專利名稱：適于動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的無(wú)動(dòng)物來(lái)源低蛋白培養(yǎng)基的制作方法
適于動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的無(wú)動(dòng)物來(lái)源低蛋白培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及現(xiàn)代生物技術(shù)之培養(yǎng)基研發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種適 于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)及抗體、融合蛋白等重組蛋白藥物產(chǎn)品生產(chǎn)的無(wú)動(dòng)物 來(lái)源低蛋白培養(yǎng)基。
技術(shù)背景
動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是當(dāng)今生物工程領(lǐng)域中的前沿課題之一，無(wú)論是基礎(chǔ)
研究還是生產(chǎn)實(shí)踐方面都得到生物技術(shù)界的重視。2000年以來(lái)，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的 所有創(chuàng)新生物技術(shù)藥物中，用酵母表達(dá)的只有2種，用大腸桿菌表達(dá)的只有6 種，而用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)或生產(chǎn)的藥物達(dá)到55種，占70%以上。2003年6 月 2004年6月全球銷售額最高的10個(gè)生物技術(shù)藥物中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá) 的產(chǎn)品占8個(gè)，并且年銷售額超過20億美元的前6位的生物技術(shù)藥物全部是 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品。2005年全球生物技術(shù)藥物銷售額超過500億美元， 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品占70%。至2007年末，僅單克隆抗體藥物的銷售額就 達(dá)到260億美元，預(yù)計(jì)至2013年其銷售額將達(dá)到490億美元。應(yīng)用無(wú)血清培 養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞的規(guī)?；囵B(yǎng)及重組蛋白表達(dá)生產(chǎn)已成為一種趨勢(shì)。
隨著哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模的擴(kuò)大和生物藥物需求的增長(zhǎng)，基于細(xì)胞及 產(chǎn)品特性的無(wú)血清培養(yǎng)基的研制已成為細(xì)胞工程領(lǐng)域的重要課題。在疫苗生 產(chǎn)、單克隆抗體和各種生物活性蛋白等生物制品的應(yīng)用領(lǐng)域中，優(yōu)化無(wú)血清 培養(yǎng)基的成分，使工程細(xì)胞在最有利于其生長(zhǎng)和目的產(chǎn)物表達(dá)的培養(yǎng)環(huán)境中 維持較高的活細(xì)胞密度和較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間，是降低生產(chǎn)成本的有效方法。
與傳統(tǒng)的有血清培養(yǎng)基相比，無(wú)血清培養(yǎng)基具有諸多優(yōu)勢(shì)第一，無(wú)批 次差異、無(wú)不明血清組分對(duì)細(xì)胞的影響；第二，避免了血清中外源性污染及 對(duì)細(xì)胞的毒害作用；第三，使產(chǎn)品易于純化，提高回收率；第四，成分明確， 有利于研究細(xì)胞的生理狀態(tài)，可根據(jù)不同細(xì)胞株設(shè)計(jì)和優(yōu)化能支持其高密度培養(yǎng)和產(chǎn)物高水平表達(dá)的培養(yǎng)基。此外，無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)也是進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)、 增殖、分化及基因表達(dá)調(diào)控等基礎(chǔ)研究的關(guān)鍵技術(shù)之一。
無(wú)血清培養(yǎng)基的開發(fā)與優(yōu)化，主要有以下兩個(gè)發(fā)展方向 一是不添加任 何動(dòng)物來(lái)源的成分；二是降低培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)含量。據(jù)此，無(wú)血清培養(yǎng)基可 以分為以下三種
