回收植物來源的蛋白質(zhì)的方法
【專利摘要】提供了回收植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的方法。該方法可包括獲取包含定位于質(zhì)外體之蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的植物或植物物質(zhì),松動(dòng)細(xì)胞壁以產(chǎn)生具有松動(dòng)細(xì)胞壁的植物或植物物質(zhì),從而使得質(zhì)外體內(nèi)容物通過細(xì)胞壁釋放以由所述植物或植物物質(zhì)產(chǎn)生質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分,以及回收質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分。質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分包含植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白。
【專利說明】回收植物來源的蛋白質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及回收植物來源的蛋白質(zhì)的方法。更具體地，本發(fā)明提供從植物和植物組織獲取蛋白質(zhì)(包括蛋白超結(jié)構(gòu)(suprastructure))的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物)中的重組表達(dá)策略在培養(yǎng)基中以非常高的水平表達(dá)和分泌蛋白質(zhì)。使用這些系統(tǒng)獲得了高水平表達(dá)、正確蛋白質(zhì)折置和蛋白質(zhì)翻譯后修飾。此外，由于可以容易地將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與其他組分(DNA、囊泡、膜、色素等)分離，所表達(dá)蛋白質(zhì)的純化得以簡(jiǎn)化。對(duì)于植物或酵母表達(dá)系統(tǒng)，細(xì)胞壁阻止表達(dá)的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中。
[0003]廣泛使用不同的科學(xué)方法來產(chǎn)生細(xì)胞提取物。對(duì)于某些類型的蛋白質(zhì)或細(xì)胞組分，通常不選擇機(jī)械方法來破壞細(xì)胞壁并釋放其內(nèi)容物。將目的蛋白質(zhì)直接表達(dá)入細(xì)胞培養(yǎng)基，使得能夠通過離心或過濾去除細(xì)胞內(nèi)雜質(zhì)，從而使目的蛋白質(zhì)被簡(jiǎn)單快速地富集。還可期望在將目的蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)用于疫苗配制之前，從存在于植物或植物物質(zhì)中的一些或全部蛋白質(zhì)、DNA、膜片段、囊泡、色素、碳水化合物等中分離目的蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)，包括蛋白花環(huán)(protein rosette)、納米顆粒、大蛋白復(fù)合物、抗體或病毒樣顆粒(virus-like particle, VLP)等等。
[0004]免疫球蛋白(IgG)是對(duì)多種性質(zhì)的特定抗原性對(duì)應(yīng)物有特征性親和力的復(fù)雜異多聚體蛋白質(zhì)。當(dāng)今IgG產(chǎn)生細(xì)胞系的常規(guī)分離和IgG定向進(jìn)化和分子改造技術(shù)的出現(xiàn)極大地影響了它們作為生物治療劑和在一般生命科學(xué)應(yīng)用中的改進(jìn)。治療性單克隆IgG(單克隆抗體，mAb)在目前的新抗炎藥和抗癌藥市場(chǎng)中占主導(dǎo)地位，并且目前正在對(duì)數(shù)百種新候選藥物進(jìn)行研究和臨床開發(fā)以獲得改進(jìn)的或新的應(yīng)用。每年mAb的市場(chǎng)需求從幾克(診斷)、幾千克(抗毒素)到一百或數(shù)百千克(生物防護(hù)、抗癌、抗感染、抗炎)。W02008 /151440(通過引用并入本文)描述了從植物生產(chǎn)經(jīng)修飾的糖蛋白的方法。
[0005]PCT公開W000 / 09725 (Turpen等)描述了一種從植物細(xì)胞間間隙提取蛋白質(zhì)的方法，其包括真空和離心處理以提供包含目的蛋白質(zhì)的間質(zhì)液(interstitial fluid)提取物。該方法適于能在真空和離心條件下通過微纖維網(wǎng)格的小蛋白質(zhì)(50kDa或更小)，但不適于較大蛋白質(zhì)、超結(jié)構(gòu)蛋白(superstructure protein)、蛋白花環(huán)、納米顆粒、大蛋白復(fù)合物例如抗體或VLP。[0006]1999 年 McCormick 等(Proc Natl Acad Sci USA96:703-708)公開了使用與單鏈Fv(scFV)表位融合的大米淀粉酶信號(hào)肽將表達(dá)的蛋白質(zhì)靶向到細(xì)胞外部分(compartment),隨后通過對(duì)葉和莖組織進(jìn)行真空過濾來回收scFv多肽。2008年Moehnke等(Biotechnol Lett30:1259-1264)描述了使用McCormick的真空過濾法通過質(zhì)外體提取從煙草中獲得重組植物過敏原。PCT公開W02003 / 025124(Zhang等)公開了在植物中表達(dá)scFv免疫球蛋白，其通過鼠信號(hào)序列靶向質(zhì)外體空間。
[0007]病毒樣顆粒(VLP)可用于制備疫苗，例如流感疫苗。超結(jié)構(gòu)(例如VLP)模擬病毒衣殼結(jié)構(gòu)，但缺少基因組，從而不能復(fù)制或提供再次感染。VLP刺激強(qiáng)免疫應(yīng)答，為分離(可溶)的重組抗原提供了改進(jìn)的替代方法。VLP在特定病毒蛋白表達(dá)后進(jìn)行組裝并具有類似于其同類病毒的外表面，但不同于真的病毒顆粒，遺傳物質(zhì)不會(huì)整合到其中。與天然病毒類似的顆粒狀多價(jià)結(jié)構(gòu)抗原的呈遞引發(fā)具有均衡的體液和細(xì)胞成分的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答刺激。認(rèn)為優(yōu)于分離抗原產(chǎn)生之刺激的這種改進(jìn)對(duì)于包膜病毒尤其適用，因?yàn)榘LP以其天然膜結(jié)合狀態(tài)呈遞表面抗原(Grgacic和Anderson, 2006年，Methods40, 60-65)。此外，已證明與重組血凝素HA(即單體HA，或組成花環(huán)的HA ;3-8個(gè)三聚體的HA組裝物)相比，擁有納米顆粒組織結(jié)構(gòu)的流感VLP是更佳的候選疫苗，并且他們能激活體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。(Bright, R.A.,等，2007，Vaccine25, 3871-3878)。[0008]之前W02009 / 009876和W02009 / 076778的發(fā)明人已描述了包含脂質(zhì)包膜的流
感HA VLP的生產(chǎn)(D’Aoust等；兩者均通過引用并入本文)。對(duì)于包膜病毒，病毒保留脂質(zhì)層或膜可以是有利的。不同系統(tǒng)的脂質(zhì)構(gòu)成可以有所不同(例如植物生成的包膜病毒會(huì)在包膜中包含植物脂質(zhì)或植物留醇)，這可有助于增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
[0009]Mason等描述了表達(dá)HBV表面抗原(HBsAg)的轉(zhuǎn)基因煙草中包膜VLP的組裝(1992年，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89, 11745-11749)。已證明植物生成的HBV VLP在腸胃外施用時(shí)在小鼠中誘導(dǎo)強(qiáng)B和T細(xì)胞免疫應(yīng)答(Huang等，2005年，Vaccine23，1851-1858)，但飼喂實(shí)驗(yàn)的經(jīng)口免疫僅誘導(dǎo)了中度的免疫應(yīng)答(Smith等，2003年，Vaccine21, 4011-4021)。Greco (2007年，Vaccine25，8228-8240)證明與HBsAg融合的人免疫缺陷病毒(HIV)表位在轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥(Arabidopsis)中表達(dá)時(shí)累積為VLP，產(chǎn)生了二價(jià)VLP疫苗。
[0010]在轉(zhuǎn)基因煙草和馬鈴薯植株中表達(dá)病毒衣殼蛋白(NVCP)導(dǎo)致無包膜VLP的組裝(Mason 等,1996 年,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93, 5335-5340)。已在農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的本塞姆氏煙草(N.benthamiana)葉中產(chǎn)生了 NVCP VLP(Huang 等 2009 年，BiotechnOl.Bioeng.103, 706-714),并且在小鼠中證實(shí)了其經(jīng)口施用后的免疫原性(Santi等，2008年，Vaccine26，1846-1854)。給健康成人志愿者施用含有215-751 μ g VLP形式的NVCP的2或3劑量生馬鈴薯在95 %的免疫志愿者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答(Tacket等2000年，J.1nfect.Dis.182，302-305)。還由 HBV 核心抗原(HBcAg ；Huang 等，2009 年，Biotechnol.Bioeng.103，706-714)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)主要衣殼蛋白LI (Varsani等，2003年，Arch.Virol.148，1771-1786)的表達(dá)獲得了無包膜 VLP。
