Jaggedl激動劑多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化ggedl激動劑多膚及其應(yīng)用，具體涉及具有促進化ggedl與Notch 的結(jié)合，治療惡性腫瘤的多膚。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤干細胞是腫瘤中具有自我更新能力并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細胞的細胞。腫瘤干 細胞對腫瘤的存活、增殖、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)有著重要作用。從本質(zhì)上講，腫瘤干細胞通過自我更 新和無限增值維持著腫瘤細胞群的生命力；腫瘤干細胞的運動和遷徙能力又使腫瘤細胞的 轉(zhuǎn)移成為可能；腫瘤干細胞可W長時間處于休眠狀態(tài)并具有多種耐藥分子而對殺傷腫瘤細 胞的外界理化因素不敏感，因此腫瘤往往在常規(guī)腫瘤治療方法消滅大部分普通腫瘤細胞后 一段時間復(fù)發(fā)。
[0003] 研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞中Notch信號表達比正常細胞高，抑制Notch活性后雖然還 有有活性的腫瘤干細胞，但已經(jīng)不能形成腫瘤.而對照組的腫瘤下細胞能夠形成腫瘤，并 且抑制Notch活性后腫瘤下細胞數(shù)量明顯降低。所W Notch信號在腫瘤干細胞形成腫瘤過 程中能夠降低腫瘤干細胞向惡性腫瘤轉(zhuǎn)變的能力。
[0004] Jaggedl是在哺乳動物中Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的配體，Jaggedl和相鄰 細胞的Notch結(jié)合后，Notch被蛋白酶體切割，釋放出具有核定位信號的胞質(zhì)區(qū) ICNQntracellular domain of Notch)，進入細胞核與化S( -類DNA結(jié)合蛋白）結(jié)合，調(diào) 芐基因表達。提高化ggedl與Notch的結(jié)合親和力，促進化ggedl與Notch的結(jié)合，可W有 效降低腫瘤干細胞的活性，抑制腫瘤的生長，從而達到治療腫瘤的效果。
[0005] 目前，沒有成熟開發(fā)的化ggedl激動劑多膚問世，用于治療惡性腫瘤。
[0006] 本專利中的化ggedl激動劑多膚已證明在黑色素瘤病中有效，具有在其他腫瘤模 型中開發(fā)的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 發(fā)明目的
[0008] 本發(fā)明提供全新的序列，該序列為化ggedl激動劑，對惡性腫瘤具有很好的療效。 [000引技術(shù)方案
[0010] Jaggedl激動劑多膚，其特征在于其序列為YSCTCPG孤SCPGFVGGGCKGKP。
[0011] 所述的化ggedl激動劑多膚在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0012] 所述的化ggedl激動劑多膚在制備治療黑色素瘤藥物中的應(yīng)用。
[0013] 所述的化ggedl激動劑多膚在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
[0014] 一種檢測腫瘤的試劑盒，其含有權(quán)利要求1所述的化ggedl激動劑多膚。所述的 試劑盒，其特征在于還有
[0015] (1)包被液；pH9. 6的0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液；
[0016] (2)PBS緩沖液；pH7. 4的0. 02mol/L磯酸鹽緩沖液；
[0017] (3)抗體稀釋液；pH7. 4 的 0. 02mol/LPBS 和 0. 2% BSA ;
[0018] (4)封閉液；pH9. 6的0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液和2. 0% BSA
[0019] (5)洗涂液；0. 02mol/LPBS (抑7. 4)和 0. 05% Tween-20 ;
[0020] (6)底物液；可溶性單組份TMB底物溶液；
[0021] (7)終止液；2mol/L硫酸溶液；
[0022] (8) Notch 抗體；
[0023] (9)山羊抗小鼠IgG。
[0024] 有益效果
[00巧]利用固相合成法化學(xué)合成化ggedl激動劑多膚，該多膚具有全新的序列，該多膚 可體外促進化ggedl與Notch的結(jié)合，治療惡性腫瘤，如黑色素瘤。我們發(fā)現(xiàn)的化ggedl激 動劑多膚可W同時抑制黑色素瘤細胞增殖活力，并在體內(nèi)試驗中提高荷瘤小鼠生存率，具 有潛在的新藥開發(fā)價值。
[0026] Jaggedl激動劑多膚由上海生工合成。
【具體實施方式】
[0027] 實施例1
[0028] Jaggedl激動劑多膚對體外培養(yǎng)人黑色素瘤細胞的生長和存活I(lǐng)C50。
[002引采用MTT比色法。將對數(shù)生長的人黑色素瘤細胞，W 1. 0X 105加入96孔培養(yǎng)板 中，培養(yǎng)2化，實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實驗藥物化ggedl激動劑多膚 (上海生工合成）和陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設(shè)五個復(fù)孔， 培養(yǎng)4她，分別在Oh、2h、她、1化、20h、2化、3化、，4她每孔加入MTT，作用化后，加入DMS0，賠 育30min，在酶標(biāo)儀620nm處測定吸光度A值，按公式人黑色素瘤細胞生長抑制率=(1-實 驗組吸光值/對照組吸光值）X 100%。計算出實驗藥物的IC50為6. 57 y M ;陽性對照藥的 4. 43 y M，說明Jaggedl激動劑多膚具有顯著的抑制腫瘤活性。
