專利名稱：用于治療和/或防止動脈粥樣硬化的包含抗原apob-100蛋白片段和蛋白載體的融合蛋白 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化的融合蛋白及相關(guān)的組合物、方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
目前動脈粥樣硬化被看做是脂質(zhì)-相關(guān)的和免疫-介導(dǎo)的動脈壁的慢性炎癥性疾病。已鑒定出參與在動脈粥樣硬化形成中的許多免疫組件并且臨床前期研究已產(chǎn)生了有希望的結(jié)果，所述結(jié)果表明靶向這些組件的免疫調(diào)控療法可減少動脈粥樣硬化。

發(fā)明內(nèi)容
本文提供了用于在個體中誘導(dǎo)免疫調(diào)控應(yīng)答的方法和系統(tǒng)。在若干個實(shí)施方式中，由本發(fā)明的方法和系 統(tǒng)誘導(dǎo)的免疫調(diào)控應(yīng)答與關(guān)于個體的動脈粥樣硬化或其關(guān)聯(lián)病況的療治和/或預(yù)防作用關(guān)聯(lián)。根據(jù)第^-個方面,描述了融合蛋白。融合蛋白包含apoB-100蛋白的抗原片段或其衍生物和蛋白載體,所述抗原片段和載體以片段:載體為1:1的摩爾比包含在能誘導(dǎo)抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的融合蛋白中，所述抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對apoB-100的抗原片段是特異性的。根據(jù)第二個方面,描述了治療和丨或預(yù)防個體中的動脈粥樣硬化的方法。方法包括給個體施用有效量的本文描述的融合蛋白，所述有效量在個體中引起抗原特異性Treg免疫調(diào)控應(yīng)答，該抗原特異性Treg免疫調(diào)控應(yīng)答對apoB-100的抗原片段或其衍生物是特異性的。根據(jù)第三個方面,描述了組合物。組合物包含本文描述的融合蛋白以及佐劑和/或賦形劑。在若干種實(shí)施方式中,佐劑和/或賦形劑是藥物上可接受的且組合物是藥物組合物。根據(jù)第四個方面，描述了生產(chǎn)融合蛋白的方法。方法包括使apoB-100的片段或其衍生物與合適的蛋白載體軛合以提供能誘導(dǎo)抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的融合蛋白，抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對apoB-100的片段或其衍生物是特異性的。根據(jù)第五個方面,描述了誘導(dǎo)抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的方法。方法包括在允許誘導(dǎo)T調(diào)節(jié)性應(yīng)答的條件下使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與本文描述的融合蛋白接觸一段時間,其中所述接觸導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抗原-特異性誘導(dǎo)，所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對包含在融合蛋白中的apoB-100的片段或其衍生物是特異性的。本文描述的方法和系統(tǒng)可用在有關(guān)應(yīng)用中，在所述應(yīng)用中，期望個體中的動脈粥樣硬化的斑塊減少、斑塊生長衰減和/或動脈粥樣硬化的療治或預(yù)防作用。本發(fā)明的一個或多個實(shí)施方式的細(xì)節(jié)在下文的附圖和說明書中闡明。其他特性、目標(biāo)和優(yōu)勢從說明書和附圖和權(quán)利要求中顯而易見。附圖簡述并入本說明書并構(gòu)成其一部分的附圖闡釋了本發(fā)明的--個或多個實(shí)施方式,并與詳細(xì)的說明書和實(shí)施例部分一起用來解釋本發(fā)明的原理和實(shí)施。

圖1顯示了關(guān)于每周兩次鼻內(nèi)p210-CTB施用12周減少雌性apoev小鼠的主動脈根部中的動脈粥樣硬化損傷大小的數(shù)據(jù)。(A)分別示出了來自三個組的數(shù)據(jù):黑環(huán)表示來自p210-CTB組的動物,灰色環(huán)表示來自O(shè)VA-CTB組的動物，白環(huán)表示來自對照組的動物。*表示p〈0.05。(B-D)代表性的顯微照片顯示了來自每一組的油紅0染色的主動脈根部切片(50X放大率)。(E)治療12周后，用CTB融合蛋白的鼻免疫增加了來自apoe 7小鼠的胸主動脈的FoxP3和IL-1OmRNA水平。針對所有三個組的每一感興趣的基因，示出了基于HPRT表達(dá)的mRNA轉(zhuǎn)錄物比率。*表示p〈0.05圖2顯示了誘導(dǎo)apoe+小鼠中的全身體液免疫應(yīng)答的鼻免疫的數(shù)據(jù)。(A)小鼠血漿中的IgG-抗-p2 10的滴度；在插圖中顯示了滴定曲線。(B)來自相同小鼠的血漿中的p210-特異性IgM的滴度。*表示p〈0.05。圖3顯示了關(guān)于鼻免疫改變肺粘膜層中的T細(xì)胞亞組組成的數(shù)據(jù)。對于三個組中每一組的細(xì)胞內(nèi)亞組標(biāo)記物的流式細(xì)胞分析，產(chǎn)生細(xì)胞因子的CD4+T細(xì)胞占總CD4+T細(xì)胞的百分比。(A)干擾素 I ; (B) IL-17 ； (C) IL-4 ； (D)FoxP3。* 表示 p〈0.05。圖4顯示了關(guān)于鼻p210-CTB免疫在脾臟中誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-1.0的CD4+T細(xì)胞和apoB-100-特異性的Treg的數(shù)據(jù)。A)針對細(xì)胞內(nèi)IL-10染色的培養(yǎng)的脾臟細(xì)胞的流式細(xì)胞分析。