[0011]期望有更簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)生產(chǎn)系統(tǒng)，例如依賴于僅一種或幾種蛋白質(zhì)的表達(dá)的系統(tǒng)。在植物系統(tǒng)中生產(chǎn)蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)(例如但不限于蛋白花環(huán)、納米顆粒、大蛋白復(fù)合物例如抗體或VLP)是有利的，因?yàn)橹参锟梢耘囵B(yǎng)在溫室或田間，并且不需要無菌組織培養(yǎng)法和處理。
[0012]期望有這樣的回收蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)的方法，其中蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)基本上不含植物蛋白質(zhì)或容易與其分離，但仍保留蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)和特性。
[0013]發(fā)明概述
[0014]本發(fā)明涉及回收植物來源的蛋白質(zhì)的方法。更具體地，本發(fā)明提供從植物和植物組織中回收蛋白質(zhì)(包括蛋白超結(jié)構(gòu))的方法。
[0015]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供回收植物來源的蛋白質(zhì)的改進(jìn)方法。
[0016]本發(fā)明提供了制備植物來源之蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的方法(A)，包括:獲取定位于質(zhì)外體(apoplast)中的包含植物來源之蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的植物或植物物質(zhì)；處理植物或植物物質(zhì)以松動(dòng)(loosen)細(xì)胞壁從而產(chǎn)生質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分和植物細(xì)胞級(jí)分，所述質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分包含植物來源的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白；和回收質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分。該方法還可包括從質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分純化植物來源之蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的步驟。植物來源之蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白可以是嵌合植物來源蛋白、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白。植物來源之蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)于植物來說可以是異源的。植物來源之蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白可以包括蛋白花環(huán)、蛋白復(fù)合物、蛋白酶體、代謝區(qū)室(metabolon)、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物、重組復(fù)合物、光合復(fù)合物、膜轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物、核孔復(fù)合物、蛋白納米顆粒、糖蛋白、抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈單克隆抗體、病毒樣顆粒(VLP)、病毒包膜蛋白(viral envelope protein)、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白、和病毒外殼蛋白(viral coat protein)、嵌合蛋白、嵌合蛋白復(fù)合物、嵌合蛋白納米顆粒、嵌合糖蛋白、嵌合抗體、嵌合單克隆抗體、嵌合單鏈單克隆抗體、嵌合血凝素、病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白。植物來源的單克隆抗體可以包括嵌合小鼠人單克隆抗體，例如但不限于C2B8。植物來源的VLP可以包含流感血凝素。
[0017]質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分和細(xì)胞級(jí)分可以通過化學(xué)地、酶促地、物理地或其組合處理植物或植物物質(zhì)來產(chǎn)生。例如，可以用細(xì)胞壁松動(dòng)組合物來處理植物或植物物質(zhì)。細(xì)胞壁松動(dòng)組合物可包括一種或多于一種選自以下的化合物:螯合劑、羥基自由基、吲哚-3-乙酸、擴(kuò)展蛋白、果膠酶、纖維素酶、脂肪酶、 蛋白酶及其組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，纖維素酶是酶的混合物，并且可包括一種或更多種內(nèi)_1，4-β-葡聚糖酶、纖維二糖水解酶(外切纖維素酶)、β -葡糖苷酶、纖維二糖脫氫酶(氧化纖維素酶)、纖維素磷酸化酶和半纖維素酶。
[0018]此外，質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分和細(xì)胞級(jí)分可以通過經(jīng)壓力或真空滲入使得細(xì)胞壁松動(dòng)組合物滲入植物或植物物質(zhì)中來產(chǎn)生。更特別地，所述細(xì)胞壁松動(dòng)組合物可包含一種或更多種酶，例如一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶、或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶。因此，質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分和細(xì)胞級(jí)分可例如通過酶滲入來產(chǎn)生。
[0019]質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分和細(xì)胞級(jí)分還可通過用超聲或者用與超聲組合的細(xì)胞壁松動(dòng)組合物處理植物或植物物質(zhì)來產(chǎn)生。
[0020]植物或植物物質(zhì)可以通過種植、收集或者種植并收集植物來獲得。植物物質(zhì)可以包括一部分或整個(gè)植株、植物細(xì)胞、葉、莖、根或培養(yǎng)的植物細(xì)胞中的一種或多于一種。
[0021]本發(fā)明提供了如上所述制備植物來源之蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的方法，其中編碼植物來源的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的核酸以瞬時(shí)方式引入植物?；蛘?，核酸穩(wěn)定地整合進(jìn)植物基因組。
[0022]本發(fā)明還提供如上所述制備植物來源的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的方法，其還包括從質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分純化植物來源的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的步驟。純化步驟可以包括通過深層過濾(depth filtration)來過濾所述質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分以產(chǎn)生澄清的提取物，然后用陽離子交換樹脂、親和層析或體積排阻層析或者其組合來層析所述澄清的提取物。
[0023]不希望被理論所約束，從質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分獲取的蛋白質(zhì)較為均一，因?yàn)榉g后修飾蛋白的中間形式或包含在多種細(xì)胞內(nèi)部分(例如線粒體、葉綠體和其他細(xì)胞器)進(jìn)行之其他類型的加工的蛋白質(zhì)沒有被共提取。重組蛋白均一性水平更高通常使得包含該蛋白質(zhì)的制劑的質(zhì)量更高，并可生成具有更高的效力、更長(zhǎng)的半衰期或更好的免疫力的有益特性的產(chǎn)品。例如，與含有復(fù)合糖基化的蛋白質(zhì)相比，含有高度甘露糖糖基化的血液蛋白在血液循環(huán)中被更快地被清除。產(chǎn)生于質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分的糖基化蛋白表現(xiàn)出更復(fù)合類型的糖基化。因此，使用本文所述方法(其涉及細(xì)胞壁松動(dòng))制備的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出例如在循環(huán)中更長(zhǎng)的半衰期。
