專利名稱:編碼源自于麻風(fēng)樹屬樹的nf-yb的多核苷酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及作為麻風(fēng)樹屬樹的新基因的、編碼NF-YB轉(zhuǎn)錄因子的多核苷酸及其應(yīng)用,特別是用于產(chǎn)生干旱脅迫抗性的麻風(fēng)樹屬樹的應(yīng)用。
背景技術(shù):
因?yàn)閺穆轱L(fēng)樹(Jatropha curcas)可以產(chǎn)生非食用麻風(fēng)樹屬樹油,因此,麻風(fēng)樹作為用于生產(chǎn)生物柴油燃料的生物資源引起了人們的注意。此外,已知麻風(fēng)樹屬樹是甚至可以在就水和無機(jī)營養(yǎng)物而言不適合其他作物生長的地方栽培的植物,并且麻風(fēng)樹屬樹被認(rèn)為非常有利于半干旱地區(qū)的有效利用和綠化。另一方面,雖然麻風(fēng)樹屬植物生長在貧瘠之地,但通過自然栽培獲得的油的生產(chǎn)效率不高,因?yàn)樵撝参锏拈_花結(jié)果為一年一次,并且果實(shí)的大小顯著小于手掌的大小。出于這個原因,需要開發(fā)高生產(chǎn)力的麻風(fēng)樹屬樹。作為對麻風(fēng)樹屬樹油生產(chǎn)效率提高的一種度量,已知有一種轉(zhuǎn)化麻風(fēng)樹屬樹的方法,使得乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)可以被過表達(dá)用于提高種子的含油量,例如公開在日本國家專利公布No. 2009-536029 (PTL I)中。另一方面,從提高麻風(fēng)樹屬樹本身的生產(chǎn)率的角度來說,還可以想到的是賦予耐旱性以確保甚至在缺水條件下的高生存能力。一般來說,植物的生長受環(huán)境因素例如干旱、鹽和低溫的影響很大,因此,開發(fā)賦予了環(huán)境脅迫抗性的農(nóng)作物是所期望的??梢韵氲降氖歉珊得{迫抗性的基因重組植物一其中脅迫響應(yīng)性信號強(qiáng)度和機(jī)制被改變以便適應(yīng)干旱脅迫或?qū)Ω珊得{迫有響應(yīng),以及用于實(shí)現(xiàn)過度生產(chǎn)參與抗性的蛋白質(zhì)分子(對環(huán)境脅迫有響應(yīng)的蛋白質(zhì))的改進(jìn)的方法等。植物的環(huán)境脅迫響應(yīng)性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑一般分為植物激素脫落酸(ABA)介導(dǎo)的途徑和非ABA介導(dǎo)的途徑,并根據(jù)參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的類型進(jìn)一步細(xì)分。另外已知的是根據(jù)參與響應(yīng)的蛋白質(zhì),參與響應(yīng)的調(diào)節(jié)性蛋白質(zhì)例如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、蛋白酶和蛋白激酶,以及引起抗性的功能蛋白例如伴侶蛋白,并且它們被認(rèn)為參與了各種生理反應(yīng)(KazuoShinozaki等,朝倉植物生理學(xué)課程5《環(huán)境響應(yīng)》(Asakura Plant Physiology Course 5,“Environmental response,,),pp. 106-1145)。脫落酸(ABA)是一種參與種子的休眠、氣孔的打開/關(guān)閉以及滲透脅迫抗性的植物激素,并且已知ABA深入地參與一組脅迫響應(yīng)性基因的表達(dá)。例如,NPL I (Wen-Xue Li等,“轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控擬南芥NFYA5轉(zhuǎn)錄因子以促進(jìn)干旱抗性(The Arabidopsis NFYA5Transcription Factor Is RegulatedTranscriptionally and Posttranscriptionally to Promote Drought Resistance),,,The Plant Cell, Vol. 20 :2238-2251 (2008))報告了 NF-YA5 轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥(Arabidopsis thaliana)的干旱脅迫抗性調(diào)控機(jī)制中是ABA依賴性的并被干旱脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo),以及過表達(dá)NF-YA5的轉(zhuǎn)化的擬南芥在對干旱脅迫的抗性方面優(yōu)于野生型擬南芥。