(B)代表性的流式細(xì)胞圖。(C)從已用人apoBlOO免疫的apoe+小鼠中產(chǎn)生2.5X105細(xì)胞/孔的脾臟效應(yīng)細(xì)胞。刺激指數(shù)表示相對于未被刺激的細(xì)胞，當(dāng)用人apoBlOO (20 u g/mL)刺激時,3H胸腺啼淀攝取的比率。每一組的最左邊的條中表示單獨(dú)的效應(yīng)細(xì)胞的增殖。以相對于效應(yīng)細(xì)胞的不同比率表示來自鼻免疫的動物的純化的CD4+T細(xì)胞的加入。*p<0.05。圖5顯示了關(guān)于鼻P210-CTB免疫對動脈粥樣硬化損傷大小的保護(hù)性作用不取決于T細(xì)胞中的TGF-0信號的數(shù)據(jù)。A)用p210-CTB(黑點(diǎn))或OVA-CTB(灰點(diǎn))免疫的apoe+x CD4dnTGFf3 RIItg小鼠的主動脈根部的損傷大小。免疫對IgG類⑶和IgM(C)的P210-特異性抗體滴度的作用。*p〈0.05。圖6顯示了關(guān)于免疫的小鼠中的損傷大小的數(shù)據(jù)。用P210-CTB(黑條)、OVA-CTB(灰色條)鼻處理的和未處理對照(白條)的apoe+小鼠的主動脈根部中的損傷面積分?jǐn)?shù)。顯示了平均值+SD值。*表示p<0.05。圖7顯示了關(guān)于通過FPLC分析的血漿脂蛋白譜的數(shù)據(jù)。粗線表示免疫組:黑色=p210-CTB’灰色=OVA-CTB,白色顯示對照組。細(xì)線表示SEM0 CR/VLDL=乳糜微粒/非常低密度的脂蛋白；LDL=低密度脂蛋白；HDL=高密度脂蛋白。圖8顯示了關(guān)于在免疫的小鼠的損傷中的T細(xì)胞的數(shù)據(jù),特別是apoe+小鼠的主動脈根部的動脈粥樣硬化損傷的代表性免疫組織化學(xué)染色的數(shù)據(jù)。箭頭表示FoxP3+細(xì)胞；它們是直接鄰近的切片中的CD4+。圖9顯示了關(guān)于對apoB-100肽的血清IgCil抗體滴度的數(shù)據(jù)。來自用p210_CTB (黑條)'OVA-CTB (灰色條)處理的apoe+小鼠或?qū)φ?白條)apoe+小鼠的血清的ELISA分析。*表示p〈0.05。圖10顯示了關(guān)于對apoB-100肽的血清IgG2a抗體滴度的數(shù)據(jù)。用p210-CTB (黑條)、OVA-CTB (灰色條)處理的apoe+小鼠或?qū)φ?白條)apoe+小鼠。*表示p〈0.05。圖11顯示了關(guān)于免疫的小鼠的血清中的總IgG的數(shù)據(jù)。用p210-CTB(黑條)、OVA-CTB(灰色條)處 理的apoe'A小鼠或?qū)φ?白條)apoe 7小鼠。圖12顯示了關(guān)于免疫的小鼠的血清中的總IgM的數(shù)據(jù)。用p210-CTB(黑條)、OVA-CTB(灰色條)處理的apoe+小鼠或?qū)φ?白條)apoe_7'_小鼠。圖13顯示了關(guān)于免疫后的脾臟中的T細(xì)胞亞組的數(shù)據(jù)。顯示了作為三個組中的任一組的每個CD4+T細(xì)胞的產(chǎn)生細(xì)胞因子細(xì)胞的百分比作為細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的流式細(xì)胞分析。(A)干擾素-Y ；⑶ IL-17 ； (C) IL-4 ; (D) FoxP3。圖14顯示了關(guān)于對細(xì)胞分離的Treg抑制作用的消除的數(shù)據(jù)。用條(從黑色=p210-CTB組動物、灰色=OVA-CTB組動物和白色=對照組動物中產(chǎn)生)表示來自鼻免疫的小鼠的效應(yīng)細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的共培養(yǎng)。當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞在Transwell板中彼此分開培養(yǎng)時，消除了 CD4+T細(xì)胞-介導(dǎo)的增殖抑制作用(接觸抑制檢驗(yàn))。圖15顯示了關(guān)于來自共培養(yǎng)檢驗(yàn)的上清液中的TGF-0和IL-10的細(xì)胞因子水平的數(shù)據(jù)。條紋條表示單獨(dú)的效應(yīng)細(xì)胞。通過單色條表示來自鼻免疫的小鼠的效應(yīng)細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的共培養(yǎng)(從黑色=p210-CTB組動物、灰色=OVA-CTB組動物和白色=對照組動物中產(chǎn)生)。圖16顯示了關(guān)于具有在T細(xì)胞上的缺陷型TGFP受體免疫的小鼠中損傷大小的數(shù)據(jù)。用p210-CTB(黑條)或OVA-CTB(灰色條)鼻處理的apoe+x CD4dnTGFP RIItg小鼠的主動脈根部中的損傷面積分?jǐn)?shù)。顯示了平均值土SD值。*表示p〈0.05。圖17顯示了關(guān)于具有在T細(xì)胞上的缺陷型TGF P受體的/J、鼠的主動脈中的mRNA水平的數(shù)據(jù)。實(shí)時反轉(zhuǎn)錄PCR標(biāo)準(zhǔn)化為apoe+xCDAdnTGF PRIItg小鼠的胸主動脈中的HPRT。值得注意的是，功能性FoXp3+Treg細(xì)胞的發(fā)展取決于TGFP。因此，關(guān)于apoe 7 xCD4dnTGFf3 RIItg小鼠中的FoxP3-表達(dá)的細(xì)胞的關(guān)聯(lián)性的詳細(xì)信息需要進(jìn)一步研究。圖18顯示了關(guān)于用LDL或OVA免疫的小鼠中的針對小鼠LDL的IgG抗體的數(shù)據(jù)。用小鼠LDL(mLDL)或卵白蛋白(OVA)免疫C57BL/6.J小鼠。用在包覆有小鼠LDL的孔中的血清稀釋液，隨后用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗-小鼠-1gG進(jìn)行ELISA。SC，皮下施用；IN,鼻內(nèi)施用。詳細(xì)描述本文提供了在若干 種實(shí)施方式中適用于針對動脈粥樣硬化的免疫保護(hù)的融合蛋白、組合物、方法和系統(tǒng)。