(一) 傳統(tǒng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，即用各類可替代血清功能的組分配制而成， 如添加牛血清白蛋白(BSA)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、從血清中提取的混合脂類 及水解蛋白等組分，其特點(diǎn)是蛋白含量高，含有大量動(dòng)物來(lái)源蛋白。
(二) 無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分的培養(yǎng)基，即祛除培養(yǎng)基中的動(dòng)物來(lái)源成分。由 于動(dòng)物來(lái)源成分中可能含有潛在的朊蛋白和病毒污染的危險(xiǎn)，因此，在培養(yǎng) 基中必須慎用動(dòng)物來(lái)源成分，這樣才可確保生產(chǎn)的重組蛋白安全可靠。
(三) 低蛋白或無(wú)蛋白培養(yǎng)基，即減少或祛除培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)成分。降 低培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)含量，可減少產(chǎn)物的分離純化步驟，提高目標(biāo)蛋白的回 收率和品質(zhì)，保證批次間的一致性，從而實(shí)現(xiàn)整個(gè)生產(chǎn)過程的高效率和經(jīng)濟(jì) 性。
綜上所述，動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的開發(fā)與優(yōu)化是朝著"無(wú)動(dòng)物來(lái)源、 無(wú)蛋白"的方向發(fā)展的。
經(jīng)過幾十年的發(fā)展，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如雜交瘤、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、 NS0等〕無(wú)血清培養(yǎng)基技術(shù)已取得了可喜的進(jìn)展
Darf ler等人開發(fā)了 CITTL無(wú)血清培養(yǎng)基，以DMEM/F12 (1:1)為基礎(chǔ)培養(yǎng) 基，添加了 5mg/L的過氧化氫酶、1.5mg/L的胰島素、1. 5 3. Omg/L的轉(zhuǎn)鐵 蛋白、2nmol/L睪酮、0. 5mg/L的二亞油酰磷脂膽堿和1. 5mg/L的e -甘油磷 酸，可支持sf9細(xì)胞的克隆化生長(zhǎng)，也可用于雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)。
Murakami等人開發(fā)了無(wú)血清培養(yǎng)基，以DMEM/F12 (1:1)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 添加了5mg/L胰島素、2 35mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、20 u mol/L乙醇胺和lnmol/L亞 硒酸鈉等物質(zhì)，這就是現(xiàn)被廣泛使用的DMEM/F12-ITES配方。
Kover和Frank開發(fā)了無(wú)血清培養(yǎng)基，以RPMI1640為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添 加10mg/L胰島素、5mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、20umol/L乙醇胺、5mg/L亞油酸、lg/L牛血清蛋白、3mg/L抗壞血酸、2ug氫化可的松和12種微量元素，可支持幾 種細(xì)胞的生長(zhǎng)。
美國(guó)專利U. S. P. 4927762公開了一種含有抗氧化劑的培養(yǎng)基，闡述了細(xì) 胞在還原性介質(zhì)中能更好地生長(zhǎng)，同時(shí)指出，N-乙酰半胱氨酸、硫乳酸、巰 基乙醇等物質(zhì)的添加可以起到抗氧化的作用。
美國(guó)專利U. S. P. 4767704主要就微量元素的添加進(jìn)行了研究，通過對(duì)銅、 鐵、鎂、鋅、硅、錳、釩、鎳、錫、鋁、鈣、溴、氯、碘、硒、鍺等元素和 孕酮、腐胺、油酸、嘧啶等物質(zhì)的添加，開發(fā)出了一種無(wú)蛋白培養(yǎng)基，使人 們認(rèn)識(shí)到微量元素的重要性。
Jinyou Zhang等人以Fe-Na2Se04混合物替代轉(zhuǎn)鐵蛋白，研制出的卵巢細(xì) 胞(CHO)無(wú)蛋白培養(yǎng)基能支持較高的活細(xì)胞密度。但Fe-Na2Se(V混合物的配 制十分復(fù)雜，條件苛刻，不適用于規(guī)?；a(chǎn)。