[0024]植物來源的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白可以包括蛋白花環(huán)、蛋白復(fù)合物、蛋白納米顆粒、抗體、單克隆抗體、VLP。VLP可以包含一種或更多種流感HA多肽。超結(jié)構(gòu)蛋白可以是嵌合超結(jié)構(gòu)蛋白，例如，單克隆抗體可以是嵌合單克隆抗體，或流感HA多肽可以是嵌合HA多肽。如果超結(jié)構(gòu)蛋白是VLP，則植物來源的VLP還可包含凝血活性。植物或植物物質(zhì)可以通過培養(yǎng)、收集或者培養(yǎng)并收集植物來獲得。植物物質(zhì)可以包括一部分或整個(gè)植株，或者植物細(xì)胞、葉、莖、根或培養(yǎng)細(xì)胞中的一種或多于一種。
[0025]本發(fā)明還提供了制備植物來源的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的方法(B)，包括獲取包含植物來源的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的植物或植物物質(zhì)，用細(xì)胞壁松動(dòng)組合物、超聲或其組合處理植物物質(zhì)以產(chǎn)生植物細(xì)胞級(jí)分和質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分，過濾所述質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分以產(chǎn)生過濾級(jí)分，以及從過濾級(jí)分中回收植物來源的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白。
[0026]不希望被理論所約束，包含植物來源脂質(zhì)的植物制得的VLP可以誘導(dǎo)比用其他生產(chǎn)系統(tǒng)制得的VLP更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，并且這些植物制得的VLP誘導(dǎo)的該免疫反應(yīng)比活或減毒全病毒疫苗所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)更強(qiáng)。
[0027]從宿主細(xì)胞獲得的蛋白提取物成分是復(fù)雜的，并且往往包含與待分離的目的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)一起的細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)成分。制備質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分隨后進(jìn)行分離細(xì)胞壁組分與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和成分的步驟是有利的，因?yàn)槟康牡鞍踪|(zhì)或超結(jié)構(gòu)可以在制造過程中被富集和提高效力。包括更少有 效步驟的更簡(jiǎn)單過程可以顯著增加產(chǎn)量并且降低成本。還發(fā)現(xiàn)與涉及消化細(xì)胞壁的方法(例如，如PCT / CA2010 / 001489或PCT / CA2010 /001488中所述)相比，松動(dòng)細(xì)胞壁的方法獲得類似的或提高的超結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)量。不希望被理論所約束，細(xì)胞壁松動(dòng)步驟可松動(dòng)細(xì)胞壁的多聚成分，并有助于使蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白釋放而非結(jié)合在細(xì)胞壁中。該方案還可以將細(xì)胞內(nèi)成分對(duì)蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的污染降到最低。
[0028]與涉及勻漿、攪拌(blending)或研磨的制備植物來源之超結(jié)構(gòu)蛋白的方法相比，本文所述方法使植物來源的超結(jié)構(gòu)蛋白提取物受到更少的破壞和污染。本文所述方法提供植物組織的質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分同時(shí)保持原生質(zhì)體及其成分的完整性。本文所述方法即使在原生質(zhì)體或原生質(zhì)體的一部分失去其完整性而不再完整的情況下也能有效純化蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白。
[0029]與涉及標(biāo)準(zhǔn)組織破碎技術(shù)(例如，勻漿、攪拌或研磨)的超結(jié)構(gòu)蛋白提取方法相t匕，這些方法提供更高的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)量。更高的產(chǎn)量可以部分歸因于破壞蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白(在VLP的情形中為脂質(zhì)包膜)之結(jié)構(gòu)完整性的剪切力的減少。從質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分制備蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白可以是有利的，因?yàn)橘|(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分是顯著降低的細(xì)胞質(zhì)蛋白或不含細(xì)胞質(zhì)蛋白。因此，在質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分中將其他蛋白質(zhì)和物質(zhì)(包括單體、二聚體、三聚體超結(jié)構(gòu)蛋白或其片段)與超結(jié)構(gòu)蛋白分離可以被容易地實(shí)施。但是，即使原生質(zhì)體制備物或部分原生質(zhì)體制備物是不完整的，蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的產(chǎn)量增加也可以通過本文所述方法來實(shí)現(xiàn)。
[0030]與不松動(dòng)細(xì)胞壁的提取方法(例如攪拌器提取的植物)相比，分泌到質(zhì)外體的糖蛋白(包括超結(jié)構(gòu)糖蛋白，例如單克隆抗體)包含更高百分比的完成成熟的N-聚糖，并且包含末端N-乙酰葡糖胺或半乳糖殘基(復(fù)合N-聚糖)。與包含末端甘露糖殘基(未成熟的N聚糖)的單克隆抗體相比，發(fā)現(xiàn)包含復(fù)合N聚糖的超結(jié)構(gòu)糖蛋白(例如單克隆抗體)在血流中顯示出半衰期增加的有益特性。
[0031]通過松動(dòng)細(xì)胞壁，可以釋放出一批包含已成熟之N-聚糖的質(zhì)外體抗體。這種提取方法可允許回收具有復(fù)合N-聚糖之糖基化抗體的富集類群或均質(zhì)類群，并與原生質(zhì)體級(jí)分中不成熟形式的糖基化抗體分離。如果期望獲得這批具有未成熟之N-聚糖的抗體，則可以保留原生質(zhì)體級(jí)分并且從原生質(zhì)體級(jí)分中純化抗體。
[0032]與通過標(biāo)準(zhǔn)組織破碎技術(shù)獲得的VLP相比，本發(fā)明的VLP的特征還在于顯示出更高的凝血活性。這種改進(jìn)的凝血活性可歸因于完整VLP產(chǎn)量更高(溶液中游離的HA單體或三聚體更少)、具有完整脂質(zhì)包膜的完整VLP產(chǎn)量更高，或其組合。
[0033]與用全病毒制成的疫苗相比，用VLP制成的疫苗的優(yōu)勢(shì)在于它們是無感染性的。因此，不用考慮生物防護(hù)并且這在生產(chǎn)中也是不需要的。植物制備的VLP提供的另外一個(gè)優(yōu)勢(shì)是允許在溫室或田間培養(yǎng)表達(dá)系統(tǒng)，從而顯著地更加經(jīng)濟(jì)并適于擴(kuò)大規(guī)模。
[0034]此外，植物不包含參與向蛋白質(zhì)合成和添加唾液酸殘基的酶。VLP可以在沒有神經(jīng)氨酸酶(NA)的情況下產(chǎn)生，并且不需要共表達(dá)NA或用唾液酸酶(神經(jīng)氨酸酶)處理生產(chǎn)細(xì)胞或提取以確保植物中的VLP生產(chǎn)。
[0035]本發(fā)明的該概述并 不必然描述本發(fā)明的所有特征。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]本發(fā)明的這些和其他特征將從以下描述中更加明顯，其中參照了以下附圖，在附圖中:
[0037]圖1顯示了表達(dá)H5A /印度尼西亞/5/05血凝素的基于CPMVHT的表達(dá)盒(構(gòu)建體685)的示意圖。
[0038]圖2顯示了 A)表達(dá)H5 / Indo (構(gòu)建體編號(hào)685)的構(gòu)建體的部分(從PacI (35S啟動(dòng)子上游)到AscI (緊鄰NOS終止子的下游))核酸序列(SEQ ID N0.1)。來自A /印度尼西亞/ 5 / 2005的H5的編碼序列以下劃線表示。圖2B顯示了構(gòu)建體編號(hào)685編碼的H5A /印度尼西亞/5/05血凝素的氨基酸序列(SEQ ID N0.2)。