本文中使用的術(shù)語“融合蛋白”表示通過源自各自蛋白的兩種或多種多肽的附著產(chǎn)生的蛋白。特別地，可通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生融合蛋白并且融合蛋白典型地用在生物研究和療法中。還可通過化學(xué)共價軛合產(chǎn)生融合蛋白，使用或不用融合蛋白的多肽部分之間的鍵。本文中使用的術(shù)語“附著”或“附著的”,是指通過鍵合(bond)、連接(link)、力(force)或系結(jié)(tie)的連接或聯(lián)合(uniting)以便將兩個或多個組分保持在一起,其包括直接或間接附著，例如第一多肽與第二多肽或材料直接鍵合的情況,也包括其中在第一多肽和第二多肽或材料之間放置一種或多種中間化合物特別是多肽的實(shí)施方式。本文中使用的術(shù)語“蛋白”或“多肽”表示包含兩種或多種氨基酸單體和!或其類似物的有機(jī)聚合物。術(shù)語“多肽”包括任何長度的氨基酸聚合物(包括全長的蛋白和肽)及其類似物和片段。三個或多個氨基酸的多肽還被稱為寡肽。本文中使用的術(shù)語“氨基酸”、“氨基酸單體”或“氨基酸殘基”是指任何二十個天然存在的氨基酸，包括具有非天然側(cè)鏈的合成氨基酸,也包括D光學(xué)異構(gòu)體和L光學(xué)異構(gòu)體。術(shù)語“氨基酸類似物”是指下述氨基酸，其中已用不同的原子、同位素或用不同的官能團(tuán)替代一個或多個個別原子，但在其他方面與其天然氨基酸類似物相同的氨基酸。特別地，在若干實(shí)施方式中，描述了適用于在個體中引起抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞應(yīng)答的融合蛋白、組合物、方法和系統(tǒng)。本文中使用的術(shù)語“抗原”是指當(dāng)其被弓I入身體時能刺激免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)?？乖庠葱钥乖?通過例如吸入、攝入或注入已從外部進(jìn)入身體的抗原)和內(nèi)源性抗原或自身抗原(已在身體內(nèi)產(chǎn)生的抗原)。特別地自身抗原”是這樣的抗原,所述抗原盡管是正常組織成分,但其是體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的靶標(biāo)。示例性自身抗原包含與通過低密度脂蛋白和其成分蛋白Ap0BlOO提供的動脈粥樣硬化形成和/或動脈粥樣硬化關(guān)聯(lián)的自身抗原。本文中使用的術(shù)語“調(diào)節(jié)性T細(xì)胞”或“Treg”表示抑制其他細(xì)胞免疫應(yīng)答的免疫系統(tǒng)組件，并且其包 括表達(dá)CD8跨膜糖蛋白的T細(xì)胞(CD8+T細(xì)胞)；表達(dá)CD4、CD25和Foxp3的T細(xì)胞(CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞);和由技術(shù)人員可鑒定的具有抑制功能的其他類型T細(xì)胞。Treg包括天然存在的T細(xì)胞和體外產(chǎn)生的T細(xì)胞二者。使用的術(shù)語“抗原-特異性”表示對某些抗原的免疫應(yīng)答,特別是免疫耐受性,其特征在于對另一抗原基本上較少或沒有免疫應(yīng)答(特別是免疫耐受性)。因此,在適當(dāng)條件
F對一種或多種自身抗原特異性的抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能將對一種或多種自身抗原的特異性免疫應(yīng)答減到最小，同時對其他抗原或自身抗原的免疫應(yīng)答基本上較少或沒有最小化作用。本文描述了包含與動脈粥樣硬化形成和/或動脈粥樣硬化關(guān)聯(lián)的自身抗原的融合蛋白和相關(guān)方法及系統(tǒng)，所述融合蛋白和相關(guān)方法及系統(tǒng)能引起自身抗原特異性Treg應(yīng)答并在若干種實(shí)施方式中可用于治療和/或預(yù)防個體中的動脈粥樣硬化或其關(guān)聯(lián)的病況。本文中使用的術(shù)語“動脈粥樣硬化”表示炎癥性病況,特別是其中由于脂肪物質(zhì)比如膽固醇堆積而導(dǎo)致動脈壁變厚的病況。在一些情況下，用抑制素療法治療動脈粥樣硬化(I)。在若干情況下，動脈粥樣硬化是影響動脈血管的綜合征、動脈壁中的慢性炎癥性應(yīng)答，動脈粥樣硬化很大程度上歸因于巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞的累積并由低密度脂蛋白(載有膽固醇和甘油三酯的血漿蛋白)促成，而沒有通過功能性高密度脂蛋白(HDL)充分去除來自巨噬細(xì)胞的脂肪和膽固醇(見apoA-1 Milano)。在一些情況下,動脈內(nèi)D旲中的脂J頁存留和修飾引起有自身免疫應(yīng)答的慢性炎癥性過程并發(fā)展動脈粥樣硬化損傷(2)。已描述了作為對該過程的貢獻(xiàn)因素的獲得性免疫和天然免疫二者的機(jī)制(3-6)。雖然天然免疫的模式識別受體被認(rèn)為是解釋膽固醇攝取的原因并有助于巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的活化，但內(nèi)膜中的識別低密度脂蛋白(LDL)顆粒的抗原-特異性T細(xì)胞提供加速動脈粥樣硬化形成的強(qiáng)的促炎癥刺激物。動脈粥樣硬化通常是指動脈的硬化或堵塞(furring)。其被認(rèn)為是由動脈內(nèi)的多個斑塊的形成引起的。典型地,對低密度脂蛋白(LDL)的自身免疫應(yīng)答促進(jìn)動脈粥樣硬化進(jìn)展(progression)，而用LDL的免疫可誘導(dǎo)防止動脈粥樣硬化的或致動脈粥樣硬化的應(yīng)答。