專利名稱：Dr5 結(jié)合多肽激動劑的制作方法
DR5結(jié)合多肽激動劑
背景技術：
腫瘤壞死因子(TNF)相關凋亡誘導配體(TRAIL)在多種致瘤和轉(zhuǎn)化細胞系中誘導凋亡，對正常細胞具有很小的作用或無作用。已鑒定出至少5個TRAIL受體，其中2個，即DR4 (死亡受體 4，TRAIL-Rl)和 DR5 (死亡受體 5，TRAIL-R2 ；KILLER 或 TRICK 2)能夠轉(zhuǎn)導凋亡信號，而另外3個(TRAIL-R3，TRAIL-R4和可溶性0PG)作為誘餌受體來阻斷TRAIL介導的凋亡。見例如 Ozoren 和 El-Deiry, Sem. Cancer Bioll3:135 (2003) ;Yagita 等，CancerSci.，95(10) :777(2004)。TRAIL或Apo2L是281個氨基酸的細胞毒性配體，發(fā)現(xiàn)其整合入細胞質(zhì)膜，C端暴露在細胞的胞外表面(II型配體)。還可以檢測到少量可溶性TRAIL配體。TRAIL形成同三聚體分子，結(jié)合其各自受體，起始信號發(fā)放事件級聯(lián)。
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TRAIL配體與受體DR4或DR5的結(jié)合起始外在細胞死亡途徑，導致誘導死亡的信號傳遞復合物(DISC)的形成，該復合物包含銜接頭FADD (Fas激活DD)和胱天蛋白酶原8或胱天蛋白酶原10。DISC上的相互作用和下游級聯(lián)的激活類似于FAS，導致NF K B和Jun N端激酶途徑(JNK)的激活。見例如 Mongkolsapaya 等，Nat. Struct. Biol. , 6(11) : 1048 (1999)；Cha 等，J. Biol. Chem.，275 (40) :31171 (2000)。TRAIL 與 DR4 或 DR5 的結(jié)合還導致 BID 切割(通過胱天蛋白酶8或10)、線粒體激活，從而導致內(nèi)在凋亡途徑的激活。TRAIL配體優(yōu)先誘導腫瘤細胞的凋亡而對正常細胞具有很小的作用或無作用的能力使它成為癌癥治療的潛在良好的候選物。但是，已顯示可溶性TRAIL在體外誘導正常人肝細胞的凋亡，突出了潛在的毒性憂慮。見例如Jo等，Nat Med. 6 (5) : 564 (2000) 0癌癥治療的更有利的靶標是DR5。因為DR5需要多個受體來誘導正常肝細胞的凋亡，所以開發(fā)針對負責誘導凋亡的具體DR5的激動劑，預測可以避免針對正常細胞的此毒性，同時保留殺死腫瘤細胞的能力。已用DR5的肽和抗體激動劑在表達DR5的細胞中誘導凋亡。見例如Li等，J. Mol.Biol.，361，522-536(2006) ；Kajiwara 等,Biochim. Biophys. Acta 1699:131-137(2004)；Yang等，Cancer Cell，5，501-512 (2004)。DR5的激動劑具有用于癌癥治療中抵抗范圍廣泛的癌癥的潛能。例如，抗DR5的單克隆抗體Lexatumumab在腎細胞癌的小鼠模型中誘導DR5的表達并促進凋亡。Zhang等，Cancer Lett. 251 (I) : 146-57 (2007)。其他抗DR5的激動劑性單克隆抗體，或抗DR5的單鏈Fv片段，及其殺腫瘤活性也被類似地描述于例如 Takeda 等,Journal Exp. Medicine, 199, 437-448 (2004) ；Guo 等,J. Biol.Chem.，280，41940-41952(2005) ；Motoki 等,Clin.Cancer Res 11 (8):3126-35(2005)；和 Ichikawa 等，Nature Medicine,7，954-960 (2001) ；Chuntharapai 等，J.Immunol. 166(8) :4891-8(2001) ;Shi 等，Cancer Res.，66 (24) : 11946-11953 (2006)中。正在研發(fā)多種DR5特異性抗體用于臨床，但尚無任何一種獲批。據(jù)信，為了激活DR5，需要多個交聯(lián)抗體，在作用部位足量遞送這些抗體來達到可再現(xiàn)的療效仍存在問題。因此，存在對用于治療相關疾病的改進的DR5特異性激動劑的需要。發(fā)明概述