[0039]圖3顯示了用體積排阻層析(SEC)表征的包含血凝素(HA)的結(jié)構(gòu)。離心經(jīng)消化的植物提取物之后，重懸沉淀并通過SEC分離。圖3A顯示了每個(gè)級(jí)分的總可溶性蛋白質(zhì)含量(實(shí)心三角形；左側(cè)Y-軸，最大值用Bradford法測(cè)定)。還顯示了所收集級(jí)分(實(shí)心柱；右側(cè)Y-軸)的凝血活性。圖3B顯示了 SEC洗脫級(jí)分的SDS-PAGE分析結(jié)果。通過丙酮沉淀級(jí)分并在分析前于I / 40體積的還原性樣品上樣緩沖液中重懸。用0.1%的考馬斯R-250溶液對(duì)凝膠染色。純化的VLP用作跑膠對(duì)照。對(duì)應(yīng)于HAO單體的帶用箭頭表示。MW-分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa) ；C-純化的VLP (對(duì)照)；泳道7至10和14至16對(duì)應(yīng)于圖3A所示的SEC分析洗脫的級(jí)分編號(hào)。
[0040]圖4顯示了酶消化和通過Comitrol?勻漿器機(jī)械勻漿之后所獲得的蛋白譜對(duì)比。用變性樣品上樣緩沖液處理樣品，通過洗脫級(jí)分的SDS-PAGE分析分離蛋白質(zhì)。用0.1%的考馬斯R-250溶液對(duì)凝膠染色。MW-分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa);泳道1_25 μ I酶混合物；泳道2-25 μ I植物組織酶消化物，泳道3-通過Comitrol勻漿器獲得的5 μ I提取物。
[0041]圖5顯示了 HA表達(dá)盒的核酸序列(SEQ ID NO:9),其包括苜蓿質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子和5’ UTR、A /印度尼西亞/ 5 / 2005(構(gòu)建體號(hào)660)的H5的血凝素編碼序列、苜蓿質(zhì)體藍(lán)素3’ UTR和終止子序列。
[0042]圖6顯示了陽離子交換樹脂捕獲的直接來自質(zhì)外體級(jí)分的HA-VLP分離物的HA-VLP。樣品用非還原變性樣品上樣緩沖液處理，通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)。用0.1%考馬斯R-250溶液對(duì)凝膠染色。泳道1:離心后的質(zhì)外體級(jí)分；泳道2-3:連續(xù)微過濾后的質(zhì)外體級(jí)分；泳道4:陽離子交換的上樣物；泳道5:陽離子交換的流出級(jí)分。泳道6:陽離子交換的洗脫物，濃縮10倍；泳道7:分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)。
[0043]圖7顯示了 H5 / Indo VLP (圖7A)、澄清之后沒有向消化緩沖液中添加NaCl的Hl / Cal VLP (圖7B)和進(jìn)行了該添加的Hl / Cal VLP (圖7C)的納米顆粒跟蹤分析(Nanoparticle Tracking analysis, NTA)譜。NTA 實(shí)驗(yàn)是用 NanoSightLM20 (NanoSight, Amesbury, UK)實(shí)施的。該裝置配備了藍(lán)激光(405nm)、樣品室和Viton氟橡膠O型圈。室溫下記錄視頻并用NTA2.0軟件分析。樣品記錄60秒。手動(dòng)選擇快門和增益(gain)以獲得最優(yōu)粒子分辨率。
[0044]圖8顯示了用不同緩沖液酶消化產(chǎn)生的H3 /布里斯班VLP提取物的Western印跡結(jié)果。泳道 I)純重組 HA 標(biāo)準(zhǔn)(5 μ g, Immune Technology Corp.1T-003-0042p),泳道2-5包含7 μ I如下緩沖液中進(jìn)行的離心酶提取物:泳道2)600mM甘露糖醇+125m檸檬酸鹽+75mM NaP04+25mM EDTA+0.04% 亞硫酸氫鹽(pH6.2)，泳道 3) 600mM 甘露糖醇+125mM 檸檬酸鹽+75mM NaP04+50mM EDTA+0.04% 亞硫酸氫鹽(pH6.2)，泳道 4) 200mM 甘露糖醇+125mM檸檬酸鹽+75mM NaP04+25mM EDTA+0.03 %亞硫酸氫鹽(pH6.2)，泳道5) 200mM甘露糖醇+125mM檸檬酸鹽+75mM NaP04+50mM EDTA+0.03%亞硫酸氫鹽(pH6.2)。箭頭代表HAO的免疫檢測(cè)信號(hào)。
[0045]圖9顯示了為組裝構(gòu)建體號(hào)590而合成的DNA片段序列(LC片段；(SEQ IDN0.15)。
[0046]圖10顯示了為組裝構(gòu)建體號(hào)592而合成的DNA片段序列(HC片段)(SEQ IDN0.16)。
[0047]圖1IA和圖1lB分別顯示了構(gòu)建體號(hào)595 (圖11A)和構(gòu)建體號(hào)R472 (圖11B)的
示意圖。
[0048]圖12從通過機(jī)械破碎(攪拌提取)和酶消化細(xì)胞壁產(chǎn)生的提取物中純化的抗體的SDS-PAGE對(duì)比。對(duì)于每種提取方法，分兩批獨(dú)立地處理和純化。
[0049]圖13A顯示了通過機(jī)械破碎(攪拌提取)和酶消化細(xì)胞壁純化的C2B8上的寡聚甘露糖苷N-聚糖比例的對(duì)比。圖13B顯示了通過機(jī)械破碎(攪拌提取)和酶消化細(xì)胞壁純化的C2B8上復(fù)合N-聚糖比例的對(duì)比。
[0050]圖14A顯示了植物細(xì)胞壁的模型(共價(jià)交聯(lián)模型)。在該模型中，細(xì)胞壁基質(zhì)聚合物(木葡聚糖、果膠和糖蛋白)彼此共價(jià)連接。木葡聚糖與纖維素微纖維(cellulosemicrofibrils)結(jié)合導(dǎo)致非共價(jià)交聯(lián)的纖維素-半纖維素網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)為壁提供抗張強(qiáng)度。圖14B顯示了植物細(xì)胞壁的一種替選模型(連接(Tether)模型)。在該模型中，木葡聚糖分子是通過氫鍵連接的(hydrogen bonded)并交聯(lián)纖維素微纖維。纖維素-木葡聚糖網(wǎng)絡(luò)在非共價(jià)交聯(lián)的果膠網(wǎng)絡(luò)中成網(wǎng)。圖14C顯示了植物細(xì)胞壁的另一個(gè)替選模型(擴(kuò)散層(diffuse layer)模型)。在該模型中，木葡聚糖分子通過氫鍵連接纖維素微纖維的表面但不直接與之交聯(lián)。緊密結(jié)合的木葡聚糖由較不緊密結(jié)合的多糖層圍繞。纖維素和木葡聚糖嵌入果膠基質(zhì)中。圖14D顯示了植物細(xì)胞壁的一個(gè)替選模型(分層的層模型(stratifiedlayer model))。在該模型中，木葡聚糖分子是通過氫鍵連接的并交聯(lián)纖維素微纖維。纖維素-木葡聚糖層被果膠多糖層所隔開。
[0051]圖15顯示了用含EDTA的緩沖液處理植物(使用或未使用細(xì)胞壁解聚酶)之后釋放的蛋白質(zhì)。圖15A使用Bradford測(cè)定測(cè)量了蛋白質(zhì)濃度。圖15B HA活性表示為可提取的使紅細(xì)胞凝聚的蛋白質(zhì)最低量的倒數(shù)。
[0052]圖16A顯示了與已在酶溶液/消化溶液中滲入并振蕩了 16小時(shí)(時(shí)間t)的葉相比，從已用相同的酶溶液/消化溶液(參見實(shí)施例17)滲入4小時(shí)(時(shí)間0.25t)之后的葉釋放的蛋白質(zhì)。圖16B顯示了與用酶溶液/消化溶液滲入的切葉(cut leave)相比，從用相同的酶溶液/消化溶液浸潰的整個(gè)植株/整片葉釋放的蛋白質(zhì)。圖16C顯示了使用一種或多于一種果膠酶(例如Biocatalystsl62L和/或Biocatalysts444L)處理整片葉(使用或未使用Multifect CXCG和Multifect CX B(Genencor))之后釋放的蛋白質(zhì)。此外，還示出了用Biocatalysts PDN33處理整片葉之后的蛋白質(zhì)釋放。圖16D顯示了用pH5.8、pH6.0或pH6.2的緩沖液處理整片葉5天之后或者在農(nóng)桿菌滲入(agrofiltration) 7天后用pH6.2或pH6.5的多種緩沖液處理整片葉之后所釋放的蛋白質(zhì)。
[0053]發(fā)明詳述
[0054]本發(fā)明涉及回收植物來源的蛋白質(zhì)的方法。更具體地，本發(fā)明提供從植物和植物組織回收蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)的方法
[0055]以下描述是一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案。
[0056]本發(fā)明提供了回收植物來源的蛋白質(zhì)或目的蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)的方法。目的蛋白質(zhì)可以存在于質(zhì)外體或細(xì)胞外部分(compartment)中(對(duì)應(yīng)于除原生質(zhì)體/原生質(zhì)球(spheroplast)部分之外的植物細(xì)胞部分)。該方法涉及松動(dòng)細(xì)胞壁，例如通過降解、部分降解、切割、部分切割或者以其他方式在結(jié)構(gòu)上改變細(xì)胞壁中的細(xì)胞壁聚合組分及其相連的連接，斷裂細(xì)胞壁聚合物之中或之間的分子間非共價(jià)鍵或共價(jià)鍵。該方法可涉及或者可不涉及從植物細(xì)胞釋放原生質(zhì)體或原生質(zhì)球。
[0057]術(shù)語“原生質(zhì)體”指其細(xì)胞壁被完全去除或顯著去除的植物細(xì)胞，例如細(xì)胞壁的約50%至約100%或其間的任意量可以被去除。例如，細(xì)胞壁的約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或其間的任意量可以被去除。原生質(zhì)球的細(xì)胞壁可以被部分地去除，例如細(xì)胞壁的約10%至約49%或其間的任意量可以被去除。例如，細(xì)胞壁的約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、49%或其間的任意量可以被去除。