本文中使用的術(shù)語“治療”(動詞或名詞形式)表示下述任何行為，所述行為是醫(yī)藥上或手術(shù)上對病況的醫(yī)療護(hù)理的--部分或醫(yī)藥上或手術(shù)上對病況進(jìn)行處理。本文中使用的術(shù)語“預(yù)防”(動詞形式或名詞形式)表示下述任何行為，所述行為減少個體中的來自病況的死亡率或發(fā)病率負(fù)擔(dān)。這在第一、第二和第三預(yù)防水平下發(fā)生，其中:a)第一預(yù)防避免疾病發(fā)展山)第二預(yù)防行為的目標(biāo)在于早期疾病治療，從而增加干預(yù)機(jī)會，以預(yù)防疾病進(jìn)展和癥狀出現(xiàn)；和c)第三預(yù)防,通過恢復(fù)功能并減少疾病-相關(guān)的并發(fā)癥來減少已確定的疾病的負(fù)面影響。本文中使用的術(shù)語“病況”(condition)，如其通常所表示的,表示與正常的個體身體的身體狀況(總體上或其一個或多個部分)不一致的個體身體的身體狀況(總體上或其一個或多個部分),其中所述正常的個體身體的身體狀況(總體上或其一個或多個部分)是與完整的身體、精神和可能地社會福利狀態(tài)關(guān)聯(lián)的。本文描述的病況包括但不限于病癥(disorder)和疾病(disease)，其中術(shù)語“病癥”表示與身體或其任何部分的功能異常關(guān)聯(lián)的活的個體的病況,術(shù)語“疾病”表示下述活的個體的病況，其損害身體或其任何部分的正常功能并典型地通過有區(qū)別的體征和癥狀被證明。示例性的病況包括但不限于損傷、失能、病癥(包括精神和身體病癥)、綜合征、感染、個體的反常行為和個體身體或其部分的結(jié)構(gòu)和功能的非典型性變化。本文中使用的關(guān)于兩個項(xiàng)目的措辭“與…關(guān)聯(lián)的”表示兩個項(xiàng)目之間的關(guān)系使得第一個項(xiàng)目的發(fā)生伴隨著第二個項(xiàng)目的發(fā)生,其包括但不限于原因-結(jié)果關(guān)系和體征/癥狀_疾病關(guān)系。本文中使用的術(shù)語“個體”表示單個生物體，比如高等動物和特別地脊椎動物(比如哺乳動物)，更特別地人類。在若干種實(shí)施方式中，通過片段:載體為1:1比例包含直接附著或通過連接器(linker)附著的apoB-100的抗原片段和蛋白載體的融合蛋白，提供抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)。本文中使用的術(shù)語“片段”表示任何長度的多肽的一部分。技術(shù)人員知道該術(shù)語包括具有對應(yīng)于討論的多肽部分的序列的任何來源的肽。Ap0BlOO的抗原片段因此是呈現(xiàn)抗原性質(zhì)的apoB-100的一部分。本文描述的apoB-100的抗原片段還包括其可能的衍生物。本文中使用的關(guān)于第一多肽( 例如，apoB-100抗原片段)的術(shù)語“衍生物”，表示結(jié)構(gòu)上與第一多肽相關(guān)并通過下述修飾源自第一多肽的第二多肽,所述修飾引入不在第一多肽中存在的特性同時保留第一多肽的功能性質(zhì)。因此，通過對與不在原始多肽或其部分中存在的其他功能可能或不可能關(guān)聯(lián)的氨基酸序列的修飾，apoB-100的抗原片段的衍生多肽通常與原始多肽或其部分不同。但是apoB-100的抗原片段的衍生多肽保留了與apoB-100或其抗原片段有關(guān)的那些抗原性質(zhì)相當(dāng)?shù)目乖再|(zhì)?；谟懻摰钠蔚奶禺愋钥乖再|(zhì)，用在閱讀本發(fā)明公開后技術(shù)人員可鑒定的方法，可檢驗(yàn)保留的一種或多種抗原性質(zhì)。示例性方法包括用候選衍生物使動物(例如小鼠)免疫，測定動物中的對衍生物特異性的抗體產(chǎn)生(例如通過ELISA,比如免疫測定ELISA)并將針對候選衍生物的測定的抗體產(chǎn)生與片段的對應(yīng)抗體產(chǎn)生比較。測定其他抗原性質(zhì)的其他方法可由技術(shù)人員閱讀本發(fā)明后確定。本文中使用的術(shù)語“蛋白載體”表示運(yùn)輸特異性物質(zhì)或物質(zhì)組通過細(xì)胞內(nèi)隔室(compartment)的蛋白或跨越細(xì)胞I旲在細(xì)胞外液體中(例如在血液中)運(yùn)輸特異性物旗或物質(zhì)組的蛋曰。不例性載體蛋曰包括霍亂毒素B亞基、親和素、BTG蛋曰、牛G球蛋曰、牛免疫球蛋白G、牛甲狀腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、伴清蛋白、Edestein、來自銅綠假單胞菌的胞外蛋白A、HC(來自巨蟹(crab Paralithodes camtschatica)的血藍(lán)蛋白)、羅曼蝸牛血藍(lán)蛋白(HPII)、人血清白蛋白(IISA)、KTI (來自大豆的Kunits型胰蛋白酶抑制劑)、匙孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KLH)、LPH( 來自美洲鱟的血藍(lán)蛋白)、卵白蛋白、Pam3Cys-Th、聚賴氨酸、豬甲狀腺球蛋白(PT G)、純化的蛋白衍生物(PPD)、兔血清白蛋白(RSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(S TI)、向日葵球蛋白(SFG)和由技術(shù)人員可鑒定的其他分子。其他載體包括具有免疫原性活性的分子，所述分子包括細(xì)胞因子(比如IL-10、IL12、IL-4IL-16)和轉(zhuǎn)化生長因子^ (TGF運(yùn))。在一些實(shí)施方式中,在片段的C-端或N-端進(jìn)行載體附著。在^-種實(shí)施方式中,可通過重組DNA技術(shù)和相關(guān)的方法，比如克隆、嵌合構(gòu)建體、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和由技術(shù)人員可鑒定的其他程序，提供作為單個多肽的融合蛋白。