本發(fā)明涉及包含本文提供的針對死亡受體5 (本文稱為“DR5”)的氨基酸序列的一種或多種“NB劑”，以及涉及包含一個或多個這種氨基酸序列或基本上由一個或多個這種氨基酸序列組成的特異性化合物或構建體，尤其是蛋白質(zhì)和多肽(也分別稱為“化合物”和“多肽”)，及其片段，以及編碼這類構建體的核酸。本文提供本發(fā)明的DR5特異性構建體的單體變體和多聚體變體。提供NB劑的人源化變體和人工程化(humaneered)變體。在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物相關NB劑作為TRAIL受體DR5的激動劑起作用。本發(fā)明還涉及編碼這類氨基酸序列和多肽的核酸；用于制備這類氨基酸序列和多肽的方法；表達或能夠表達這類氨基酸序列或多肽的宿主細胞；包含這類氨基酸序列、多肽、核酸和/或宿主細胞的組合物，尤其是藥物組合物；以及這類氨基酸序列或多肽、核酸、宿主細胞和/或組合物的用途，尤其是用于預防、治療或診斷目的，如本文提到的目的。本文描述為NB劑的TRAIL受體DR5的激動劑具有用于治療中對抗范圍廣泛的DR5相關疾病的潛能。因此，本發(fā)明的NB劑在增生性疾病的治療中具有效用，該增生性疾病包括例如，癌癥，如實體瘤，原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥，如腎細胞癌和肺癌(例如小細胞肺 癌“SCLC”和非小細胞肺癌“NSCLC”)，胰腺、造血系統(tǒng)惡性腫瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，星形細胞瘤，間皮瘤，結(jié)腸直腸癌，前列腺癌，骨肉瘤，黑素瘤，淋巴瘤(包括但不限于伯基特淋巴瘤)，乳腺癌，子宮內(nèi)膜癌，肝癌，胃癌，皮膚癌，卵巢癌和任意來源(例如肺、頭和頸、乳腺、甲狀腺、子宮頸、皮膚、食管等)的鱗狀細胞癌；以及液體癌癥，例如白血病(見例如Uno等，NatureMedicine, 12 (6) : 693-698 (2006))，尤其包括T細胞白血病(如急性T細胞白血病(T-ALL))、急性B細胞白血病(B-ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)、漿細胞性骨髓瘤和多發(fā)性骨髓瘤(麗)。本發(fā)明的NB劑在非癌適應癥的治療中也具有效用，該非癌適應癥包括炎性和自身免疫性疾病,如系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、橋本病、類風濕性關節(jié)炎、移植物抗宿主疾病、干燥綜合癥、惡性貧血、艾迪生病、硬皮病、肺出血腎炎綜合癥、克羅恩病、自身免疫性溶血性貧血；不育、重癥肌無力、多發(fā)性硬化、突眼性甲狀腺腫(Basedow’ sdisease);血栓形成性血小板減少癥、血小板減少性紫癜、胰島素依賴性糖尿病、變態(tài)反應；哮喘；特應性疾病；動脈硬化；心肌炎；心肌病；腎小球腎炎(globerula nephritis);和再生不良性貧血。本文描述的氨基酸序列和多肽可以針對任意DR5或?qū)θ我釪R5特異。根據(jù)一個非限制性方面，本文所述的氨基酸序列和多肽針對DR5。在一個實施方案中，NB劑特異性結(jié)合DR5胞外域。本發(fā)明的多肽和組合物可以一般地用于調(diào)節(jié)DR5。在一個實施方案中，NB劑將觸發(fā)、激活和/或增加或增強由DR5介導的信號發(fā)放。在一個實施方案中，NB劑對DR5的激動作用將調(diào)節(jié)，尤其是觸發(fā)或增加，與DR5、其信號發(fā)放和/或DR5所涉及的途徑相關的生物學機制、反應和效應。在一個實施方案中，本文所述的化合物、多肽和組合物誘導、觸發(fā)、增加或增強在某些細胞或組織中的凋亡。在一個實施方案中，本文所述的化合物、多肽和組合物能夠結(jié)合細胞表面上的DR5，尤其是以誘導、觸發(fā)、增加或增強DR5介導的信號發(fā)放這樣的方式結(jié)合DR5。在一個實施方案中，本文所述的多肽和組合物可以是這樣的，它們能夠結(jié)合DR5從而在其上存在DR5的細胞中觸發(fā)或誘導凋亡。在一個實施方案中，本文所述的NB化合物、(單價或多價)多肽和組合物可以結(jié)合DR5上的TRAIL結(jié)合部位。在一個實施方案中，NB劑與TRAIL競爭結(jié)合DR5。在一個實施方案中，該化合物和多肽與DR5的結(jié)合誘導、觸發(fā)、增加或增強由DR5介導的信號發(fā)放，尤其是在其上存在DR5的細胞中觸發(fā)或誘導凋亡。本發(fā)明的其他方面、實施方案、優(yōu)勢和應用將從本文的進一步描述變得顯而易見。附圖