[0058]“質(zhì)外體”是包含在質(zhì)膜與細(xì)胞壁之間的植物細(xì)胞部分，并且包含細(xì)胞壁和植物的細(xì)胞間隙。雖然優(yōu)選在消化和進(jìn)一步處理過程中保持原生質(zhì)體(和/或原生質(zhì)球)的完整性，但對(duì)于富集如本文所述的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白來說，保持原生質(zhì)體完整不是必需的。優(yōu)選地，原生質(zhì)體或原生質(zhì)球的質(zhì)膜未被降解、部分降解、切割、部分切割或者結(jié)構(gòu)改變、松動(dòng)或者其完整性發(fā)生改變，例如質(zhì)膜的約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或其間的任意量可以被降解、切割、結(jié)構(gòu)改變、松動(dòng)或去除。
[0059]術(shù)語“細(xì)胞壁”指形成植物細(xì)胞的外部細(xì)胞區(qū)室(cell compartment)并且位于質(zhì)膜外側(cè)與質(zhì)外體相鄰的結(jié)構(gòu)。不被理論所約束，認(rèn)為細(xì)胞壁由聚合物基質(zhì)構(gòu)成，例如纖維素微纖維通過半纖維素連接(tether)相連以形成嵌在果膠基質(zhì)中的纖維素-半纖維素網(wǎng)絡(luò)(植物細(xì)胞壁的數(shù)個(gè)非限制性模型參見圖14A-14D)。細(xì)胞壁組分可包括以下非限制性例子:多糖、纖維素、半纖維素(例如木聚糖、木葡聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡糖醒酸阿拉伯糖基木聚糖(glucuronarabinoxylan)、甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖)、果膠(例如半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖1、鼠李半乳糖醛酸聚糖I1、寡聚半乳糖醛酸、取代的半乳糖醛酸聚糖、木葡半乳糖醛酸聚糖、洋芹半乳糖醛酸聚糖(apiogalacturonans)、聚合物、木質(zhì)素、角質(zhì)、木栓質(zhì)、糖蛋白、富含輕脯氨酸的糖蛋白、阿拉伯半乳聚糖蛋白、富含甘氨酸的蛋白質(zhì)、富含脯氨酸的蛋白質(zhì)、伸展蛋白、擴(kuò)展蛋白、礦物質(zhì)、鈣、果膠鈣、鎂、果膠酸鎂、硼酸鹽/酯、酚酯、阿魏酸、香豆酸。
[0060]在結(jié)構(gòu)上，細(xì)胞壁組分(特別是嵌在果膠基質(zhì)形式中的纖維素-半纖維素網(wǎng)絡(luò))有助于細(xì)胞壁的半滲透性。在生理環(huán)境下，細(xì)胞壁通常允許小分子通過由細(xì)胞壁組分形成的網(wǎng)。松動(dòng)細(xì)胞壁涉及松動(dòng)細(xì)胞壁組分彼此之間的相互作用，并且直接或間接導(dǎo)致網(wǎng)的擴(kuò)大或拉伸，從而允許比通常被允許通過細(xì)胞壁的分子大的分子通過。可以通過作用在小分子正常通過未松動(dòng)細(xì)胞壁上的力(例如漲壓、滲透壓和流體靜壓)來促進(jìn)大分子通過松動(dòng)細(xì)胞壁。本發(fā)明可包括使用作用于這些力中的一種或更多種以進(jìn)一步促進(jìn)大分子通過的試劑、化學(xué)品或生物品。
[0061]“細(xì)胞壁松動(dòng)”指細(xì)胞壁的修飾，該修飾導(dǎo)致細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，該變化可導(dǎo)致壁張力松弛、壁應(yīng)力松弛、不可逆的壁伸展(壁蠕移(wall creep))或細(xì)胞壁的一種或更多種組分的部分或完全降解。例如，并且不希望被理論所約束，細(xì)胞壁松動(dòng)可作為斷裂細(xì)胞壁中的多種組分之間的鍵(例如，細(xì)胞壁中的承載鍵(load-bearing bond))之結(jié)果而產(chǎn)生。結(jié)構(gòu)改變可例如通過切割、部分切割、降解或部分降解細(xì)胞壁組分、斷裂細(xì)胞壁組分之中或之間的分子間非共價(jià)鍵或共價(jià)鍵、或者減弱細(xì)胞壁的其他修飾、破碎細(xì)胞壁基質(zhì)或其組合發(fā)生。松動(dòng)可發(fā)生在壁的局部區(qū)域，在細(xì)胞壁中的靶組分處，或者松動(dòng)可一般地分散于整個(gè)細(xì)胞壁。例如，細(xì)胞壁松動(dòng)可在植物細(xì)胞的物理處理(例如超聲)、用細(xì)胞壁松動(dòng)組合物進(jìn)行化學(xué)處理、酶處理、化學(xué)處理和酶處理二者、或者超聲與用細(xì)胞壁松動(dòng)組合物處理的組合、或者滲入(使用真空或壓力)與用細(xì)胞松動(dòng)組合物處理的組合之后發(fā)生。細(xì)胞壁的松動(dòng)可導(dǎo)致細(xì)胞壁的部分消化。已經(jīng)歷處理以松動(dòng)細(xì)胞壁的植物細(xì)胞仍可包含經(jīng)修飾形式的植物細(xì)胞壁或植物細(xì)胞壁的一部分。細(xì)胞壁的松動(dòng)還可包括細(xì)胞壁的部分降解或去除，例如細(xì)胞壁的0%至約60%或其間的任意量被降解或去除，細(xì)胞壁的0%至約30%或其間的任意量被降解或去除，或者細(xì)胞壁的0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或其間的任意量被降解或去除。但是，還可以產(chǎn)生原生質(zhì)體、原生質(zhì)球或者原生質(zhì)體與原生質(zhì)球二者。在進(jìn)行如本文所述的一種或更多種處理以松動(dòng)細(xì)胞壁之后，細(xì)胞群體中的一些植物細(xì)胞可包含原生質(zhì)體，例如細(xì)胞群體的約0%至約50%或其間的任意量可包含原生質(zhì)體，例如細(xì)胞群體的0%至約30%或其間的任意量、0%至約10%或其間的任意量可包含原生質(zhì)體，或者細(xì)胞群體的 0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或其間的任意量可包含原生質(zhì)體。類似地，一些植物細(xì)胞可包含原生質(zhì)球，例如細(xì)胞群體的約0%至約90%或其間的任意量可包含原生質(zhì)球，例如細(xì)胞群體的O %至約60 %或其間的任意量、O %至約30 %或其間的任意量可包含原生質(zhì)球，或者細(xì)胞群體的0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90% 或其間的任意量可包含原生質(zhì)球。
[0062]術(shù)語“細(xì)胞壁松動(dòng)組合物”指導(dǎo)致細(xì)胞壁松動(dòng)的任何組合物，例如修飾細(xì)胞壁使得細(xì)胞壁中的組分被切割、部分切割、降解或部分降解的組合物；斷裂細(xì)胞壁組分之中或之間的分子間非共價(jià)鍵或共價(jià)鍵的組合物；或者減弱細(xì)胞壁、破碎細(xì)胞壁基質(zhì)的其它修飾；或者其組合。細(xì)胞壁松動(dòng)組合物的例子包括破碎或水解細(xì)胞壁組分的化學(xué)品、破碎或水解細(xì)胞壁組分的酶、破碎或水解細(xì)胞壁組分的生物品、或者破碎或水解細(xì)胞壁組分的化學(xué)品、生物品和酶中的至少兩種的任意組合。化學(xué)品的非限制性例子包括螯合劑(例如二價(jià)陽離子螯合劑例如EDTA或EGTA)、質(zhì)子供體、羥基自由基、氫氧化鉀、吲哚_3_乙酸、咪唑及其組合。生物品的非限制性例子包括生長(zhǎng)素(auxin)、擴(kuò)展蛋白(expansin)(例如一種或更多種α-擴(kuò)展蛋白或β-擴(kuò)展蛋白)及其組合。酶的非限制性例子包括葡聚糖酶、半乳糖醒酸酶、聚半乳糖醒酸酶、木聚糖酶、果膠酶、果膠水解酶(pectolyase)、果膠裂解酶(pectozymes)、果膠酯酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、纖維素酶、葡聚糖酶、內(nèi)_1，4_β -葡聚糖酶、木葡聚糖轉(zhuǎn)葡糖基水解酶、木葡聚糖內(nèi)切葡聚糖酶、木葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)葡糖基酶、纖維二糖水解酶(外切纖維素酶)、糖苷水解酶、葡糖苷酶、纖維二糖脫氫酶(氧化纖維素酶)、纖維素磷酸化酶、半纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶、及其組合。如下文的實(shí)施例(例如，實(shí)施例1)中所述，可以使用的酶混合物的非限制性例子是果膠酶MACEROZYME(YakultPharmaceuticals)和纖維素酶組合物 Onozuka R-1O (Yakult Pharmaceuticals)。在另一個(gè)非限制性實(shí)施例(實(shí)施例17 ;圖16)中，可以使用的酶混合物包含單獨(dú)使用或組合使用的果膠酶,例如 Biocatalyst s 162L> Biocatalysts444L> Biocatalysts PDN33。果膠酶或果膠酶組合物可以與纖維素酶(例如Multifect CX CG、Multifect CX B (Genencor)或其組合)一起使用。如果細(xì)胞壁松動(dòng)組合物包含可用于原生質(zhì)體制備的酶混合物(例如，如下文的實(shí)施例中所述:“VLP extraction by cell wall digestion”，實(shí)施例1和實(shí)施例17;還參見 PCT / CA2010 / 001489 或 PCT / CA2010 / 001488 ;其通過引用并入本文)，則所使用的酶的量、和/或消化時(shí)間或任何其他消化參數(shù)低于通常用于制備原生質(zhì)體的那些。例如，所使用的酶的量可以為通常用于制備原生質(zhì)體的量的0.1%至約75%，或者其間的任意量。例如，用作細(xì)胞壁松動(dòng)組合物的酶的量將產(chǎn)生包含0%至約50%或其間任意量的原生質(zhì)體的植物細(xì)胞組合物?；蛘?，用作細(xì)胞壁松動(dòng)組合物的酶的量可類似于用于制備原生質(zhì)體的量(例如，如實(shí)施例“通過細(xì)胞壁消化提取VLP”和實(shí)施例1 ;以及PCT /CA2010 / 001489或PCT / CA2010 / 001488 ;其通過引用并入本文)，但與通常用于制備原生質(zhì)體的孵育時(shí)間相比，該孵育時(shí)間降低約30%至約80%或其間的任意量。