在一些實(shí)施方式中，使用也由技術(shù)人員可鑒定的方法,通過將片段與載體的化學(xué)連接進(jìn)行附著。在一些實(shí)施方式中，apoB-100的抗原片段包含人apoB-100 (p210)的氨基酸3136-3155和/或在實(shí)施例部分中闡釋的從肽中選擇的額外片段。特別在一些實(shí)施方式中，融合產(chǎn)物的片段部分可包含肽P2、PlU P25、P32、P45、P74、P102、P129、P143、P148、P154、P162、P210、P219、P240 中的一種或多種。更特別地，在^ -些實(shí)施方式中，融合產(chǎn)物的片段部分可包含肽P2、P45、P102和P210中的一種或多種。在一種實(shí)施方式中，其中融合蛋白的片段部分包含多于一種肽,至少在這些實(shí)施方式的一些中，片段部分可在下述構(gòu)建體中包含高至10種肽,期望所述構(gòu)建體與那些癌癥疫苗或感染性疫苗(比如在其全文通過引用并入本文的(35)中描述的那些)具有類似作用。當(dāng)閱讀本發(fā)明后技術(shù)人員將能針對期望的免疫原性、預(yù)防和/或療治作用鑒定合適的肽組
—人口 o在一些實(shí)施方式中，載體蛋白可包含霍亂毒素B亞基的至少 t 單體,所述霍亂毒素B亞基是通過能結(jié)合(例如在腸上皮細(xì)胞的表面上的)G:M-1受體的重組五聚體B低聚物形成的。特別地,在一些實(shí)施方式中，可通過重組五聚體B低聚物分子的具有近似
11.6kDa分子量的五個相同單體中的至少一個形成載體蛋白。在這些實(shí)施方式的一些中，單體緊緊連接進(jìn)胰蛋白酶抗性五聚體環(huán)狀結(jié)構(gòu)中，具有近似58kDa分子量。
在^-些實(shí)施方式中，使用產(chǎn)生融合蛋白(具有免疫原性肽的單個或多個拷貝)的生物遺傳工程改造和當(dāng)閱讀本發(fā)明后由技術(shù)人員可鑒定的程序，抗原片段可與載體分子附著。在一些實(shí)施方式中，使用(用或不用連接基團(tuán)的)化學(xué)共價軛合和當(dāng)閱讀本發(fā)明后由技術(shù)人員可鑒定的程序，抗原片段可與載體分子附著。在一些實(shí)施方式中，融合產(chǎn)物或抗原片段可用在脈粥樣硬化的治療中和/或用于誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中,通過接種的抗原—特異性免疫調(diào)控是用來預(yù)防或治療與動脈粥樣硬化形成關(guān)聯(lián)的慢性炎癥性疾病的一種方法。在這些情況的^-些中,通過以抗原-特異性方式調(diào)動保護(hù)性免疫應(yīng)答，可避免由于對感染的宿主防護(hù)的妨礙導(dǎo)致的副作用。示例性方案包括在用LDL、f3 2-糖蛋白-lb或熱激蛋白60/65免疫的小鼠和兔中治療動脈粥樣硬化的描述的方案，以及減少高血脂動物中的動脈粥樣硬化疾病的腸胃外(7-10)和口服(11-14)免疫。其他方案。在一些實(shí)施方式中,可通過若干 不同的機(jī)制，比如保護(hù)性抗體的產(chǎn)生、致病性T細(xì)胞克隆的缺失或失活(無反應(yīng)性)或通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)介導(dǎo)的抑制性細(xì)胞免疫的誘導(dǎo)(15-1.6),實(shí)現(xiàn)抗原-特異性免疫保護(hù)。在這些實(shí)施方式的一些中，可進(jìn)行用免疫顯性肽序列的免疫,在若干情況下可替代用LDL顆粒的免疫(17-18)。在一種實(shí)施方式中，可進(jìn)行促進(jìn)抗原-特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的選擇性靶向的免疫方案。主要通過免疫途徑測定觸發(fā)的免疫應(yīng)答的類型。在若干種實(shí)施方式中，可 使用各種施用途徑(包括皮下、肌肉、腸胃外和全身和粘膜施用比如口服和/或鼻施用)，給個體施用本文描述的融合產(chǎn)物或抗原片段。特別地，氣道和腸的被覆粘膜含有淋巴組織，當(dāng)與抗原接觸時，引起抗-炎癥性、免疫抑制性應(yīng)答
(19)。呼吸器官和腸粘膜層的不同的免疫特征導(dǎo)致通過鼻途徑或口服途徑的抗原接觸時的保護(hù)性免疫類型部分不同(20)。在一些實(shí)施方式中，霍亂毒素B亞基(CTB)促進(jìn)經(jīng)由鼻和口粘膜層的抗原攝取并誘導(dǎo)保護(hù)性免疫(21，22)。在一些實(shí)施方式中,在使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活化并使針對Apo B的致病性自身免疫下調(diào)的條件下，進(jìn)行一段時間的載體/佐劑/肽疫苗施用。特別地，在一些實(shí)施方式中，通過鼻施用ApoBlOO肽-CTB融合蛋白(p210-CTB),進(jìn)行融合蛋白施用。在一些實(shí)施方式中，用P210-CTB治療顯著減少apoe+小鼠中的動脈粥樣硬化并且所述治療與抗原-特異性Treg活性的誘導(dǎo)關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方式中,用apoB-100融合蛋白的鼻內(nèi)免疫誘導(dǎo)抗原-特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞并減少動脈粥樣硬化。在若干種實(shí)施方式中，與CTB融合的ApoBlOO肽的鼻施用使動脈粥樣硬化衰減并誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性Trl細(xì)胞，所述調(diào)節(jié)性Trl細(xì)胞抑制對載脂蛋白B-100的T效應(yīng)物應(yīng)答。在一些實(shí)施方式中，本文描述的融合產(chǎn)物、組合物和/或組合方法可用作誘導(dǎo)防止動脈粥樣硬化免疫(包括誘導(dǎo)抗原—特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)的新穎策略。特別地,在若干種實(shí)施方式中，通過apoB-100的免疫顯性肽和免疫調(diào)控CTB連接的融合蛋白的鼻施用，我們已經(jīng)能誘導(dǎo)對apoB-100的防止動脈粥樣硬化的免疫應(yīng)答,所述免疫應(yīng)答包括擴(kuò)展抗原-特異性調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞并抑制主動脈損傷發(fā)展。