簡述圖I是ELISA實驗的圖示，顯示多價抗-DR5NB劑對TNF受體家族成員的結(jié)合。圖2是四價抗-DR5 NB劑的腫瘤組織H)(胱天蛋白酶3/7激活)的圖示。圖3是四價和五價抗-DR5 NB劑在Colo205腫瘤模型中的體內(nèi)功效的圖示。圖4A和4B圖示11H6四聚體在無(圖4A)或有(圖4B) CSF-IR抑制劑的情況下在 生長于NSG宿主(即巨噬細胞/NK缺陷宿主)中的MiaPaCa胰腺腫瘤模型中表現(xiàn)出抗腫瘤活性。圖5顯示11H6四聚體使患者來源的胰腺腫瘤TPAN1-IFA消退的能力，該腫瘤對LCR211 (一種對DR5特異的鼠抗體)不敏感。圖6A、6B和6C的圖示顯示了，對于(圖6A ) 11H6三聚體、四聚體和五聚體在Colo205細胞中，(圖6B) 4E6和11H6四聚體和五聚體在Colo205細胞中，以及(圖6C) 4E6和11H6四聚體和五聚體在H226細胞中，NB構建體中增加的亞基數(shù)對應于改善的功效和效力。發(fā)明詳述本文所述的NB劑(即化合物、多肽(單價或多價)和組合物)結(jié)合死亡受體5(“DR5”)。在一個實施方案中，所公開的化合物和多肽與DR5的結(jié)合誘導、觸發(fā)、增加或增強由DR5介導的信號發(fā)放，尤其是在其上存在DR5的細胞中觸發(fā)或誘導凋亡。如本文所使用，本發(fā)明的“NB劑”定義為特異性結(jié)合DR5多肽且其結(jié)合對DR5活性產(chǎn)生激動作用的、包含至少一個CDR3序列的多肽，或編碼該多肽的核苷酸。在一個實施方案中，本發(fā)明的NB劑是具有Vh結(jié)構域的一般結(jié)構的多肽。在一個實施方案中，本發(fā)明的NB劑是具有Vhh結(jié)構域的一般結(jié)構的多肽。在一個實施方案中，本發(fā)明的NB劑是具有\(zhòng)結(jié)構域的一般結(jié)構的多肽。在一個實施方案中，除該CDR3序列外，本發(fā)明的NB劑還包含至少一個⑶Rl和至少一個⑶R2序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的NB劑包含至少一個具有下文式I定義的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4構造的單價多肽。在一個實施方案中，本發(fā)明的NB劑是單體組合物。在一個實施方案中，NB劑是多聚體組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明的NB劑是單價組合物。在一個實施方案中，NB劑是多價組合物。在一個實施方案中，構架區(qū)包含為用于人而進行了序列優(yōu)化的殘基。下文描述本發(fā)明的NB劑的其他方面。術語“NB劑”被用作意在涵蓋全部范圍的本發(fā)明組合物的上位術語，而術語“NB序列”或備選的“NB構建體”在本文中用來指本文作為SEQID N0:l-72、87-88和103-104公開的具體多肽變體和編碼它們的核苷酸，包括本文作為SEQ ID NO:96-99明確公開的那些，及與SEQ ID N0:96-99編碼相同的多肽序列但因簡并密碼而不同的那些序列。本發(fā)明的NB劑在一個實施方案中，NB劑選自11D1、11H6、10F1、7A12和4E6，或其變體。在一個實施方案中，NB劑是為用于人類而對其序列進行了優(yōu)化(例如人源化)的變體。在一個實施方案中，人源化NB劑包括但不限于4E6hu和llH6hu的組。在一個實施方案中，NB劑是所列組的單體變體，或其變體。在一個實施方案中，NB劑是所列組的多聚體變體，或其變體。在一個實施方案中，所列組的多聚體變體，或其變體，是單特異性的。在一個實施方案中，所列組的多聚體變體，或其變體，是多特異性的。在一個實施方案中，多特異性NB劑(或其變體)所識別的多個表位是DR5靶標上的多種表位。在一個實施方案中，多特異性NB劑(或其變體)所識別的多個表位是DR5靶標上的至少一個表位和非DR5多肽的靶標上的至少一個表位。在一個實施方案中，NB劑選自 SEQ ID NO: 1_22、26 - 40、87_88 和 103-104，或 SEQID NO: 96-99，或其變體中的一個或多個。NB劑11D1、11H6、10F1、7A12和4E6或其變體的具