作為制備環(huán)境脅迫抗性的擬南芥的方法,日本專利特開No. 2005-253395 (PTL 2)提出了一種方法,所述方法利用了一組在轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下的基因的激活功能,所述轉(zhuǎn)錄因子通過與由于環(huán)境脅迫引起表達(dá)的脅迫響應(yīng)性蛋白質(zhì)的編碼基因上游所存在的順式元件結(jié)合來激活轉(zhuǎn)錄(脅迫響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子)。具體地,所述PTL 2公開了 SRK2C基因是誘導(dǎo)DREB/CBF表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的新編碼基因,其中DREB/CBF是脅迫響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子,并且所述公報還公開了轉(zhuǎn)化后過表達(dá)SRK2C基因的擬南芥即使在停止供水后仍顯示出顯著高于對照的存活率。此外,NPL 2 (Donald Ε· Nelson等,“植物核因子Y (NF-Y)B亞單位賦予耐旱性并導(dǎo)致玉米在水受限土地上的產(chǎn)率提高(Plant nuclear factor Y(NF-Y)B subunits conferdrought tolerance and lead to improved corn yields on water-limited acres),,,PNAS,vol. 104,No. 42,16450-16455 (2007))報告了,鑒定了玉米 NF-YB 因子,并且用該因子轉(zhuǎn)化后的玉米在缺水條件下顯示出與野生型相比更高的生產(chǎn)率。此外,在日本國家專利公布No. 2009-540830 (PTL 3)中,對于缺水脅迫抗性植物水稻、玉米、大豆和棉花,公開了其中導(dǎo)入了這樣的轉(zhuǎn)錄單元的植物,即所述轉(zhuǎn)錄單元含有 與擬南芥、玉米或大豆的NF-YB蛋白的編碼DNA可操作地連接的啟動子。據(jù)報道,通過設(shè)計啟動子等,被改性成能夠過表達(dá)NF-YB的轉(zhuǎn)化植物的產(chǎn)率即使在缺水條件下仍高于野生型對照的產(chǎn)率。引用列表專利文獻(xiàn)PTL I :日本國家專利公布 No. 2009-536029PTL 2 :日本專利特開 No. 2005-253395PTL 3 :日本國家專利公布 No. 2009-540830非專利文獻(xiàn)NPL I =Wen-Xue Li等,“轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控擬南芥NFYA5轉(zhuǎn)錄因子以促進(jìn)干旱抗性(The Arabidopsis NFYA5 Transcription Factor Is Regulated Transcriptionallyand Posttranscriptionally to Promote Drought Resistance),,,The Plant Cell,Vol. 20 :2238-2251 (2008)NPL 2 =Donald E. Nelson等,“植物核因子Y (NF-Y) B亞單位賦予干旱抗性并導(dǎo)致玉米在水受限土地上的產(chǎn)率提高(Plant nuclear factor Y(NF-Y)B subunits conferdrought tolerance and lead to improved corn yields on water-limited acres),,,PNAS, vol. 104,No.42,16450-16455(2007)
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題關(guān)于環(huán)境脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的機(jī)制是復(fù)雜的,并且如上所述,已提出了用于產(chǎn)生干旱脅迫抗性植物的各種轉(zhuǎn)化方法。然而,就麻風(fēng)樹屬樹而言,與干旱脅迫相關(guān)的調(diào)節(jié)性蛋白、與抗性相關(guān)的功能蛋白等尚未得到闡明。本發(fā)明的目的是產(chǎn)生即使在缺水條件下仍然能夠確保高生長的干旱脅迫抗性麻風(fēng)樹屬樹,以及提供能夠?qū)⒁吧吐轱L(fēng)樹屬樹轉(zhuǎn)化成干旱脅迫抗性麻風(fēng)樹屬樹的基因等。問題的解決方案