[0063]可以使用例如真空滲入(參見實(shí)施例17 ;例如使用類似于D’Aoust等，2008PlantBiotechnology J.6:930-940 ；W000 / 063400 ；W000 / 037663 中所述的條件，它們均通過引用并入本文)或壓力滲入(例如使用約IkPa至約150kPa或其間任意量的壓力進(jìn)行約I分鐘至10小時(shí))將細(xì)胞壁松動(dòng)組合物(例如酶溶液或消化溶液)滲入整個(gè)植株、植物器官或整片葉中。整個(gè)植株指包含根、莖和葉的植物。植物器官指根系統(tǒng)、植物的地上部分(莖和葉)、葉被去除的莖、花、或者一片或更多片葉(有或沒有葉柄)。整片葉指從植物移除的一片或更多片葉(有或沒有葉柄)但仍是完整的，因其未切為更小的塊。如本文所述，細(xì)胞壁松動(dòng)組合物滲入例如整個(gè)植株或一片或更多片完整的葉中，使得整個(gè)植株或葉釋放蛋白質(zhì)、超結(jié)構(gòu)蛋白或VLP。不希望被理論所約束，當(dāng)細(xì)胞壁松動(dòng)組合物未滲入整片葉中時(shí)，需要葉中的組合物進(jìn)入點(diǎn)，使得酶組合物可逐步消化組織。例如，當(dāng)將細(xì)胞壁松動(dòng)組合物提供為浸潰葉的溶液時(shí)，酶消化從葉組織的暴露邊緣向內(nèi)部發(fā)生。使用機(jī)械攪拌導(dǎo)致原生質(zhì)體或原生質(zhì)球從果膠纖維基質(zhì)(pectocellulosic matrix)中釋放可以強(qiáng)化該過程。細(xì)胞壁松動(dòng)組合物的滲入可需要降低的機(jī)械攪拌(在強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間方面二者)，并且協(xié)助維持原生質(zhì)體完整性以及增加原生質(zhì)體產(chǎn)量。當(dāng)酶滲入葉(或器官或整個(gè)植株)中時(shí)，可以對(duì)葉(器官或植物)實(shí)施連續(xù)攪拌，但亦可無需攪拌。
[0064]通過用細(xì)胞壁松動(dòng)組合物處理細(xì)胞壁，植物來源的目的蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)可更易于釋放。通過使用包括細(xì)胞壁松動(dòng)步驟的方法，植物來源的目的蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)可被富集，因?yàn)榘蟛糠炙拗骷?xì)胞蛋白質(zhì)的細(xì)胞壁和原生質(zhì)體區(qū)室與所釋放的植物來源的目的蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)分離。
[0065]“植物來源的蛋白質(zhì)”、“蛋白質(zhì)”或“目的蛋白質(zhì)”(這些術(shù)語互換使用)指由核苷酸序列或編碼區(qū)編碼的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基，其表達(dá)于植物或植物部分中，包括植物或植物部分外源的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)亞基。蛋白質(zhì)的分子量可以為約I至約IOOkDa或其間任意量，例如 1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、IOOkDa或其間任意量。蛋白質(zhì)可以是單體、二聚體、三聚體或多聚體。
[0066]蛋白超結(jié)構(gòu)(也稱為超結(jié)構(gòu)蛋白、蛋白超級(jí)結(jié)構(gòu)或超級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白)是由2個(gè)或更多個(gè)多肽構(gòu)成的蛋白結(jié)構(gòu)。所述 多肽可以是相同或不同的；如果是不同的，則它們的存在比例可以為約1:1至約10:1或更高。超結(jié)構(gòu)蛋白可以包括但不限于蛋白花環(huán)、蛋白復(fù)合物、蛋白納米顆粒、糖蛋白、抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈單克隆抗體或病毒樣顆粒、蛋白酶體、代謝區(qū)室、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物、重組復(fù)合物、光合復(fù)合物、膜轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物、核孔復(fù)合物、嵌合蛋白、嵌合蛋白復(fù)合物、嵌合蛋白納米顆粒、嵌合糖蛋白、嵌合抗體、嵌合單克隆抗體、嵌合單鏈單克隆抗體或嵌合血凝素(HA)。如果蛋白超結(jié)構(gòu)是VLP，則VLP可以選自以下的組:病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白。植物來源的VLP可以包含流感(HA)。
[0067]通常，經(jīng)組裝的蛋白超結(jié)構(gòu)(蛋白超級(jí)結(jié)構(gòu))是大的，例如分子量大于75kDa，例如約75至約1500kDa或其間任意分子量。例如，蛋白超結(jié)構(gòu)的分子量可以為約75、80、85、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、850、900、950、1000、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500kDa 或其間的任意分子量。組合在一起形成蛋白超結(jié)構(gòu)的亞基可以具有較小的分子量，例如每個(gè)亞基的分子量為約IkDa至約500kDa或其間任意量。蛋白超結(jié)構(gòu)可以包括顯示二級(jí)結(jié)構(gòu)(具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸氫鍵，例如具有蛋白質(zhì)螺旋中的殘基)、三級(jí)結(jié)構(gòu)(具有三維構(gòu)型)或四級(jí)結(jié)構(gòu)(具有形成多亞基復(fù)合物的多個(gè)折疊蛋白或卷曲螺旋蛋白分子排布)的蛋白質(zhì)。
[0068]多蛋白復(fù)合物(或蛋白復(fù)合物)可以包含一組兩個(gè)或更多個(gè)相關(guān)聯(lián)多肽鏈。如果不同的多肽鏈含有不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，那么所得多蛋白復(fù)合物可具有多種催化功能。蛋白復(fù)合物還可以是多酶多肽，其在單個(gè)多肽鏈中包含多個(gè)催化結(jié)構(gòu)域。蛋白復(fù)合物通常是四級(jí)結(jié)構(gòu)形式。用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分離方案通常不能完整獲得但可以用本文所述方法獲得的蛋白復(fù)合物例子包括蛋白酶體(用于降解肽和蛋白質(zhì))、代謝區(qū)室(用于氧化能量產(chǎn)生)、核糖體(用于蛋白質(zhì)合成；例如描述于Pereira-Leal, J.B.;等，2006年，Philos Trans RSoc Lond B Biol Sc1.，361 (1467):507-517)、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物、重組復(fù)合物、光合復(fù)合物、膜轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物、核孔復(fù)合物。本方法可用于獲得以穩(wěn)定或較弱蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域-蛋白結(jié)構(gòu)域相互作用為特征的蛋白復(fù)合物。
[0069]蛋白質(zhì)或蛋白超結(jié)構(gòu)的例子包括:例如但不限于工業(yè)酶(例如纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、過氧化物酶、枯草溶菌素)；用于飼料、食品或飼料和食品用途二者的蛋白補(bǔ)充劑、營(yíng)養(yǎng)食品、價(jià)值增值產(chǎn)品(value-added product)或其片段；可用于免疫或接種的藥物活性蛋白質(zhì)(例如但不限于生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物、抗體、抗原及其片段或它們的衍生物)等。另一些目的蛋白質(zhì)可包括但不限于白介素(例如一種或多于一種的IL-1至IL-24、IL-26 和 IL-27)、細(xì)胞因子、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、胰島素、G_CSF、GM-CSF、hPG-CSF、M_CSF或其組合、干擾素(例如干擾素-α、干擾素-β、干擾素-Y)、、凝血因子(例如因子VII1、因子IX或tPA hGH)、受體、受體拮抗劑、抗體、神經(jīng)多肽、胰島素、疫苗、生長(zhǎng)因子(例如但不限于表皮生長(zhǎng)因子、角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素)、抗原、自身抗原、其片段或其組合。