體實施方案在下文及表1-4中提供。本發(fā)明的示例性NB劑包括以下NB多肽構建體及其變體。
4E6 家族在一個實施方案中，NB劑是4E6，或其變體。在一個實施方案中，4E6構建體是SEQID N0:1的單體，或其變體。在一個實施方案中，4E6構建體是SEQ ID N0:26的單體，或其變體。在一個實施方案中，4E6構建體是包含有效連接的兩個或更多個SEQ ID N0:1的單體的多聚體，或其變體。在一個實施方案中，4E6構建體是包含有效連接的兩個或更多個SEQID NO:26的單體的多聚體，或其變體。在一個實施方案中，4E6構建體是包含有效連接的兩個或更多個單體的多聚體、或其變體，其中所述兩個或更多個單體為SEQ ID NO: I和SEQ IDNO:26單體兩者的組合，其中所述單體可以處于任何順序。在一個實施方案中，4E6多聚體構建體是SEQ ID NO: I的三聚體、四聚體或五聚體，或其變體。在一個實施方案中，4E6多聚體構建體是SEQID NO: 26的三聚體、四聚體或五聚體，或其變體。在一個實施方案中，4E6多聚體構建體是SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:26 二者組合的三聚體、四聚體或五聚體，或其變體，其中單體可以處于任意順序。在一個實施方案中，4E6構建體是SEQ ID NO:6-8和27-29的任意一個或多個中提供的多聚體，或其變體。本發(fā)明還考慮更高級的多聚體,如由6-10個亞基組成的多聚體。在一個實施方案中，4E6構建體包含SEQ ID N0:64，或其變體。在一個實施方案中，4E6構建體包含SEQ ID N0:65，或其變體。在一個實施方案中，4E6構建體包含SEQ IDNO:42 的 CDRl 序列、SEQ ID NO:52 的 CDR2 序列及 SEQ ID NO:64 和 / 或 SEQ ID NO:65 的任意一個或多個的CDR3序列，或其變體。在一個是實施方案中，4E6構建體是人源化或人工程化序列，或其變體。在一個實施方案中，4E6構建體如SEQ ID NO: 28中所提供，或其變體。在一個實施方案中，4E6構建體如SEQ ID NO:29中所提供，或其變體。在一個實施方案中，4E6構建體包含SEQ ID NO: 35、42、46、52、57、64或70，或其變體。在一個實施方案中，4E6構建體包含SEQ ID N0:36、42、47、52、58、65或71，或其變體。在一個實施方案中，NB構建體是編碼SEQ ID NO: I的4E6多肽或其變體、多聚體或片段的核酸。在一個實施方案中，NB構建體是編碼SEQ IDN0:26的4E6Hu多肽或其變體、多聚體或片段的核酸。在一個實施方案中，NB構建體是編碼4E6Hu多肽的一個或多個CDR區(qū)(即SEQ ID N0:42、52和64)的核酸，或其變體。在一個實施方案中，NB構建體是編碼4E6多肽的一個或多個⑶R區(qū)(即SEQ ID N0:42、52和65)的核酸，或其變體。在一個實施方案中，NB構建體是編碼SEQ ID NO:65的⑶R3區(qū)的核酸，或其變體。
7A12 家族在一個實施方案中，NB劑是7A12，或其變體。在一個實施方案中，7A12構建體是SEQ ID N0:2的單體，或其變體。在一個實施方案中，7A12構建體是包含有效連接的兩個或更多個SEQ ID N0:2的單體的多聚體，或其變體。在一個實施方案中，7A12多聚體構建體是SEQ ID NO: 2的三聚體、四聚體或五聚體，或其變體。在一個實施方案中，7A12構建體是SEQID N0:9-ll的任意一個或多個中提供的多聚體，或其變體。在一個實施方案中，7A12構建體包含SEQ ID N0:63。在一個實施方案中，7A12構建體包含SEQ ID N0:41的CDRl序列、SEQ ID N0:51的⑶R2序列及SEQ ID NO:63的⑶R3序列，或其變體。在一個實施方案中，7A12構建體是人源化或人工程化序列，或其變體。在一個實施方案中，7A12構建體如SEQID NO: 10中所提供，或其變體。在一個實施方案中，7A12構建體如SEQ ID NO: 11中所提供，或其變體。