在若干種實(shí)施方式中，使用LDL免疫的腸胃外或口服途徑,用本文描述的融合蛋白、方法和系統(tǒng)對抗原-特異性Treg的誘導(dǎo)提供了動脈粥樣化保護(hù)。此外，實(shí)施例部分中闡釋的關(guān)于在天然發(fā)展動脈粥樣硬化并因此在接種時已對斑塊抗原(比如LDL顆粒)敏感的apoe+小鼠中的抗原-特異性防止動脈粥樣硬化的免疫粘膜層免疫的誘導(dǎo)的結(jié)果支持下述結(jié)論:在有先前存在的損傷的人中類似的方法被預(yù)期可以提供免疫。
在一些實(shí)施方式中，本文描述的融合蛋白觸發(fā)其中防止動脈粥樣硬化作用與apoB-100-特異性效應(yīng)T細(xì)胞的Treg抑制的誘導(dǎo)并行的動脈粥樣化保護(hù)機(jī)制，并且增加IL-10+CD4+T細(xì)胞。特別地,在一些實(shí)施方式中，通過抗原-特異性、IL-1.0+調(diào)節(jié)性Trl細(xì)胞的誘導(dǎo)，用P210-CTB的鼻免疫預(yù)防動脈粥樣硬化。僅用于指導(dǎo)目的的本文提供的并且不意圖被限制的可能的解釋是:在若〒情況下動脈粥樣化保護(hù)不涉及免疫抑制性細(xì)胞因子TGF-,因?yàn)樵谟赥細(xì)胞上缺乏功能性TGF-受體的小鼠中用p210-CTB的鼻免疫也減少動脈粥樣硬化。在一些實(shí)施方式中，本文描述的融合蛋白提供與在Treg(25)的研究中報(bào)道的類似的抗原-特異性以及抗原-依賴性作用。特別地，在一些實(shí)施方式中，Treg抑制具有相同的抗原特異性的常規(guī)效應(yīng)T細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，Treg以抗原 依賴性方式對抗原提呈細(xì)胞發(fā)揮主要作用。在一些實(shí)施方式中,抗原-特異性動脈粥樣化保護(hù)與通過對P210而不是OVA特異性的Treg的apoBlOO-特異性效應(yīng)T細(xì)胞的抑制是并行的。這些發(fā)現(xiàn)支持動脈粥樣硬化中的自身抗原-特異性Treg的保護(hù)作用。在一些實(shí)施方式中，已鑒定出通過抗原接觸在外周中誘導(dǎo)Treg的兩個主要類型:FoxP3+誘導(dǎo)的Treg(ThS)14和Trl細(xì)胞(26)。Trl細(xì)胞是FoxP3陰性的、分泌IL-10并被認(rèn)為當(dāng)調(diào)節(jié)的免疫由鼻免疫誘導(dǎo)時發(fā)揮主要作用(27)、(28)。在--些實(shí)施方式中,其中動脈粥樣化保護(hù)由鼻免疫誘導(dǎo)并與抑制性T細(xì)胞活性和產(chǎn)生IL-10的CD4+T細(xì)胞關(guān)聯(lián),本文描述的融合蛋白的施用與通過P210-CTB的Trl誘導(dǎo)關(guān)聯(lián)。具有抗原-特異性抑制活性的CD4+T細(xì)胞得自脾臟——已知的Trl細(xì)胞儲存器(26)。在一些實(shí)施方式中，如通過在鼻免疫的小鼠的主動脈中FoxP3mRNA的增加表示的，施用本文描述的融合蛋白后，F(xiàn)0XP3+Treg可在該模型中促成動脈粥樣化保護(hù)。在一些實(shí)施方式中，這些細(xì)胞可不僅直接起控制促炎癥效應(yīng)T細(xì)胞的作用而且促進(jìn)Trl細(xì)胞的活化
(19)。在一些實(shí)施方式中，其中檢測到TGF-13信號取消，Trl細(xì)胞不會消減動脈粥樣化保護(hù)。在一些實(shí)施方式中,其中Treg標(biāo)記物還在OVA-CTB免疫的小鼠中提高,抗原非特異性作用可協(xié)同抗原-特異性作用以賦予保護(hù)。在一些實(shí)施方式中，ApoBlOO肽序列的抗體由鼻免疫誘導(dǎo)，但不會與天然的小鼠LDL顆粒交叉作用。而且,在一些實(shí)施方式中,其中顆粒抗體滴度不與損傷大小相關(guān)并且在apoB-100-CTB免疫的和OVA-CTB免疫的小鼠之間在脂蛋白譜中沒有檢測到差異,動脈粥樣化保護(hù)與免疫調(diào)控而不是抗體-依賴性的LDL的消除關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方式中,本文描述的融合蛋白與合適的佐劑和/或賦形劑一起包含在組合物中。本文中使用的術(shù)語“佐劑”表示藥理或免疫試劑,其改變其他試劑(例如,藥物、疫苗)的作用，同時當(dāng)其自身給出時，其幾乎沒有(如果有的話)直接的作用。它們通常包括在疫苗中以提高受者對提供的抗原的免疫應(yīng)答同時將注入的外源材料保持在最小量。佐劑的類型包括:刺激免疫系統(tǒng)并增強(qiáng)對疫苗的應(yīng)答、而其本身而言不具有任何特異性抗原作用的免疫佐劑。本文中使用的術(shù)語“賦形劑”表示用作藥物活性成分的載劑的非活性物質(zhì)。示例性賦形劑可用來增大含有非常有效的活性成分的配方，以允許便利的、準(zhǔn)確的劑量。除了它們在單劑量中的用途，賦形劑可在制造過程中使用，以幫助處理有關(guān)的活性物質(zhì)。取決于施用的途徑和藥物形式，可使用由技術(shù)人員可鑒定的不同的賦形劑。