為了實(shí)現(xiàn)上述目的,作為用于將麻風(fēng)樹屬樹轉(zhuǎn)化成干旱脅迫抗性麻風(fēng)樹屬樹的基因的檢查結(jié)果,本發(fā)明的發(fā)明人闡明了麻風(fēng)樹屬樹的基因組序列,并成功地分離和鑒定了編碼NF-YB的13個基因,并完成了本發(fā)明。具體而言,本發(fā)明如下所述。[I]分離的多核苷酸,其選自以下多核苷酸(a)由SEQ ID NO :1至11中任一個表示的多核苷酸;(b)編碼源自于麻風(fēng)樹屬樹的NF-YB多肽的多核苷酸,其包括由SEQ ID NO : 12或13表示的多核苷酸片段;以及(c)由與(a)和(b)之一的多核苷酸的核苷酸序列具有90%或更高同源性的核苷酸序列表不的多核苷酸,其中由所述多核苷酸編碼的多肽保持由(a)和(b)之一的多核苷酸編碼的NF-YB多肽的干旱脅迫抗性。[2]如[I]所述的分離的多核苷酸,其選自(a)和(b)的多核苷酸。 [3]分離的NF-YB多肽,其選自以下多肽(a)具有由SEQ ID NO : 14至24中任一個表示的氨基酸序列的NF-YB多肽;(b)源自于麻風(fēng)樹屬樹的NF-YB多肽,其包括具有由SEQ ID NO 25或26表示的氨基酸序列的多肽;以及(c)由與(a)和(b)之一的多肽的氨基酸序列具有90%或更高同源性的氨基酸序列表示的多肽,其中所述多肽保持(a)和(b)之一的NF-YB多肽的干旱脅迫抗性。[4]如[3]所述的分離的NF-YB多肽,其選自(a)和(b)的多肽。[5]編碼如[3]或[4]所述的多肽的多核苷酸。[6]麻風(fēng)樹屬植物的轉(zhuǎn)化載體,其中整合了如[I]、[2]或[5]所述的多核苷酸。[7]含有如[6]所述的載體的轉(zhuǎn)化體。[8]用如[6]所述的載體轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬植物,其中所述植株是與野生型相比能夠過表達(dá)NF-YB多肽的干旱脅迫抗性的轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹。[9]從如[8]所述的干旱脅迫抗性的轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹收獲的種子。[10]通過擠壓如[9]所述的種子并將其純化來生產(chǎn)麻風(fēng)樹屬樹油的方法。[11]通過如[10]所述的生產(chǎn)方法生產(chǎn)的麻風(fēng)樹屬樹油。發(fā)明的有益效果當(dāng)用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化麻風(fēng)樹屬樹時,轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹允許表達(dá)本發(fā)明的源自于麻風(fēng)樹屬樹的NF-YB多肽或與其相等的多肽。通過這些多肽,可以顯著提高NF-YB多肽參與其中的蛋白質(zhì)合成的生產(chǎn)率,以及顯著提高例如干旱脅迫抗性。
圖I是顯示擬南芥和麻風(fēng)樹屬樹的NF-YB的分子系統(tǒng)樹的圖。圖2是顯示NF-YB I至NF-YB5的瓊脂糖電泳結(jié)果的照片。圖3是pGWB 11質(zhì)粒的基因圖譜(參見Nakagawa等,“開發(fā)用于實(shí)現(xiàn)高效構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化用融合基因的 Gateway 二兀載體 pGWB (Development of Series of GatewayBinary Vectors, pGWBs, for Realizing Efficient Construction of Fusion Genes forPlant Transformation),,Journal of Bioscience and Bioengineering Vol. 104(2007),No. Ip. 38)
具體實(shí)施例方式[JcNF-YB 基因]本發(fā)明的分離的新麻風(fēng)樹屬樹基因是編碼麻風(fēng)樹屬樹的野生型轉(zhuǎn)錄因子NF-YB的多核苷酸,并且是單獨(dú)存在于麻風(fēng)樹屬樹基因組中的13個基因的家族。具體地,本發(fā)明包括(a)由SEQ ID NO :1至11表示的多核苷酸(依次命名為“JcNF-YB I基因”至“JcNF-YB11基因”);(b)編碼源自于麻風(fēng)樹屬樹的NF-YB多肽的多核苷酸,其包括由SEQID NO 12和13表示的多核苷酸片段(分別命名為“JcNF-YB12基因”和“JcNF-YB 13基因”);以及(c)由與(a)和(b)之一的多核苷酸的核苷酸序列具有90%或更高的同源性的核苷酸序列表不的多核苷酸,其中由所述多核苷酸編碼的多肽保持由(a)和(b)之一的多核苷酸編碼的NF-YB多肽的干旱脅迫抗性。(C)的多核苷酸的核苷酸序列與(a)和(b)之一的多核苷酸的核苷酸序列具有優(yōu)選95%或更高、更優(yōu)選98%或更高、并特別優(yōu)選99%或更高的同源性??梢酝ㄟ^本發(fā)明各基因的表達(dá)來獲得的多肽包括例如(a)麻風(fēng)樹屬樹野生型轉(zhuǎn)錄因子JcNF-YB I至JcNF-YB 11的NF-YB多肽(具有SEQID NO : 14至24的氨基酸序列);