在一個實施方案中，7A12構建體包含SEQ ID NO: 34、41、45、51、56、63或69，或其變體。還考慮更高級的多聚體,如由6-10個亞基組成的多聚體。在一個實施方案中，NB構建體是編碼SEQ ID NO:2的7A12多肽或其變體、多聚體 或片段的核酸。在一個實施方案中，NB構建體是編碼SEQID N0:41、51和63的⑶R區(qū)中的一個或多個的核酸，或其變體。在一個實施方案中，NB構建體是編碼SEQ ID N0:63的⑶R3區(qū)的核酸，或其變體。IOFl 家族在一個實施方案中，NB劑是10F1，或其變體。在一個實施方案中，IOFl構建體是SEQ ID N0:3的單體，或其變體。在一個實施方案中，IOFl構建體是包含有效連接的兩個或更多個SEQ ID N0:3的單體的多聚體，或其變體。在一個實施方案中，IOFl多聚體構建體是SEQ ID NO:3的三聚體、四聚體或五聚體，或其變體。在一個實施方案中，IOFl構建體是SEQ ID NO: 12-16的任意一個或多個中提供的多聚體，或其變體。在一個實施方案中，IOFl構建體包含SEQ ID N0:68，或其變體。在一個實施方案中，IOFl構建體包含SEQ ID NO:44的⑶Rl序列、SEQ ID NO:55的⑶R2序列及SEQ ID NO:68的⑶R3序列，或其變體。在一個實施方案中，IOFl構建體是人源化或人工程化序列，或其變體。在一個實施方案中，IOFl構建體包含SEQ ID NO: 15，或其變體。在一個實施方案中，IOFl構建體包含SEQ ID NO: 16,或其變體。在一個實施方案中，IOFl構建體包含SEQ ID N0:40、44、50、55、62、68或72，或其變體。還考慮更高級的多聚體,如由6-10個亞基組成的多聚體。在一個實施方案中，NB構建體是編碼SEQ ID NO:3的IOFl多肽或其變體、多聚體或片段的核酸。在一個實施方案中，NB構建體是編碼SEQID NO:44,55和68的⑶R區(qū)中的一個或多個的核酸，或其變體。在一個實施方案中，NB構建體是編碼SEQ ID N0:68的⑶R3區(qū)的核酸，或其變體。IlDl 家族在一個實施方案中，NB劑是11D1，或其變體。在一個實施方案中，IlDl構建體是SEQ ID N0:4的單體，或其變體。在一個實施方案中，IlDl構建體是包含有效連接的兩個或更多個SEQ ID N0:4的單體的多聚體，或其變體。在一個實施方案中，IlDl多聚體構建體是SEQ ID N0:4的三聚體、四聚體或五聚體，或其變體。在一個實施方案中，IlDl構建體是SEQ ID NO: 17-19的任意一個或多個中提供的多聚體，或其變體。在一個實施方案中，IlDl構建體包含SEQ ID N0:67，或其變體。在一個實施方案中，IlDl構建體包含SEQ ID NO:43的CDRl序列、SEQ ID NO:54的CDR2序列及SEQ ID N0:67的CDR3序列，或其變體。在一個實施方案中，IlDl構建體是人源化或人工程化序列，或其變體。在一個實施方案中，IlDl構建體包含SEQ ID NO: 18，或其變體。在一個實施方案中，IlDl構建體包含SEQ ID NO: 19,或其變體。在一個實施方案中，IlDl構建體包含SEQ ID N0:39、43、49、54、61、67或71，或其變體。還考慮更高級的多聚體,如由6-10個亞基組成的多聚體。在一個實施方案中，NB構建體是編碼SEQ ID NO:4的IlDl多肽或其變體、多聚體或片段的核酸。在一個實施方案中，NB構建體是編碼SEQID N0:43、54和67的⑶R區(qū)中的一個或多個的核酸，或其變體。在一個實施方案中，NB構建體是編碼SEQ ID N0:67的⑶R3區(qū)的核酸，或其變體。 UH6 家族在一個實施方案中，NB劑是11H6，或其變體。在一個實施方案中，11H6構建體是SEQ ID N0:5的單體，或其變體。在一個實施方案中，11H6構建體是SEQ ID N0:30的單體，或其變體。在一個實施方案中，11H6構建體是包含有效連接的兩個或更多個SEQ ID NO:5的單體的多聚體，或其變體。在一個實施方案中，11H6構建體是包含有效連接的兩個或更多個SEQ ID NO:30的單體的多聚體，或其變體。在一個實施方案中，11H6構建體是包含有效連接的兩個或更多個單體的多聚體，或其變體(例如SEQ ID N0:88)，其中所述兩個或更多個單體為SEQ ID N0:5和SEQ IDN0:30 二者的組合，其中所述單體可以處于任意順序。