[0070]蛋白超結(jié)構(gòu)的非限制性例子是抗體?？贵w是糖蛋白，其分子量為約100至約1000kDa或其間任意量?？贵w包含4條多肽鏈，即通過二硫鍵相連的2條輕鏈和2條重鏈。例如(不被視為限制)，每條輕鏈的分子量可以為約25kDa，例如約20kDa至約30kDa或其間任意量，或更大，例如約20kDa至約300kDa或其間任意量，并且輕鏈由2個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域和一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(CJ。每條重鏈的分子量可以為約50kDa，例如約30kDa至約75kDa或其間任意量，或更大，例如約30kDa至約500kDa或其間任意量，并且重鏈由恒定區(qū)和可變區(qū)組成。重鏈和輕鏈包含一些同源區(qū)段，其由相似但不相同的氨基酸序列組所組成。這些同源單元由約110個(gè)氨基酸組成并被稱為免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。重鏈包含一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(Vh)以及3個(gè)或4個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(CH1、Ch2、Ch3和CH4，取決于抗體的類別或者亞型)。ChI和(^2結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域被稱為鉸鏈區(qū)，并且使Y型抗體分子的2個(gè)Fab臂之間有柔性，使得它們分開和靠近以適應(yīng)與2個(gè)抗原性決定簇(被固定距離分隔開)的結(jié)合。
[0071]另一個(gè)蛋白超結(jié)構(gòu)的非限制性例子是VLP。VLP可以包括HAO前體形式，或通過二硫橋形式維持在一起的HAl或HA2結(jié)構(gòu)域。VLP的平均大小可以為約20nm至I μ m或其間任意量，例如 60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200nm或其間任意量，例如IOOnm,并且可以包含脂質(zhì)膜。
[0072]蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白還可以包含一種或更多種脂質(zhì)、磷脂、核酸、膜等。2個(gè)或更多個(gè)多肽可以通過共價(jià)鍵、二硫鍵、電荷相互作用、疏水吸引力、范德華力、氫鍵等連接。蛋白超結(jié)構(gòu)的例子是單克隆抗體、嵌合單克隆抗體、單鏈單克隆抗體或病毒樣顆粒(VLP)，VLP可以是包膜或非包膜的，例如病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白或病毒外殼蛋白。
[0073]蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白可在合適的宿主細(xì)胞(包括植物宿主細(xì)胞)中產(chǎn)生，如果期望可以進(jìn)一步純化。盡管本文示例了嵌合單克隆抗體、流感VLP和嵌合流感VLP，但是本文所述方法可以用于任何植物來源的胞漿蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白，或任何定位于或分泌到質(zhì)外體的植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白 。
[0074]本發(fā)明還提供了從植物或植物物質(zhì)回收植物來源的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的方法，該方法涉及獲取包含定位于質(zhì)外體內(nèi)容物中的植物來源蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的植物或植物物質(zhì)；用細(xì)胞壁松動(dòng)組合物、超聲或細(xì)胞壁松動(dòng)組合物和超聲二者處理植物或植物物質(zhì)以產(chǎn)生具有松動(dòng)細(xì)胞壁的植物或植物物質(zhì)，因而使得刺激、增加或增強(qiáng)質(zhì)外體內(nèi)容物釋放通過細(xì)胞壁，從而產(chǎn)生質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分；過濾質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分以產(chǎn)生經(jīng)過濾級(jí)分并且從經(jīng)過濾級(jí)分回收植物來源的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白。如果期望的話，可從經(jīng)過濾級(jí)分中純化植物來源的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的用于從質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分回收蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的替選方法，包括例如離心和傾析。
[0075]本發(fā)明還提供了回收蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的方法，其中所述蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白包含植物來源的脂質(zhì)包膜，例如包含VLP的植物來源的脂質(zhì)包膜。該方法包括獲取包含目的超結(jié)構(gòu)蛋白(例如VLP)的植物或植物物質(zhì)，用細(xì)胞壁松動(dòng)組合物、超聲或細(xì)胞壁松動(dòng)組合物和超聲二者處理所述植物或植物物質(zhì)以產(chǎn)生具有松動(dòng)細(xì)胞壁的植物或植物物質(zhì)，從而使得刺激、增加或增強(qiáng)質(zhì)外體內(nèi)容物釋放通過細(xì)胞壁，從而產(chǎn)生質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分；并將包含目的超結(jié)構(gòu)蛋白的植物來源的脂質(zhì)包膜與質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分分離。
[0076]給出植物組織培養(yǎng)物、培養(yǎng)的植物細(xì)胞和原生質(zhì)體、原生質(zhì)球生產(chǎn)等的一般原則的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)包括！Introduction to Plant Tissue Culture, MK Razdan編著，第二版(Science Publishers, 2003年；通過引用并入本文)，或例如參見下述 URL:molecular-plant-biotechnology.1nfo / plant-tissue-culture /protoplast-1solation.htm。與原生質(zhì)體(或原生質(zhì)球)的生產(chǎn)和操作相關(guān)的方法和技術(shù)綜述于，例如，Davey MR 等，2005 (Biotechnology Advances23:131-171 ;通過引用并入本文)。給出蛋白生物化學(xué)、分子生物學(xué)等的一般方法與原則的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)包括，例如Ausubel ^, Current Protocols In Molecular Biology, John ffiley&Sons, New York(1998年和2001年的增刊；通過引用并入本文)；Sambrook等，Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, 1989(通過引用并入本文)；Kaufman 等編著.，Handbook Of Molecular And Cellular Methods InBiology And Medicine, CRC Press, Boca Raton, 1995 (通過引用并入本文);McPherson 編著，Directed Mutagenesis:A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1991(通過引用并入本文)。