(b)源自于麻風(fēng)樹屬樹的NF-YB多肽,其包括具有由SEQID NO 25和26表示的氨基酸序列的多肽;以及(c)由與(a)和(b)之一的多肽的氨基酸序列具有90%或更高的同源性的氨基酸序列表示的多肽,其中所述多肽保持(a)和(b)之一的NF-YB多肽的干旱脅迫抗性。
(c)的多肽與(a)和(b)之一的多肽的氨基酸序列具有優(yōu)選95%或更高、更優(yōu)選98%或更高、并特別優(yōu)選99%或更高的同源性。本發(fā)明基因的核苷酸序列還包括編碼上述(a)至(C)的多肽的多核苷酸。例如,只要編碼(a)和(b)的多肽,部分堿基可以被取代,并且在由SEQ ID NO: I表示的JcNF-YBIDNA中,通過用堿基T取代第6位的堿基G (SEQ ID NO :39),可以使翻譯效率高于野生型的翻譯效率。在下文中,用術(shù)語“ JcNF-YB基因”統(tǒng)稱本發(fā)明的多核苷酸。沒有具體限定本發(fā)明的JcNF-YB基因的制備方法。例如,可以通過使用麻風(fēng)樹屬樹基因組作為模板和為各JcNF-YB基因設(shè)計的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)來直接獲得靶基因的PCR產(chǎn)物,或者可以通過使用以下引物組的RT-PCR法從mRNA獲得靶多核苷酸的PCR產(chǎn)物,其中通過破碎麻風(fēng)樹屬植物的部分、優(yōu)選暴露于干旱脅迫的葉子來獲得所述mRNA,此外,可以根據(jù)普通技術(shù)取代、刪除或添加預(yù)定的堿基。使用根據(jù)Sudheer 等的方法(Indian Journal of Biotechnology, Vol. 8 (2009)p. 187-192)提取的麻風(fēng)樹屬樹基因組來直接獲得靶基因的PCR產(chǎn)物的方法是優(yōu)選的。Sudheer等的方法的特點(diǎn)是,對要使用的提取緩沖液直至用于DNA沉淀的溶液中的NaCl濃度進(jìn)行調(diào)整,并且在純化步驟中用Tris-飽和的苯酚、然后用氯仿和異戊醇的混合物進(jìn)行處理,并在沉淀步驟中使用80%乙醇??梢杂猛ǔ_M(jìn)行的方法來制備mRNA。例如,將冷凍的植物在研缽等中研磨后,可以通過乙二醛法、硫氰酸胍-氯化銫法、氯化鋰-脲法、蛋白酶K-脫氧核糖核酸酶法等從獲得的研磨后物質(zhì)中提取并制備粗RNA組分。此外,可以使用可商購的試劑盒??梢酝ㄟ^常規(guī)已知的方法例如Maxim-Gilbert化學(xué)修飾法或使用M13噬菌體的雙脫氧鏈終止法對所獲得的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列進(jìn)行測定并確認(rèn)。
[產(chǎn)生干旱脅迫抗性的轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹]本發(fā)明的干旱脅迫抗性的轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹是通過將具有JcNF-YB基因的表達(dá)盒基因?qū)氲揭吧吐轱L(fēng)樹屬樹中來產(chǎn)生的,所述JcNF-YB基因與用于表達(dá)或表達(dá)調(diào)控的啟動子可操作地連接。沒有具體限定本發(fā)明所意指的麻風(fēng)樹屬的物種,并且可以使用麻風(fēng)樹、佛肚樹(Jatropha potagurica)、紅珊瑚(Jatropha multifida)、錦珊瑚(Jatrophaberlandieri)、琴葉珊瑚(Jatropha integerrima)等。其中,從含油量大的角度來看,優(yōu)選使用麻風(fēng)樹??梢酝ㄟ^任何方法來實(shí)現(xiàn)基因?qū)?,所述方法包括直接將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中的方法,例如融合原生質(zhì)體的方法、電穿孔法、和基因鳥槍法;以及通過使用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或發(fā)根農(nóng)桿菌(R. rhizogenes)間接導(dǎo)入DNA的方法,并且使用農(nóng)桿菌(agrobacterium)的方法是優(yōu)選的。在下文中,描述了使用農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化方法。