還考慮更高級的多聚體，如由6-10個亞基組成的多聚體。在一個實施方案中，11H6多聚體構建體是SEQ ID NO: 5的三聚體、四聚體或五聚體，或其變體。在一個實施方案中，11H6多聚體構建體是SEQ ID NO: 30的三聚體、四聚體或五聚體，或其變體。在一個實施方案中，11H6多聚體構建體是SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:30二者組合的三聚體、四聚體或五聚體，或其變體，其中單體可以處于任意順序。在一個實施方案中，11H6構建體是SEQ ID NO: 20-22和31-33的任意一個或多個中提供的多聚體，或其變體。在一個實施方案中，11H6構建體包含SEQ ID NO: 66或83，或其變體。在一個實施方案中，11H6構建體包含SEQ ID NO: 43的CDRl序列、SEQ ID NO: 53的CDR2序列及SEQ IDNO:66的任意一個或多個的CDR3序列，或其變體。在一個實施方案中，11H6構建體是人源化或人工程化序列，或其變體。在一個實施方案中，11H6構建體如SEQ ID N0:31中所提供，或其變體。在一個實施方案中，11H6構建體如SEQ ID NO:32中所提供，或其變體。在一個實施方案中，11H6構建體如SEQ ID NO:33中所提供，或其變體。在一個實施方案中，11H6構建體包含SEQ ID NO: 37、43、48、53、59、66或70，或其變體。在一個實施方案中，11H6構建體包含 SEQ ID N0:38、43、48、53、60、66 或 71，或其變體。在一個實施方案中，NB構建體是編碼SEQ ID NO:5的11H6多肽或其變體、多聚體或片段的核酸。在一個實施方案中，NB構建體是編碼SEQID NO: 30的IlH6Hu多肽或其變體、多聚體或片段的核酸。在一個實施方案中，NB構建體是編碼SEQ ID N0:43、53和66的⑶R區(qū)中的一個或多個的核酸，或其變體。在一個實施方案中，NB構建體是編碼SEQ IDNO: 66的⑶R3區(qū)的核酸，或其變體。所考慮的其他NB劑變體在一個實施方案中，本發(fā)明的NB劑是包含選自11D1、11H6、10F1、7A12和4E6的至少兩個不同亞基的多聚體構建體，或其變體。在一個實施方案中，多聚體構建體中的具體順序包含交替亞基。SEQ ID N0:84中提供示例性構建體。考慮亞基在多聚體NB構建體內(nèi)的其他排列。基于本文的公開內(nèi)容和可選地在有限程度的常規(guī)實驗后，技術人員通常將能夠確定和選擇適宜的取代、缺失或插入，或其適宜組合，該常規(guī)實驗可以例如涉及引入有限數(shù)目的可能取代，和確定它們對這樣獲得的NB構建體的特性的影響。除所公開的本文提供的示例性NB多肽構建體外，本發(fā)明還涵蓋編碼本發(fā)明公開內(nèi)容所涵蓋的任何NB劑的核苷酸，其非限制性地包括DNA和RNA序列或其變體，可以是分離的或在重組載體中的等等，和/或為編碼區(qū)或片段，包括尤其是編碼所公開的NB構建體的CDR3區(qū)的片段。在一個實施方案中，NB劑是編碼表1-4中提供的序列中任一個的NB構建體的核酸。在一個實施方案中，NB劑是編碼SEQ ID N0:l-5、2、3、4、5、26、30和87中任一個的4E6構建體的核酸。在一個實施方案中，NB劑是編碼SEQ ID NO: 41_44、51_55和63-68中任一個的核酸。在一個實施方案中，NB劑是編碼SEQ ID N0:41-44、51-55和63-68中任一個的核酸。
下文表1-4中提供本發(fā)明的示例性序列。表頭的術語“ID”指給定的SEQ ID NO。 對于每一種NB構建體，F(xiàn)R和⑶R序列的優(yōu)選組合在本申請通篇中可互換使用。表I :來自最初篩選的單價/單體DR5結(jié)合組分的多肽序列，附SEQ IDNO
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Grf tisrdnakdtmylqmnslkpedtavyf CnaElLKRAYlDvyvNywgqgtqvtvss表2 :具有可選的接頭序列的多價抗-DR5NB構建體的多肽序列，附SEQ ID NO
權利要求
