(I)動物免疫:以三聚氰胺結(jié)構(gòu)類似物4,6- 二氨基-1,3,5-三嗪-2-乙酸為半抗原,經(jīng)活性酯法與載體蛋白BSA偶聯(lián)為免疫原,選用三月齡健康、雄性、體重為1.5kg左右的新西蘭大白兔為免疫動物,免疫劑量為lmg/kg體重,首免時混合等體積的完全弗氏佐劑,14天后,加等體積的不完全弗氏佐劑以同樣劑量進行加強免疫,加強免疫分別于初次免疫后2周、4周、6周后進行。免疫注射方式采用背部皮下多點注射。每次加強免疫后7天時由兔子耳靜脈取血,進行效價檢測,直到血清效價和特異性達到要求。
[0020](2)抗體純化
定時監(jiān)測抗體效價,當抗體效價達到較高的水平則最后加強免疫一次,第7?10天后頸動脈采全血。將采集的全血置于37°C溫箱I小時,再轉(zhuǎn)移至4°C冰箱內(nèi)放置4小時。3000rpm離心10分鐘,吸取上清分裝,_20°C保存?zhèn)溆?。獲得的血清用飽和硫酸銨法純化,具體做法是:取兔抗血清IOmL,加IOmL的PBS混勻,邊攪拌邊逐滴加入20mL,PH=7.4的飽和硫酸銨溶液,使其成50%飽和度,充分混合后4 1:靜置過夜后取出4 V離心6000rpm 15min,棄上清。沉淀用10mL,0.01mol/L,PH=7.4 PBS溶解,邊攪拌邊逐滴加入5mL飽和硫酸銨,使其成33%飽和度,室溫沉淀一小時后6000rpm 15min,棄上清,將此過程重復(fù)兩次。所得沉淀用適量PBS液溶解,小心地轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi),用100倍體積的PBS 4°C透析48h,期間更換4-5次。透析完成后分裝,-20°C保存。
[0021](3)三聚氰胺抗體特異性測定
將三聚氰胺的結(jié)構(gòu)類似物環(huán)丙氨嗪配成0.1、1、10、50、100、200 μ g/mL,三聚氰酸、四環(huán)素、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺、氨芐青霉素分別配成2000、1000、500μ g/mL,與包被抗原競爭抗血清中的抗體,按間接競爭ELISA操作步驟測定,得出各自IC5tl值,計算交叉反應(yīng)率:
交叉反應(yīng)率=(引起5 O %抑制的三聚氰胺的濃度/引起5 O %抑制的其他物質(zhì)的濃度)X 100%
其中環(huán)丙氨嗪產(chǎn)生了一定的抑制作用,三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸、四環(huán)素、氨芐青霉素均不能抑制包被抗原與抗Mel血清的結(jié)合,無交叉反應(yīng)性。
[0022]表1.幾種物質(zhì)與三聚氰胺抗體的交叉反應(yīng)率結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種凈化三聚氰胺的免疫親和層析柱,其特征在于,由固相載體和與其偶聯(lián)的三聚氰胺多克隆抗體組成;所述三聚氰胺多克隆抗體其特征在于采用商品化試劑與載體蛋白BSA相連接合成的人工抗原,經(jīng)免疫動物后采血,分離抗血清后純化制得;所述三聚氰胺半抗原是二聚氰胺結(jié)構(gòu)類似物4,6- 二氨基-1,3, 5- 二嗪-2-乙酸,結(jié)構(gòu)式為
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的層析柱,其特征在于,所述固相載體為纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠,優(yōu)選為溴化氰活化的Sepharose 4Β ;所述三聚氰胺多克隆抗體為兔抗三聚氰胺多克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的層析柱,其特征在于:所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。
4.一種含有上述任一權(quán)利要求所述的層析柱的試劑盒,其特征在于:所述試劑盒還包括洗脫液,所述洗脫液為甲醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒,其特征在于:所述試劑盒中還包括洗滌液和保存液;所述洗滌液為PH 7.4,0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液,所述0.01mol/L磷酸鹽緩沖液為IL溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g,十二水合磷酸氫二鈉2.86g,氯化鉀0.2g,氯化鈉8.Sg ;所述保存液為在IL 0.01mol/L, pH7.4磷酸鹽緩沖液加入疊氮化鈉0.2g。
6.一種利用上述試劑盒凈化三聚氰胺的方法,包括以下步驟: 1)樣品的前處理: 參照國家標準GB/T 22388-2008:稱取Ig的奶粉樣品于50mL塑料離心管中,加入8mL三氯乙酸和2mL乙腈,潤旋混勻后,再震蕩提取IOmin,然后以5000r/min離心5min,取上清液; 2)凈化: 免疫親和色譜柱使用前用IOmL的PBS平衡保存液平衡;然后將步驟I)得到的上清液通過所述的免疫親和層析柱;然后用所述的淋洗液及超純水洗滌,再用所述的洗脫液洗脫,收集洗脫液經(jīng)0.22ΜΠ1孔徑的有機濾膜過濾后即得到凈化的試樣液,用于后續(xù)儀器分析樣品中三聚氰胺含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的凈化三聚氰胺的方法,其特征在于:所述動物組織樣品包括肌肉、肝、腎、血液、牛奶和蛋。
【文檔編號】C07D251/62GK103506094SQ201310297604
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】施祖灝, 張小燕, 高玉時, 唐修君, 唐夢君, 蒲俊華, 陳大偉, 葛慶聯(lián), 林伊萊 申請人:江蘇省家禽科學研究所
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