農(nóng)桿菌是植物病原體并具有Ti質(zhì)粒,所述Ti質(zhì)粒具有被夾在LB (左邊界)和RB(右邊界)之間的、可以被切除并插入到宿主基因組中的區(qū)域(T-DNA (轉(zhuǎn)移DNA)區(qū))。當(dāng)用這樣的農(nóng)桿菌感染宿主植物時,即所述農(nóng)桿菌具有的質(zhì)粒在該T-DNA區(qū)中整合了待導(dǎo)入的基因、即JcNF-YB基因,T-DNA區(qū)被切除并與vir區(qū)編碼的一組蛋白質(zhì)形成復(fù)合物并進(jìn)入植物細(xì)胞,并實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步插入到宿主基因組中。作為使用農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化方法,二元載體法是優(yōu)選的。二元載體法是通過將外源靶基因整合到具有T-DNA區(qū)邊界(LB和RB)的質(zhì)粒的T-DNA區(qū)中,將這樣的質(zhì)粒以及Ti質(zhì)粒的T-DNA缺陷質(zhì)粒(例如PAL4404)導(dǎo)入農(nóng)桿菌中,并用該農(nóng)桿菌感染植物,來將靶基因插入到植物基因組中的方法。使用二元載體法產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹時使用的表達(dá)盒在T-DNA區(qū)中包含本發(fā)明的JcNF-YB基因、用于表達(dá)核苷酸的啟動子、標(biāo)記基因和報告基因。作為啟動子,可以列舉出35S花椰菜花葉病毒啟動子、胭脂堿合酶(NOS)啟動子、和其他胚乳特異性啟動子例如β菜豆素、蕓苔素和泛素。作為選擇標(biāo)記基因,所使用的基因賦予了對選擇劑例如抗生素或除草劑的抗性。其具體實(shí)例包括卡那霉素抗性基因、巴龍霉素B抗性基因、或針對除草劑例如草銨膦和草甘膦的抗性基因。還可以使用的是所表達(dá)的選擇標(biāo)記使得能夠目測識別轉(zhuǎn)化體的基因,或表達(dá)β葡萄糖醛酸酶或GUS的基因,其中,所述選擇標(biāo)記例如為發(fā)色或熒光蛋白如熒光素酶或綠色熒光蛋白(GFP),所述β葡萄糖醛酸酶或GUS的各種顯色底物是已知的。這種選擇標(biāo)記也可以被用作報告基因。如果必要的話,還可以包含增強(qiáng)子、終止子、標(biāo)簽等。增強(qiáng)子被用于提高靶基因的表達(dá)效率,并可以列舉出例如包含CaMV 35S啟動子的上游序列的增強(qiáng)子區(qū)。終止子可以是能夠使由啟動子轉(zhuǎn)錄的基因的轉(zhuǎn)錄終止的任何序列,并可以列舉出例如胭脂堿合酶(NOS)基因的終止子以及章魚堿合酶(NOS)和CaMV 35S RNA基因的終止子。作為用二元載體法轉(zhuǎn)化麻風(fēng)樹屬樹中使用的二元載體,可以使用那些將上述表達(dá)盒包含在T-DNA區(qū)中的二元載體,具體地是那些通過將上述表達(dá)盒整合到可商購的載體例如ρΒΙ系列、ρΡΖΡ系列、pSMA系列、和pGWB系列中而制備的二元載體。具體而言,Gateway(注冊商標(biāo))克隆系統(tǒng)適用的植物轉(zhuǎn)化用二元載體是優(yōu)選的,并且作為這樣的載體,可以列舉出pGWB系列載體。在這些pGWB系列載體中,使用花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子作為啟動子,潮霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因作為選擇標(biāo)記基因,葡萄糖醛酸酶(⑶S)、綠色熒光蛋白(GFP)、熒光素酶(LUC)、黃色熒光蛋白(YFP)、或青色熒光蛋白(CFP)作為報告子,以及6xHis、FLAG、3xHA、4xMyc、GST、或T7-表位作為標(biāo)簽,可操作地連接靶基因和報告子。此外,還有編碼報告子和標(biāo)簽的序列,所述標(biāo)簽使得能夠在N端和C端兩處進(jìn)行融合。Gateway (注冊商標(biāo))克隆系統(tǒng)通過使用Gateway (注冊商標(biāo))信號(att)促進(jìn)了表達(dá)載體的構(gòu)建。在該方法中,通過具有attPl和attP2序列的供體載體與在各端添加有attBl和attB2序列的靶基因之間的反應(yīng)(BP反應(yīng)),產(chǎn)生了在其中整合有靶基因的入門載體(各端具有attLl和attL2序列),然后通過該入門載體與在其中整合有表達(dá)所需要的啟動子的目的載體(添加有attRl和attR2序列)之間的重組反應(yīng)(LR反應(yīng)),產(chǎn)生了在其中插入有祀基因的載體(表達(dá)載體)。