目前，以Gibico， Hyclone、 JRH等為代表的商業(yè)無(wú)血清、無(wú)蛋白培養(yǎng)基 也已相繼問世。在已有的無(wú)血清培養(yǎng)基中，有些無(wú)法實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)過程； 有些雖能很好地支持細(xì)胞生長(zhǎng)，但可能導(dǎo)致細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物能力降低，甚至喪 失；此外，商業(yè)無(wú)血清培養(yǎng)基的配方常屬商業(yè)機(jī)密，且組分復(fù)雜、價(jià)格昂貴， 既不利于特定細(xì)胞株培養(yǎng)技術(shù)的研究，也無(wú)法直接用于細(xì)胞培養(yǎng)過程的研究、 開發(fā)和優(yōu)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適于動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品生 產(chǎn)的無(wú)動(dòng)物來(lái)源低蛋白培養(yǎng)基，以適應(yīng)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)及工業(yè)生產(chǎn)重組 蛋白藥物產(chǎn)品的需要。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為
一種適于動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的無(wú)動(dòng)物來(lái)源低蛋白培養(yǎng)基，其特征是，采 用大豆水解物替代動(dòng)物來(lái)源成分(如，牛血清白蛋白等)，采用硫酸亞鐵、硝
酸鐵和EDTA 2Na的組合物替代轉(zhuǎn)鐵蛋白，其成分包括基礎(chǔ)代謝營(yíng)養(yǎng)物類、 維生素類、轉(zhuǎn)鐵蛋白替代物、脂類、核酸類、激素及生長(zhǎng)因子類、抗氧化劑類、抗剪切保護(hù)劑、PH指示劑、pH緩沖劑和其他無(wú)機(jī)鹽類；
——所述的基礎(chǔ)代謝營(yíng)養(yǎng)物類包括葡萄糖、大豆水解物、丙酮酸鈉、
谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷
氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、
脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸；
——所述的維生素類包括生物素、維生素、氯化膽堿、葉酸、肌醇、
煙酰胺、泛酸鈣、維生素B6、核黃素、維生素B1、硫辛酸；
——所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白替代物類包括硫酸亞鐵、硝酸鐵、EDTA 2Na; ——所述的脂類包括乙醇胺、吐溫80、魚肝油、膽固醇、亞油酸； ——所述的核酸類包括胸苷、次黃嘌呤；
——所述的激素及生長(zhǎng)因子類包括孕酮、氫化可的松、重組胰島素、 腐胺；
——所述的抗氧化劑類包括亞硒酸鈉、生育酚、?；撬?； ——所述的抗剪切保護(hù)劑為嵌段式聚醚F68;
——所述的pH指示劑為酚紅；
——所述的pH緩沖劑包括碳酸氫鈉、H印es;
——所述的其他無(wú)機(jī)鹽類包括氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鉀、磷
酸二氫鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、硫酸鋅、硫酸銅。
一種適于動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的無(wú)動(dòng)物來(lái)源低蛋白培養(yǎng)基，其各種成分的
含量為(毫克/升)
葡萄糖(。-Glucose) 2000 7000
大豆水解物 aucmtone Soy)500 1000
丙酮酸鈉(Sodium Pyruvate )55 220
谷氨酰胺(L-Glutamine)200 900
丙氨酸(L-Alanine)4 15
精氨酸(廣Arginine'HCl)100 300
天冬酰胺(L-Asparagine H20)6 15
天冬氨酸(L-Aspartic Acid)6 15半胱氨酸(^Cysteine* H20) 胱氨酸(L-Cystine2HC1) 谷氨酸(「Glutamic Acid ) 甘氨酸(Glycine) 組氨酸(L-Histidine HCl H20) 異亮氨酸(「Isoleucine) 亮氨酸"eucine) 賴氨酸(廠Lysine HCl) 甲硫氨酸^-Methionine) 苯丙氨酸(「Phenyalanine) 脯氨酸C"Proline) 絲氨酸(L-Serine) 蘇氨酸(^-Threonine) 色氨酸(L-Tryptoph肌) 酪氨酸(L-Tyrosine 2Na 2H20) 纈氨酸(^Valine) 生物素(Biotin) 維生素B12 (Vitamin B12) 氯化膽堿(Choline Chloride) 葉酸(Folic acid) 肌醇(廠Nositol) 煙酰胺 (Niacinamide) 泛酸轉(zhuǎn) (D-Ca Pantothenate) 維生素B6 (Pyridoxine HCl) 核黃素(Riboflavin) 維生素Bl (Thiamine HCl) 硫辛酸(Xipoic acid) 硫酸亞鐵 (FeS04 7H20) 硝酸鐵(Fe(N03)3'9H20)