1.分離的多肽，其包含特異性結(jié)合人DR5的NB劑的單可變結(jié)構域的至少一個單體。
2.權利要求I的多肽，其中所述單可變結(jié)構域選自a)包含一個或多個互補決定區(qū)3(⑶R3)序列的單可變結(jié)構域，該一個或多個⑶R3序列選自SEQ ID NO:63-68的任何一個或多個；b)包含一個或多個互補決定區(qū)3 (⑶R3)序列的單可變結(jié)構域，該一個或多個⑶R3序列與選自SEQ ID NO:63-68的任何一個或多個的至少一個⑶R3具有90%同一性；和c)包含一個或多個互補決定區(qū)3 (CDR3)序列的單可變結(jié)構域，該一個或多個CDR3序列與選自SEQ ID NO:63-68的任何一個或多個的至少一個⑶R3具有至少95%同一性。
3.權利要求I的多肽，其中所述單可變結(jié)構域選自a)SEQID NO: 1_5、26、30和87的單可變結(jié)構域；和b)與SEQ ID N0:l-5、26、30和87的至少一個單可變結(jié)構域具有至少95%同一性的單可變結(jié)構域。
4.分離的多肽，其包含特異性結(jié)合人DR5的單可變結(jié)構域的至少3個、至少4個或至少5個單體亞基，其中所述亞基可選地通過多肽接頭連接。
5.權利要求4的多肽，其中所述多肽包含單可變結(jié)構域的相同的單體，且其中所述單可變結(jié)構域選自a) SEQ ID N0:l-5、26、30和87的單可變結(jié)構域；b)與SEQ ID NO: 1-5,26,30和87的至少一個單可變結(jié)構域具有至少90%同一性的單可變結(jié)構域；和c)與SEQID NO: 1-5、26、30和87的至少一個單可變結(jié)構域具有至少95%同一性的單可變結(jié)構域。
6.權利要求4的多肽,其包含選自以下的一個或多個亞基的氨基酸序列a)SEQ IDN0:6、9、12-14、17、20、27 和 31 的氨基酸序列；和 b)與所述 SEQ ID NO:6、9、12-14、17、20、27和31的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。
7.權利要求4的多肽，其特異性結(jié)合人DR5，且其中所述多肽對選自Colo205、Jurkat、Molt4、H2122、H226和H2052的一組至少2個腫瘤細胞系具有等于或低于IOOnM的體外效力(IC50)。
8.權利要求7的多肽，其中所述多肽具有等于或低于ΙΟηΜ、等于或低于InM、或等于或低于IOOpM的體外效力。
9.分離的多肽，其包含選自SEQID N0:l-22、26-33、87和88的一個或多個氨基酸序列的氨基酸序列。
10.權利要求I的分離的多肽，其包含至少一個互補決定區(qū)(⑶R)，該至少一個⑶R與SEQ ID NO:41 至 44 (CDR1)、SEQ ID NO:51 至 55 (CDR2)、SEQ ID NO:63 至 68 (CDR3)、更優(yōu)選SEQ ID N0:51至55和SEQ ID NO:63至68中任一個所示的CDR區(qū)的至少一個具有至少 60%、70%、80%、90%、95% 或 100% 序列同一性。
11.前述權利要求中任一項的分離的多肽，其是人源化免疫球蛋白、駝源化免疫球蛋白、或可通過親和力優(yōu)化技術獲得的免疫球蛋白，或其片段。
12.前述權利要求中任一項的分離的多肽，其基本上由輕鏈可變結(jié)構域序列，例如Vl-序列、或重鏈可變結(jié)構域序列，例如Vh-序列組成；或是結(jié)構域抗體、單結(jié)構域抗體、dAb和駝源抗體或片段，包括但不限于Vhh序列。
13.前述權利要求中任一項的分離的多肽,其基本上由Vhh序列組成，該Vhh序列 (a)與SEQ ID NO 1-22、26_40、87_88和103-104的氨基酸序列中的至少一個、或由SEQID NO:96-99中的至少一個編碼的氨基酸序列具有至少90%氨基酸同一性，其中，為了確定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸殘基；且其中 (b)可選地，根據(jù)Kabat編號的氨基酸位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108中的一個或多個被人工程化。