在一些實(shí)施方式中，組合物包含與載體分子和可能的毒素/類毒素(破傷風(fēng)毒素、白喉類毒素、霍亂毒素B亞基、以及BSA、HAS、rHSA、KLH、卵白蛋白)融合的apoB-100 (單個或多個拷貝)的選擇的(免疫原性)肽片段。在一些實(shí)施方式中，佐劑和賦形劑是藥物上可接受的并且得到的組合物是藥物組合物。在這些實(shí)施方式的一些中，藥物組合物是疫苗。在一些實(shí)施方式中，佐劑是例如通過抗原-提呈細(xì)胞促進(jìn)抗原攝取的、增強(qiáng)抗原的免疫原性的疫苗配方的組分(17,29)。令人感興趣地,兩個研究記錄了弗氏完全佐劑在高膽固醇血Idlr+和apoe+小鼠中的防止動脈粥樣硬化作用(30-31)。在最近的研究中,鋁佐劑的皮下施用顯示了在高膽固醇血小鼠中增加抗原攝取和細(xì)胞免疫應(yīng)答活化(32)。在一些實(shí)施方式中，在用本文中描述的OVA-CTB免疫的小鼠主動脈中的對apoB-100肽的特異性抗體應(yīng)答和免疫調(diào)控細(xì)胞因子譜與此類佐劑作用^-致。這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了在免疫制劑中使用最佳免疫調(diào)控組分的重要性。在若干種實(shí)施方式中，通過將LDL蛋白組分載脂蛋白B-100的肽靶向鼻粘膜層來誘導(dǎo)保護(hù)性粘膜層的免疫應(yīng)答，提供防止動脈粥樣硬化的疫苗。通過閱讀本公開,本領(lǐng)域技術(shù)人員可鑒定出涉及實(shí)施本文描述的融合產(chǎn)物方法的進(jìn)一步細(xì)節(jié)和試劑盒的一般制造和包裝,所述方法包括進(jìn)行所述方法的系統(tǒng)，其可以為部件以及相關(guān)組合物的試劑盒形式,所述組合物包括供體、受體、化合物和其他試劑以及組合物的合適的載體、試劑或輔助試劑。
實(shí)施例本文描述的融合蛋白及相關(guān)的組合物方法和系統(tǒng)在下述實(shí)施例中進(jìn)一步闡釋，所述方法和系統(tǒng)通過闡釋的方式提供并且不是意圖限制。特別地，下述實(shí)施例闡釋了用包含與CTB融合的人apoB-100 (p210)的氨基酸3136-3155的融合蛋白(也稱作p210-CTB)進(jìn)行的示例性免疫。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識到:針對P210-CTB詳細(xì)描述的特征對于根據(jù)本發(fā)明的包含apoB-100的另一抗原肽和載體分子的其他融合蛋白也同樣適用。更具體地，在下述實(shí)施例中，從與CTB融合的人apoB-100 (p210)15的氨基酸3136-3155中制得重組蛋白——p210-CTB。除了在小鼠中C-末端上2-殘基插入之外，該序列與對應(yīng)的鼠類序列是等同的。作為對照，卵白蛋白的氨基酸323-339與CTB融合(OVA-CTB)。8-周大的雌性apoe+小鼠每周兩次接受具有1.5 y G(在15 U L中)p210-CTB或OVA-CTB的鼻噴霧。稍后在12周分析損傷和免疫參數(shù)。在另一組實(shí)驗(yàn)中，使用相同的方案對apoe+x CD4dnTGF0RII小鼠(23)免疫。所有的實(shí)驗(yàn)由Stockholm地區(qū)倫理委員會批準(zhǔn)。使用標(biāo)準(zhǔn)方案，在主動脈根部的低溫恒溫切片中分析動脈粥樣硬化損傷(24)。通過免疫測定ELISAlb分析對p210和對小鼠LDL顆粒的抗體。如在線增刊(Online Supplement)中描述的進(jìn)行其他檢驗(yàn)。以下述方式分析抗原-特異性Treg活性:用apoB-100對apoe+小鼠皮下免疫以產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞。來自這些小鼠的CD4+T細(xì)胞接觸抗原并且活化記為DNA合成。將來自用P210-CTB鼻內(nèi)免疫的apoe+小鼠的CD4+T細(xì)胞添加至效應(yīng)T細(xì)胞制劑并且Treg活性記做DNA合成的抑制(見在線增刊)。在CD4+T細(xì)胞....t進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色以表征細(xì)胞因子產(chǎn)生和T細(xì)胞亞型。關(guān)于使用的程序的其他細(xì)節(jié)和獲得的結(jié)果在下面報(bào)告。實(shí)施例1:肽文庫的產(chǎn)生通過關(guān)注 在LDL中發(fā)現(xiàn)的單個蛋白，載脂蛋白B_100(apo B)，表征了特異性免疫表位。產(chǎn)生了由長度為20個氨基酸殘基的302個肽組成的肽文庫，其覆蓋全部的人類apoB的4563氨基酸序列。產(chǎn)生的肽具有5個氨基酸重疊，以在中斷點(diǎn)上覆蓋所有的序列。如下文表2中所示的，從apo B的N-末端開始,肽編號為1-302。
權(quán)利要求
1.融合蛋白，其包含 apoB-100蛋白的抗原片段或其衍生物和 蛋白載體， 其中所述抗原片段和所述蛋白載體以I 的片段:載體摩爾比包含在所述融合蛋白中；且 其中所述融合蛋白能誘導(dǎo)抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,所述抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對所述apoB-100的抗原片段是特異性的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述抗原片段包含選自下述組的一種或多種肽:P2、P11、P25、P32、P45、P74、P102、P129、P143、P1.48、P154, P162、P210、P219 和 P240。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述抗原片段包含選自下述組的一種或多種肽:P2、P45、P102 和 P210。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白，其中所述抗原片段包含P210。