[0077]可用于修飾并且從而松動(dòng)細(xì)胞壁的酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可以包括纖維素酶(EC3.2.1.4)、果膠酶(EC3.2.1.15)、木聚糖酶(EC3.2.1.8)、幾丁質(zhì)酶(EC3.2.1.14)、半纖維素酶、木葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶葡聚糖酶、木葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶、內(nèi)切葡聚糖酶例如β-1，3-葡聚糖酶和β-1，4-甘露聚糖酶、木葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶/水解酶或其組合。纖維素酶是酶的混合物并且可包括一種或更多種內(nèi)-1，4-β -葡聚糖酶、纖維二糖水解酶(外切纖維素酶)、β_糖苷酶、纖維二糖脫氫酶(氧化纖維素酶)、纖維素磷酸化酶和半纖維素酶?？捎米骷?xì)胞壁松動(dòng)組合物的合適的酶的非限制性例子包括多組分酶的混合物，其包含纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶，例如MACEROZYME?(約含:纖維素酶:0.1U / mg,半纖維素酶:0.25U / mg,和果膠酶:0.5U / mg)。另一些商業(yè)化酶、酶混合物的例子和供應(yīng)商列于表 I (參見！Introduction to Plant Tissue Culture, MK Razdan 第二版，SciencePublishers, 2003 年)。
[0078]替代性的纖維素酶的名稱和種類包括內(nèi)-1，4-β -D-葡聚糖酶；β -1, 4-葡聚糖酶；β-1，4-葡聚糖內(nèi)切水解酶；纖維素酶A;Cellul0Sin AP;葡聚糖內(nèi)切酶D，堿性纖維素酶；纖維素酶A3 ;纖維素糊精酶(celludextrinase) ；9.5纖維素酶；微晶纖維素酶;pancellase SS和1，4_(1，3 ;1，4)-β-D-葡聚糖4_葡聚糖水解酶。替代性的果膠酶(多聚半乳糖醛酸酶)的名稱和種類包括果膠解聚酶；果膠酶；多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶；果膠酶(pectolase);果膠水解酶；果膠多聚半乳糖醒酸酶；多聚半乳糖醒酸內(nèi)切酶；多聚-α -1, 4-半乳糖醛酸聚糖水解酶；半乳糖醛酸內(nèi)切酶；內(nèi)-D-半乳糖醛酸酶和多聚(1，4-a-D-半乳糖醛酸)聚糖水解酶。替代性的木聚糖酶的名稱和種類包括半纖維素酶，內(nèi)-(I — 4) - β -木聚糖4-木聚糖水解酶；內(nèi)-1，4-木聚糖酶；木聚糖酶；β -1, 4-木聚糖酶；內(nèi)-1，4-木聚糖酶；內(nèi)-β -1，4-木聚糖酶；內(nèi)-1，4-β -D-木聚糖酶；1，4-β -木聚糖木聚糖水解酶木聚糖酶；β-1，4-木聚糖木聚糖水解酶；內(nèi)-1，4-0-木聚糖酶；3-D-木聚糖酶。替代性的幾丁質(zhì)酶的名稱和種類包括幾丁質(zhì)糊精酶；1，4-β-多聚-N-乙酰氨基葡糖苷酶；多聚-氨基葡糖苷酶；β -1, 4-多聚-N-乙酰氨基葡糖苷酶；多聚[1，4-(N-乙酰-β -D-氨基葡糖苷酶)]聚糖水解酶。
[0079]表1:用于細(xì)胞壁松動(dòng)的市售酶的非限制性實(shí)例
[0080]
【權(quán)利要求】
1.回收植物來源的蛋白質(zhì)或植物來源的超結(jié)構(gòu)蛋白的方法，其包括: a.獲取植物或植物物質(zhì)，其包含定位于質(zhì)外體的植物來源的蛋白質(zhì)或定位于質(zhì)外體的植物來源的超結(jié)構(gòu)蛋白； b.處理所述植物或植物物質(zhì)以松動(dòng)細(xì)胞壁，從而產(chǎn)生具有松動(dòng)細(xì)胞壁的植物或植物物質(zhì)，由此使得釋放包含所述植物來源的蛋白質(zhì)或所述植物來源的超結(jié)構(gòu)蛋白的質(zhì)外體級(jí)分；以及 c.回收所述包含所述植物來源的蛋白質(zhì)或所述植物來源的超結(jié)構(gòu)蛋白的質(zhì)外體級(jí)分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述處理步驟(步驟b)中包括化學(xué)處理、酶處理、生物處理、物理處理或其組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述物理處理包括超聲。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述化學(xué)處理包括用一種或多于一種螯合劑、質(zhì)子供體、羥基自由基、氫氧化鉀、吲哚-3-乙酸、咪唑或其組合進(jìn)行處理。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述酶處理包括酶滲入。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述酶滲入包括用一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶、或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶進(jìn)行滲入。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述螯合劑是乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇四乙酸(EGTA)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述生物處理包括用一種或更多種擴(kuò)展蛋白、生長(zhǎng)素或其組合進(jìn)行處理。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述酶處理包括用一種或多于一種果膠酶、一種或多于一種纖維素酶、或者一種或多于一種果膠酶和一種或多于一種纖維素酶進(jìn)行處理。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述酶組合物不包括脂肪酶、蛋白酶或果膠酶中的一種或更多種。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述獲取步驟(步驟a)中，用編碼所述蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白的核酸序列轉(zhuǎn)化所述植物，所述蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白選自以下的組:肽、蛋白質(zhì)、蛋白花環(huán)、蛋白復(fù)合物、蛋白酶體、代謝區(qū)室、轉(zhuǎn)錄復(fù)合物、重組復(fù)合物、光合復(fù)合物、膜轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物、核孔復(fù)合物、蛋白納米顆粒、糖蛋白、抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈單克隆抗體、病毒樣顆粒、病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白、嵌合蛋白、嵌合蛋白復(fù)合物、嵌合蛋白納米顆粒、嵌合糖蛋白、嵌合抗體、嵌合單克隆抗體、嵌合單鏈單克隆抗體、嵌合血凝素、病毒包膜蛋白、病毒結(jié)構(gòu)蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白，以及收獲所述植物或植物物質(zhì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述核酸以瞬時(shí)方式引入所述植物中。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述核酸穩(wěn)定整合進(jìn)所述植物的基因組。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述獲取步驟(步驟a)中，培養(yǎng)所述植物并收獲所述植物或植物物質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述核酸編碼單克隆抗體或流感血凝素。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白不包括神經(jīng)氨酸酶或M蛋白。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物物質(zhì)選自葉和培養(yǎng)植物細(xì)胞的組。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其還包括步驟d)從所述質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分中純化所述植物來源的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述純化步驟d)包括利用深層過濾來過濾所述質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分以產(chǎn)生澄清的提取物，然后用體積排阻層析、陽離子交換樹脂或親和層析或者其組合來進(jìn)行所述澄清提取物的層析。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其還包括步驟d)將所述質(zhì)外體內(nèi)容物級(jí)分中的蛋白質(zhì)或超結(jié)構(gòu)蛋白與細(xì)胞碎片和不溶物質(zhì)分離。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述分離步驟d)通過離心、深層過濾或其組合進(jìn)行。`
【文檔編號(hào)】C07K14/415GK103502261SQ201280014186
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月23日
【發(fā)明者】馬農(nóng)·科圖雷, 達(dá)尼·帕克特, 路易斯-菲利普·韋齊納 申請(qǐng)人:麥迪卡格公司