因此,首先使克隆的JcNF-YB基因經(jīng)歷與供體載體的BP反應(yīng),以制備具有整合在供體載體中的克隆的JcPPAT cDNA的入門載體,然后通過入門載體與目的載體(pGWB)之間的LR反應(yīng),可以產(chǎn)生其中整合有靶DNA (JcNF-YB)的表達(dá)載體。關(guān)于使用Gateway 二元載體(pGWB)構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化用表達(dá)盒的詳細(xì)描述可參見Nakagawa等,“開發(fā)Gateway 二元載體pGWB系列用于實(shí)現(xiàn)高效構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化用融合基因(Development of Series of Gateway Binary Vectors,pGWBs,for Realizing EfficientConstruction of Fusion Genes for Plant Transformation),,Journal of Bioscienceand Bioengineering Vol. 104, No.1,34-41(2007))。如上所述產(chǎn)生的表達(dá)載體(植物轉(zhuǎn)化載體)可以在大腸桿菌(Escherichia coli)中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后的轉(zhuǎn)化載體可以通過電穿孔法等導(dǎo)入到農(nóng)桿菌中。以這種方式導(dǎo)入了表達(dá)載體的農(nóng)桿菌被用于轉(zhuǎn)化麻風(fēng)樹屬樹。通過具有植物轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌的感染將靶基因(JcNF-YB基因)導(dǎo)入到麻風(fēng)樹屬樹中,這可以通過使用已知的方法例如葉盤法來實(shí)現(xiàn)。具體地,制備感染用菌液,其中將農(nóng)桿菌懸浮在MS培養(yǎng)基中,并將菌液與宿主麻風(fēng)樹屬樹的部分(優(yōu)選地,子葉的剪切碎片,在下文中稱作“麻風(fēng)樹屬樹葉子碎片”)共培養(yǎng)約3天。在共培養(yǎng)前,將麻風(fēng)樹屬樹的葉子碎片浸泡在MS培養(yǎng)基中約2天,并優(yōu)選進(jìn)行超聲。用這種方式可以提高導(dǎo)入效率。還優(yōu)選的是向其中已添加了沙的農(nóng)桿菌懸浮液施加振動的Sandvortex法,因?yàn)樵摲椒ㄌ岣吡宿r(nóng)桿菌的可感染性。作為共培養(yǎng)的培養(yǎng)基,使用摻入了植物激素例如3-吲哚丁酸(IBA)或6-苯甲氨基嘌呤(BA)的MS培養(yǎng)基等。在共培養(yǎng)后,洗滌麻風(fēng)樹屬樹葉子碎片,并將其轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基(含有與轉(zhuǎn)化載體的表達(dá)盒中使用的選擇標(biāo)記基因?qū)?yīng)的抗生素)中,并進(jìn)行孵育,然后將葉子碎片中形成的愈合組織切下,并轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基中,并進(jìn)行進(jìn)一步篩選轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹(重組細(xì)胞)。作為選擇培養(yǎng)基,優(yōu)選使用的是通過向含有作為植物激素的IBA、BA、噻苯隆(TDZ)等的預(yù)培養(yǎng)用培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基等)添加選擇用物質(zhì)、即抗生素(卡那霉素、潮霉素)而制備的選擇培養(yǎng)基。