14.化合物，其包含一種或多種根據(jù)前述權利要求中任一項的多肽或基本上由該一種或多種多肽組成，且可選地進一步包含一個或多個其他基團、殘基、結(jié)構部分或結(jié)合單位，其中所述化合物能夠增強細胞凋亡。
15.權利要求14的化合物，其中所述至少3個、4個、5個或更多個單價結(jié)合多肽全都針對人DR5的同一結(jié)合區(qū)。
16.權利要求14的化合物，其中所述至少一個單價結(jié)合多肽針對DR5的一個結(jié)合區(qū)，至少一個其他單價結(jié)合多肽針對DR5的另一不同的結(jié)合區(qū)或另一 DR5的結(jié)合區(qū)。
17.權利要求1的多肽，其用作藥物。
18.權利要求17的多肽，其用作抗癌藥物。
19.權利要求18的多肽和至少一種可藥用載體、稀釋劑或賦形劑和/或助劑。
20.用于預防和/或治療可以通過增強細胞凋亡來治療的障礙的方法，該方法包括對有需要的受試者施用藥物有效量的至少一種任何以上權利要求的多肽。
21.權利要求20的方法，其中所述障礙是對激動DR5活性有反應的增生性疾病。
22.權利要求21的方法，其中所述增生性疾病選自 a)一種或多種實體癌癥，選自原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥，如腎細胞癌和肺癌(例如小細胞肺癌“SCLC”和非小細胞肺癌“NSCLC”)，胰腺、造血系統(tǒng)惡性腫瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，星形細胞瘤，間皮瘤，結(jié)腸直腸癌，前列腺癌，骨肉瘤，黑素瘤，淋巴瘤(包括但不限于伯基特淋巴瘤)，乳腺癌，子宮內(nèi)膜癌，肝癌，胃癌，皮膚癌，卵巢癌和任何來源的鱗狀細胞癌(包括但不限于肺、頭和頸、乳腺、甲狀腺、子宮頸、皮膚和/或食管的鱗狀細胞癌); b)一種或多種液體癌癥，選自白血病，包括尤其T細胞白血病，如急性T細胞白血病(T-ALL)、急性B細胞白血病(B-ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)、漿細胞性骨髓瘤和多發(fā)性骨髓瘤(MM);和 c)一種或多種非癌適應癥，該適應癥包括一種或多種炎性和自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、橋本病、類風濕性關節(jié)炎、移植物抗宿主疾病、干燥綜合癥、惡性貧血、艾迪生病、硬皮病、肺出血腎炎綜合癥、克羅恩病、自身免疫性溶血性貧血、不育、重癥肌無力、多發(fā)性硬化、突眼性甲狀腺腫、血栓形成性血小板減少癥、血小板減少性紫癜、胰島素依賴性糖尿病、變態(tài)反應、哮喘、特應性疾病、動脈硬化、心肌炎、心肌病、腎小球腎炎和再生不良性貧血。
23.權利要求22的方法，其中所述增生性疾病是胰腺癌。
24.權利要求22的方法，其中所述增生性疾病是T-ALL。
25.權利要求22的方法，其中所述增生性疾病是間皮瘤。
26.權利要求22的方法，其中所述增生性疾病是任何組織來源的鱗狀細胞癌。
27.權利要求22的方法，其中所述增生性疾病是AML。
28.權利要求22的方法，其中所述增生性疾病是黑素瘤。
29.權利要求22的方法，其中所述增生性疾病是骨髓瘤。
30.前述權利要求中任何一項或多項的分離的多肽，其中按照Kabat和/或Chothia規(guī)貝IJ，計算CDR。
31.前述權利要求中任何一項或多項的NB構建體，其結(jié)合表29A中提供的DR5表位或結(jié)合表30A中提供的DR5表位。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對TRAIL細胞表面受體2(本文也稱“DR5”)的氨基酸序列，以及其化合物或構建體，尤其是蛋白質(zhì)和多肽及編碼它們的核酸(本文將其整體稱為“NB劑”)及其片段，其藥物有效變體，及它們在診斷和治療DR5相關疾病和障礙中的用途。
文檔編號C07K16/28GK102884083SQ201180017709
公開日2013年1月16日 申請日期2011年2月10日 優(yōu)先權日2010年2月10日
發(fā)明者K·克羅米, B·東布雷克特, S·埃滕伯格, J·科爾克曼, J·李, K·米爾斯謝爾特, D·R·斯托弗, J·張 申請人:諾瓦提斯公司, 博靈克斯股份有限公司