15 50
30 65
5 20
15 40
15 40
50 100
50 150
80 185
15 35
30 70
10 34. 5
20 52. 5
50 107
9 18
55 120 50 120
0. 0035 0. 0105 0. 50 2. 50 8. 50 30 2. 50 8 12 30 2 7 2 8 2 8 0. 2 0. 7
2 8 0. 08 0. 50 0. 417 5 0. 05 0. 8EDTA 2Na
乙醇胺 (Ethanolamine) 吐溫80 (Tween 80) 魚肝油(Cod liver oil) 膽固醇(Cholesterol) 亞油酸 (Unoleic acid) 胸苷(Thymidine) 次黃嘌呤(Hypoxanthine ) 孕酮 (Progesterone) 氫化可的松 (Hydrocortisone 重組胰島素 (Insulin) 腐胺 (Sodium Putrescine HCl) 亞硒酸鈉(Sodium Selenate) 生育酚(a -Tocohcrol acetate ?；撬?Taurin) 嵌段式聚醚F68 (Pluronic-F68) 酚紅(Phenol Red) 碳酸氫鈉 (NaHC03) Hepes
氯化鈣(CaCl2) 氯化鎂(MgCl2) 硫酸鎂(MgS04) 氯化鉀(KC1)
磷酸二氫鈉(NaH2P04 *H20)
氯化鈉(NaCl) 磷酸氫二鈉(Na2HP04)
硫酸鋅(ZnS04*7H20) 硫酸銅(CuS04 5H20)
2 10 3 10 0. 24 0. 5 0. 1 0. 2 0. 045 0. 1 0. 042 0. 084 0. 4 2. 5 2 20 0. 003 0. 012 HCl) 0. 036 0. 072 3 8 0. 08 20 0. 02 0. 08 ) 1 4 20 50 500 2000
8. 1 2450
2000 5000 110 150 40 75 45 65 310 400 60 120 6995. 5 55 120 0. 432 1.25 0. 0013 0. 0065本發(fā)明的積極效果是
(1) 不含動(dòng)物來(lái)源成分，總蛋白含量低于io毫克/升，有利于產(chǎn)物的分 離純化，適于動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白類藥物產(chǎn)品生產(chǎn)，安全可靠。
(2) 支持動(dòng)物細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、重組蛋白表達(dá)和長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，無(wú)需適 應(yīng)即可使用，其最高活細(xì)胞密度及重組蛋白產(chǎn)量均超過已知的商業(yè)培養(yǎng)基。
(3) 成分簡(jiǎn)單，配制方便，適合于動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)。


附圖為CHO細(xì)胞在本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物來(lái)源低蛋白培養(yǎng)基中批培養(yǎng)生長(zhǎng)和產(chǎn) 物表達(dá)曲線的坐標(biāo)圖。
具體實(shí)施方式
以下對(duì)本發(fā)明適于動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的無(wú)動(dòng)物來(lái)源低蛋白培養(yǎng)基的實(shí)施 例進(jìn)行具體說(shuō)明，但本發(fā)明不限于以下的實(shí)施方式。
一種適于動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的無(wú)動(dòng)物來(lái)源低蛋白培養(yǎng)基，包括24種基礎(chǔ) 代謝營(yíng)養(yǎng)物、ll種維生素、3種轉(zhuǎn)鐵蛋白替代物類化合物、5種脂類化合物、 2種核酸類化合物、4種激素及生長(zhǎng)因子、3種抗氧化劑、l種抗剪切保護(hù)劑、 l種pH指示劑、2種pH緩沖劑、9種其他無(wú)機(jī)鹽，各種成分的含量為(毫克/ 升)
葡萄糖(d-Glucose) 4500 大豆水解物 (Lucratone Soy) 1000 丙酮酸鈉(Sodium Pyruvate ) 55 谷氨酰胺(L-Glutamine) 584.6 丙氨酸(L-Alanine) 5 精氨酸(L-Arginine HC1) 155 天冬酰胺(L-AsparagineH20) 7. 5
天冬氨酸(L-Aspartic Acid) 6. 65
半胱氨酸(L-CysteineH20) 17. 56
ii胱氨酸(L-Cystine2HC1)31. 29
谷氨酸(L-Glutamic Acid )7. 35
甘氨酸(Glycine)18. 75
組氨酸(L-Histidine HCl H20)18. 75