然后,將所選擇的愈合組織轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基例如RI培養(yǎng)基或MS培養(yǎng)基中,并讓其生根和再分化成植株。通過適當(dāng)?shù)卦O(shè)定光、溫度以及培養(yǎng)基中各種成分包括植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)例如植物生長素和細(xì)胞分裂素以及碳源的種類和數(shù)量等,可以實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)再分化。[轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹]與野生型相比,本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹能夠從參與干旱脅迫抗性基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子JcNF-YB的編碼基因過表達(dá)JcNF-YB基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。因此,可以激活干旱脅迫抗性基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。因此,與野生型相比,即使在干旱條件下仍然能實(shí)現(xiàn)更高的植物生長。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物不僅涵蓋了經(jīng)歷轉(zhuǎn)化處理的“Tl代”,還涵蓋了后代植物,包括從該植物的種子獲得的子代“T2代”,以及通過“T2代”植物的花自體受精獲得的、被藥物選 擇或通過Southern法等的分析證明是轉(zhuǎn)化體的下一代(T3代)。[麻風(fēng)樹屬樹油的生產(chǎn)]·根據(jù)常規(guī)方法可以從本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹收獲的種子生產(chǎn)麻風(fēng)樹屬樹油。例如,通過擠壓種子獲得原料油并通過濾器過濾原料油,可以生產(chǎn)可用作生物柴油的麻風(fēng)樹屬樹油。當(dāng)打算將麻風(fēng)樹屬樹油進(jìn)一步純化時,例如,可以通過蒸餾進(jìn)行純化,并可以用日本專利特開No. 2010-209177中描述的方法去除佛波酯。實(shí)施例將通過實(shí)施例的方式對用于實(shí)踐本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行描述。下面所給出的實(shí)施例不限制本發(fā)明的范圍。[麻風(fēng)樹屬樹中JcNF-YB編碼DNA的分離和轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建](I)麻風(fēng)樹屬樹基因組DNA的制備使用從鳥取大學(xué)(Tottori University)農(nóng)學(xué)系分配的泰國系麻風(fēng)樹屬樹(麻風(fēng)樹)。根據(jù)Sudheer等的方法(Indian Journal of Biotechnology, Vol. 8 (2009)p 187-192)從該麻風(fēng)樹屬樹的成熟葉子制備基因組DNA。用蒸餾水洗滌麻風(fēng)樹屬樹的葉子,用棉紙吸干水分,并在研缽中將Ig研磨成粉末。將得到的粉末在65° C下與IOmL提取緩沖液(2%CTAB、100mM Tris-鹽酸、3. 5M NaCl,20mM EDTA, 1%β -巰基乙醇)充分混合。將混合物在65° C水浴中孵育90分鐘,然后冷卻5分鐘。加入等量的氯仿和異戊醇(24:1)的混合物,并緩慢混合以得到均勻的乳液。將該乳液在10,OOOx g下離心15分鐘,然后分離水相。向分離的水相再次加入等量的氯仿和異戊醇(24:1)的混合物,并緩慢混合以得到均勻的乳液。在將該乳液在4° C下以10,OOOxg離心15分鐘后,收集水相。向收集的水相加入等量的異丙醇,在-20° C冷卻30分鐘,然后在4° C下以10,OOOx g離心30分鐘,以得到DNA沉淀。將該DNA沉淀用70%乙醇洗滌,然后再懸浮于TE緩沖液中。將獲得的DNA沉淀溶解在含有20mg/mL RNase的TE緩沖液(IOmM Tris-HClUmM EDTA, pH 8.0)中,以得到基因組 DNA 樣品。通過與EcoRI、HindIII和SauIII —起培養(yǎng)來將所獲得的提取的基因組DNA切割成片段,并通過測序儀進(jìn)行測序。(2)編碼JcNF-YB的基因的克隆和擴(kuò)增基于從(I)獲得的麻風(fēng)樹屬樹基因組信息(重疊群圖譜(Contig Map)),通過TBLASTN檢索與擬南芥NF-YB顯示出同源性的基因。關(guān)于擬南芥的NF-YB基因信息,參考 NCBI 的基因注冊信息(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez db=gene&cmd=Retrieve&dop t=full_report&list_uids=818472&itooI=HomoIoGeneMainReport)。作為檢索結(jié)果,被注釋為編碼JcNF-YB的那些基因如下所示。