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的融合蛋白，其中所述蛋白載體選自下述組:霍亂毒素B亞基、親和素、BTG蛋白、牛G球蛋白、牛免疫球蛋白G、牛甲狀腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、伴清蛋白、Edestein、來自銅綠假單胞菌的胞外蛋白A、HC(來自巨蟹 的血藍(lán)蛋白)、羅曼蝸牛血藍(lán)蛋白(HPII)、人血清白蛋白(IISA)、KTI (來自大豆的Kuni ts型胰蛋白酶抑制劑)、匙孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KL0、LPH(來自美洲鱟的血藍(lán)蛋白)卵白蛋白、Pam3Cys-Th、聚賴氨酸、豬甲狀腺球蛋白(PTG)、純化的蛋白衍生物(PPD)、兔血清白蛋白(RSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)、向日葵球蛋白(SFG)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的融合蛋白，其中所述蛋白載體是細(xì)胞因子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的融合蛋白，其中所述蛋白載體是霍亂毒素B亞基。
8.治療和!或預(yù)防個體中的動脈粥樣硬化的方法,所述方法包括: 給所述個體施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至7的任一項(xiàng)的融合蛋白， 所述有效量在所述個體中引起抗原特異性Treg免疫調(diào)控應(yīng)答， 所述抗原特異性Treg免疫調(diào)控應(yīng)答對所述apoB-1OO的抗原片段或其衍生物是特異性的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法,其中通過口服或鼻或鼻施用途徑進(jìn)行所述施用。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法,其中通過皮下施用途徑進(jìn)行所述施用。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中通過肌肉施用途徑進(jìn)行所述施用。
12.包含根據(jù)權(quán)利要求1至7的任一項(xiàng)的融合蛋白以及佐劑和!或賦形劑的免疫原性組合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求的12的免疫原性組合物，其中所述佐劑和/或賦形劑是藥物上可接受的且所述組合物是藥物組合物。
14.生產(chǎn)融合蛋白的方法,所述方法包括: 使apoB-100的抗原片段或其衍生物與合適的蛋白載體以1:1的片段:載體摩爾比附著以提供能誘導(dǎo)抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的融合蛋白，所述抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對所述apoB-100的片段或其衍生物是特異性的。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法,其中所述apoB-100的抗原片段包含P2、P11、P25、P32、P45、P74、P102、P129、P143、P148、P154、P162、P210、P219 和 P240 中的一種或多種。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的方法,其中所述合適的蛋白載體包含下述的一種或多種:霍亂毒素B亞基、親和素、BTG蛋白、牛G球蛋白、牛免疫球蛋白G、牛甲狀腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、伴清蛋白、Edestein、來自銅綠假單胞菌的胞外蛋白A、IIC (來自巨蟹的血藍(lán)蛋白)、羅曼蝸牛血藍(lán)蛋白(HPH)、人血清白蛋白(HSA)、KU (來自大豆的Kmiits型胰蛋白酶抑制劑)、匙孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KLH)、LPH(來自美洲鱟的血藍(lán)蛋白)卵白蛋白、Pam3Cys-Th、聚賴氨酸、豬甲狀腺球蛋白(PTG)、純化的蛋白衍生物(PPD)、兔血清白蛋白(RSA)、大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)和向日葵球蛋白(SFG)。
17.根據(jù)權(quán)利要求14或15的方法，其中所述蛋白載體是細(xì)胞因子。
18.根據(jù)權(quán)利要求14至17的任--項(xiàng)的方法,其中通過生物遺傳工程改造進(jìn)行所述附 著。
19.根據(jù)權(quán)利要求14至17的任一項(xiàng)的方法,其中通過化學(xué)共價軛合進(jìn)行所述附著。
20.誘導(dǎo)抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的方法，所述方法包括使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求I至7的任一項(xiàng)的融合蛋白接觸,所述接觸在允許T調(diào)節(jié)性應(yīng)答的誘導(dǎo)的條件下進(jìn)行一段時間， 其中所述接觸導(dǎo)致對包含在融合蛋白中的所述apoB-100的片段或其衍生物特異性的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抗原-特異性誘導(dǎo)。
全文摘要
包含apoB-100的抗原片段和合適的載體的融合蛋白及相關(guān)的組合物、方法和系統(tǒng)。
文檔編號C07K19/00GK103221425SQ201180018092
公開日2013年7月24日 申請日期2011年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月5日
發(fā)明者揚(yáng)·尼爾森, 約蘭·K·翰森, 揚(yáng)·霍姆格倫 申請人:卡迪瓦克斯有限責(zé)任公司, 揚(yáng)·霍姆格倫