異亮氨酸(L-Isoleucine)54. 47
亮氨酸(「Leucine)59. 05
賴氨酸(「Lysine HCl)91.25
甲硫氨酸(「Methionine)17. 24
苯丙氨酸(「Phe孝l肌ine)35. 48
脯氨酸(^-Proline)17. 25
絲氨酸(L-Serine)26. 25
蘇氨酸(^-Threonine)53. 45
色氨酸(L-Tryptophan)9. 02
酪氨酸(L-Tyrosine 2Na 2H20)55. 79
纈氨酸(廠Valine)52. 85
生物素(Biotin)0.0105
維生素B12 (Vitamin B12)2. 04
氯化膽堿(Choline Chloride)26. 94
葉酸(Folic acid)7. 95
肌醇(廠Nositol)12.6
煙酰胺 (Niacinamide)6. 06
泛酸f5 (D-Ca Pantothenate)6. 72
維生素B6 (Pyridoxine HCl)6. 093
核黃素(Riboflavin)0. 657
維生素Bl (Thiamine HCl)6.51
硫辛酸(Lipoic acid)0. 305
硫酸亞鐵 (FeS04 7H20)1.217
硝酸鐵(Fe(N03)3 9H20)0. 65EDTA 2Na 5
乙醇胺 (Ethanolamine) 9
吐溫80 (Tween 80) 0. 24
魚肝油(Cod liver oil) 0. 1
膽固醇(Cholesterol) 0.045
亞油酸 (Linoleic acid) 0.042
胸苷(Thymidine) 2.365
次黃嘌呤(Hypoxanthine ) 10
孕酮 (Progesterone) () 006 氫化可的松 (Hydrocortisone' HCl) 0.036
胰島素 (Insulin) 8
腐胺(Sodium Putrescine HCl) 0. 081
亞硒酸鈉(Sodium Selenate) 0. 0519
黃體酮(a -Tocohcrol acetate ) 2
?；撬?Taurin) 30
嵌段式聚醚F68 (Pluronic-F68) 1000
酚紅(Phenol Red) 8. 1
碳酸氫鈉 (NaHC03) 2450
H印es 3500
氯化f! (CaCl2) 116.6
氯化鎂(MgCl2) 40.4
硫酸鎂(MgS04) 48.84
氯化鉀(KC1) 311.8
磷酸二氫鈉(NaH2P04 'HsO) 120
氯化鈉(NaCl) 6995.5 磷酸氫二鈉(Na2HP04) 110
硫酸銅 (CuS04 5H20) 0. 006
硫酸鋅(ZnS04*7H20) 0.432 。
13將上述組分溶解于三次蒸餾水中，即可配制成適于動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的 無(wú)動(dòng)物來(lái)源低蛋白培養(yǎng)基。
使用本發(fā)明所述的無(wú)動(dòng)物來(lái)源低蛋白培養(yǎng)基，將表達(dá)抗CD20嵌合單克隆 抗體的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)接種于2升生物反應(yīng)器中，接種密度為 2. 39X105細(xì)胞/毫升，接種時(shí)細(xì)胞活性為98. 45%;細(xì)胞在此2升反應(yīng)器中進(jìn) 行155小時(shí)的批培養(yǎng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的平均比生長(zhǎng)速率為0.652天—、最大活細(xì) 胞密度達(dá)3. 75X106細(xì)胞/毫升，細(xì)胞擴(kuò)增15.7倍，最大單抗?jié)舛葹?03毫克 /升，活細(xì)胞密度對(duì)時(shí)間的積分值為13.41乂109細(xì)胞*天，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期單位細(xì) 胞每天的抗體產(chǎn)量達(dá)15. 88毫克/109細(xì)胞 天。
附圖為CHO細(xì)胞在本發(fā)明的無(wú)動(dòng)物來(lái)源低蛋白培養(yǎng)基中批培養(yǎng)生長(zhǎng)和產(chǎn) 物表達(dá)曲線的坐標(biāo)圖，附中， 活細(xì)胞曲線； ■ 死細(xì)胞曲線； ▲ 總細(xì)胞曲線； □ 產(chǎn)物曲線。
從附圖的曲線可以得知，本發(fā)明適于動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的無(wú)動(dòng)物來(lái)源低 蛋白培養(yǎng)基能良好地支持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)，其最高活細(xì)胞密度及 產(chǎn)物濃度均超過已知的商業(yè)培養(yǎng)基。
權(quán)利要求