Contigl977. I. IContig21632. I. IContig30054. I. IContig31310. I. 2Contig31788. I. 2 Contig3182. I. IContig8131. I. IF4IDXKH14IH0ZQ. IHYB_Contigl7630. I. 2HYB_Contig31673. I. IHYB_Contig46618. I. IHYB_Contig46864. I. IHYB_Contig61720. I. I. IJatropha454_3Run_c74008. I在這些序列中,由于HYB_Contig46618. I. I 和 HYB_Contig61720. I. I. I 的DNA核苷酸序列除了末端部分以外被證明彼此完全一致,因此,我們決定使用HYB_Contig46618. I. I用于預(yù)測JcNF-YB基因。因此,假定麻風(fēng)樹屬樹中存在13種NF-YB基因(這些基因被命名為NF-YB I至NF-YB13)。作為同源性檢索的結(jié)果,在上述各基因組片段中包含的麻風(fēng)樹屬樹DNA與擬南芥NF-YB基因之間的關(guān)系如表I所示。JcNF-YB基因的核苷酸序列如序列表中的SEQID NO :1至13所示。通過翻譯這些多核苷酸而獲得的多肽的氨基酸序列依次如SEQ ID N0:14至26所示。此外,對JcNF-YBl至JcNF-YB 13和擬南芥的NF-YB家族(AtNF-YBl至AtNF_YB13)進(jìn)行CLASTALW分析,并制備分子系統(tǒng)樹。制備的結(jié)果如圖I所示。表I
權(quán)利要求
1.分離的多核苷酸,其選自以下多核苷酸 (a)由SEQID NO :1至11中任一個表示的多核苷酸; (b)編碼源自于麻風(fēng)樹屬樹的NF-YB多肽的多核苷酸,其包括由SEQID NO : 12或13表示的多核苷酸片段;以及 (C)由與(a)和(b)之一的多核苷酸的核苷酸序列具有90%或更高同源性的核苷酸序列表不的多核苷酸,其中由所述多核苷酸編碼的多肽保持由(a)和(b)之一的多核苷酸編碼的NF-YB多肽的干旱脅迫抗性。
2.權(quán)利要求I的分離的多核苷酸,其選自(a)和(b)的多核苷酸。
3.分離的NF-YB多肽,其選自以下多肽 (a)具有由SEQID NO :14至24中任一個表示的氨基酸序列的NF-YB多肽; (b)源自于麻風(fēng)樹屬樹的NF-YB多肽,其包括具有由SEQID NO 25或26表示的氨基酸序列的多肽;以及 (c)由與(a)和(b)之一的多肽的氨基酸序列具有90%或更高同源性的氨基酸序列表示的多肽,其中所述多肽保持(a)和(b)之一的NF-YB多肽的干旱脅迫抗性。
4.權(quán)利要求3的分離的NF-YB多肽,其選自(a)和(b)的多肽。
5.編碼權(quán)利要求3或4的多肽的多核苷酸。
6.麻風(fēng)樹屬植物的轉(zhuǎn)化載體,其中整合了權(quán)利要求1、2或5的多核苷酸。
7.含有權(quán)利要求6的載體的轉(zhuǎn)化體。
8.用權(quán)利要求6的載體轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬植物,其中所述植物是與野生型相比能夠過表達(dá)NF-YB多肽的干旱脅迫抗性的轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹。
9.從權(quán)利要求8的干旱脅迫抗性的轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹收獲的種子。
10.通過擠壓權(quán)利要求9的種子并對其純化來生產(chǎn)麻風(fēng)樹屬樹油的方法。
11.通過權(quán)利要求10的生產(chǎn)方法生產(chǎn)的麻風(fēng)樹屬樹油。
全文摘要
通過分析麻風(fēng)樹屬樹的基因組,發(fā)現(xiàn)了編碼NF-YB的基因SEQ IDNO1-11、編碼NF-YB的基因的片段SEQ ID NO12和13、以及與其相關(guān)的基因。通過用這些編碼NF-YB的基因等轉(zhuǎn)化麻風(fēng)樹屬樹,可以過表達(dá)NF-YB多肽等,并可以顯著提高由NF-YB多肽參與的蛋白質(zhì)合成的生產(chǎn)率以及顯著提高例如干旱脅迫抗性。因此,可以產(chǎn)生即使在缺水條件下仍然能夠確保高生長的干旱脅迫抗性麻風(fēng)樹屬樹。
文檔編號C07K14/415GK102834517SQ20118001820
公開日2012年12月19日 申請日期2011年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日
發(fā)明者松永幸大, 小日向務(wù), 福井希一, 田畑哲之 申請人:國立大學(xué)法人大阪大學(xué)