1、一種適于動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的無(wú)動(dòng)物來(lái)源低蛋白培養(yǎng)基，其特征在于，采用大豆水解物替代動(dòng)物來(lái)源成分，采用硫酸亞鐵、硝酸鐵和EDTA·2Na的組合物替代轉(zhuǎn)鐵蛋白，其成分包括基礎(chǔ)代謝營(yíng)養(yǎng)物類、維生素類、轉(zhuǎn)鐵蛋白替代物、脂類、核酸類、激素及生長(zhǎng)因子類、抗氧化劑類、抗剪切保護(hù)劑、pH指示劑、pH緩沖劑和其他無(wú)機(jī)鹽類；——所述的基礎(chǔ)代謝營(yíng)養(yǎng)物類包括葡萄糖、大豆水解物、丙酮酸鈉、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸；——所述的維生素類包括生物素、維生素、氯化膽堿、葉酸、肌醇、煙酰胺、泛酸鈣、維生素B6、核黃素、維生素B1、硫辛酸；——所述的轉(zhuǎn)鐵蛋白替代物類包括硫酸亞鐵、硝酸鐵、EDTA·2Na；——所述的脂類包括乙醇胺、吐溫80、魚肝油、膽固醇、亞油酸；——所述的核酸類包括胸苷、次黃嘌呤；——所述的激素及生長(zhǎng)因子類包括孕酮、氫化可的松、重組胰島素、腐胺；——所述的抗氧化劑類包括亞硒酸鈉、生育酚、?；撬?；——所述的抗剪切保護(hù)劑為嵌段式聚醚F68；——所述的pH指示劑為酚紅；——所述的pH緩沖劑包括碳酸氫鈉、Hepes；——所述的其他無(wú)機(jī)鹽類包括氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鉀、磷酸二氫鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、硫酸鋅、硫酸銅。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的適于動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的無(wú)動(dòng)物來(lái)源低蛋白培養(yǎng)基，其特征在于，各種成分的含量為(毫克/升)葡萄糖 2000 7000大豆水解物 500 1000丙酮酸鈉 55 220谷氨酰胺 200 900丙氨酸4 15精氨酸100 300天冬酰胺6 15天冬氨酸6 15半胱氨酸15 50胱氨酸30 65谷氨酸5 20甘氨酸15 40組氨酸15 40異亮氨酸50 100亮氨酸50 150賴氨酸80 185甲硫氨酸15 35苯丙氨酸30 70脯氨酸10 34. 5絲氨酸20 52. 5蘇氨酸50 107色氨酸9 18酪氨酸55 120纈氨酸50 120生物素0. 0035 0. 0105維生素B120. 50 2. 50氯化膽堿8. 50 30葉酸2. 50 8肌醇12 30煙酰胺2 7泛酸鈣2 8維生素B62 8核黃素0. 2 0. 7維生素Bl2 8硫辛酸0. 08 0. 50硫酸亞鐵0. 417 5硝酸鐵0. 05 0. 8EDTA 2Na2 10乙醇胺3 10吐溫800. 24 0. 5魚肝油0. 1 0. 2膽固醇0. 045 0. 1亞油酸0. 042 0. 084胸苷0. 4 2. 5次黃嘌呤2 20孕酮0. 003 0. 012氫化可的松0. 036 0. 072重組胰島素3 8腐胺0. 08 20亞硒酸鈉0. 02 0. 08生育酚1 4?；撬?0 50嵌段式聚醚F68500 2000酚紅8. 1碳酸氫鈉2450Hepes2000 5000氯化鈣110 150氯化鎂40 75硫酸鎂45 65氯化鉀310 400磷酸二氫鈉60 120氯化鈉6995. 5磷酸氫二鈉55 120硫酸鋅0. 432 1.25硫酸銅0. 0013 0. 0065。
全文摘要
本發(fā)明適于動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品生產(chǎn)的無(wú)動(dòng)物來(lái)源低蛋白培養(yǎng)基，包括24種基礎(chǔ)代謝營(yíng)養(yǎng)物、11種維生素、3種轉(zhuǎn)鐵蛋白替代物類化合物、5種脂類化合物、2種核酸類化合物、4種激素及生長(zhǎng)因子、3種抗氧化劑、1種抗剪切保護(hù)劑、1種pH指示劑、2種pH緩沖劑、9種其他無(wú)機(jī)鹽，采用大豆水解物替代動(dòng)物來(lái)源成分，采用硫酸亞鐵、硝酸鐵和EDTA·2Na的組合物替代轉(zhuǎn)鐵蛋白；將上述組分溶解于三次蒸餾水中，可制得所述的培養(yǎng)基；其積極效果是不含動(dòng)物來(lái)源成分，總蛋白含量低于10毫克/升，有利于產(chǎn)物的分離純化，適于重組蛋白類藥物生產(chǎn)，支持動(dòng)物細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，無(wú)需適應(yīng)即可使用，配制方便，適于動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P21/02GK101603026SQ20091005350
公開日2009年12月16日 申請(qǐng)日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者燕 周, 譚文松, 亮 趙, 飛 陳 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)