[0030] 實施例2
[0031] Jaggedl激動劑多膚對體外培養(yǎng)人肝癌干細胞的生長和存活I(lǐng)C50。
[003引采用MTT比色法。將對數(shù)生長的人肝癌干細胞，W 1. 0X 105加入96孔培養(yǎng)板中， 培養(yǎng)2化，實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實驗藥物化ggedl激動劑多膚（上 海生工合成）和陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設(shè)五個復(fù)孔，培 養(yǎng)4她，分別在Oh、2h、她、1化、20h、2化、3化、，4她每孔加入MTT，作用化后，加入DMS0，賠 育30min，在酶標(biāo)儀620nm處測定吸光度A值，按公式人肝癌干細胞生長抑制率=(1-實驗 組吸光值/對照組吸光值）X 100%。計算出實驗藥物的IC50為11. 09 y M ;陽性對照藥的 6. 51 y M，說明Jaggedl激動劑多膚具有顯著的抑制腫瘤活性。
[003引 實施例3
[0034] 用腫瘤模型檢測化ggedl激動劑多膚的體內(nèi)活力。
[0035] 建立黑色素瘤腫瘤模型，陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑，實驗 組多膚（上海生工合成）設(shè)3個劑量；2、4、8mg/Kg。21天后，觀察小鼠存活數(shù)量，計算存 活率。結(jié)果顯示，Jaggedl激動劑多膚可有效地保護小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，5、10、 20mg/Kg，及陽性組生存率達到依次為97%，90. 1%，87%和56%。說明Jaggedl激動劑多 膚具有良好的安全性。
[0036] 實施例4含有Jaggedl激動劑多膚的ELISA試劑盒檢測
[0037] 酶連免疫吸附實驗巧LISA)試劑盒包括如下試劑：
[00測 （1)包被液；0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液（P冊.6)。稱取0. 75g碳酸軸，1. 46g碳酸氨 軸，加去離子水定容至500ml ;
[0039] (2)PBS緩沖液；0. 02mol/L磯酸鹽緩沖液（pH7. 4)。稱取0. 2g磯酸二氨鐘，2. 90g 磯酸氨二軸，8g氯化軸，加去離子水定容到1000ml ;
[0040] (3)抗體稀釋液；0. 02mol/LPBS (pH7. 4)和0. 2% BSA。稱取0. 2濁SA加入配好的 0. 02mol/L磯酸鹽緩沖液溶解定量至100ml ;
[0041] (4)封閉液；0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)和2. 0% BSA。2. 0濁SA加配好的 0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液溶解定量至100ml ;
[0042] (5)洗涂液；0. 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0. 05 % Tween-20。將 50ulTween-20 溶入 lOOml0.0 2mol/L磯酸鹽緩沖液中，震蕩混勻；
[0043] (6)底物液；可溶性單組份TMB底物溶液；
[0044] (7)終止液；2mol/L硫酸溶液。10ml98%濃硫酸加入60ml雙蒸水中，定容至 100ml，室溫保存；
[0045] 巧）Jaggedl激動劑多膚
[0046] (9) Notch抗體購自上海生工。
[0047] (10)二抗（山羊抗小鼠IgG)購自艾美捷科技有限公司 [004引使用方法：
[0049] 1、血清樣本制備：取3只荷瘤裸鼠，進行眼眶取血，每只200U L迅速離也 12000巧111 3min，取上清，按體積比1 ;2加PBS，80 °C水浴30min，12000巧m3min取上 清，-2(TC凍存?zhèn)溆??！?br>[0050] 2、Notch抗體為包被抗體，將Notch抗體溶于包被稀釋液中，濃度為100 y g/mL。 96孔酶標(biāo)板每孔加入100 y L，4°C包被過夜。棄去包被液，加入封閉液200 y以37°C封閉比。 棄去封閉液，分別加入樣品稀釋液稀釋的血清樣本lOOy L(稀釋比1 ;50)和化ggedl激動 劑多膚100 y L (10 y g/ml)及上述血清樣本50 y L和化ggedl激動劑多膚50 y L的混合物， 分成3組，37C賠育比。棄去血清，PBST和自來水間隔洗涂H次。洗涂后，每孔加入樣品稀 釋液稀釋酶標(biāo)二抗lOOuU稀釋比1;10000)，37°C賠育比。棄去二抗，洗涂。洗涂后，每孔 加入lOOy L底物液（50y L底物A，50y L底物B)，37°C反應(yīng)30min后，加入50y L 2M H2SO4 終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450皿波長測定每孔的光密度值0〇4日。"。結(jié)果Jaggedl激動劑多膚 可W和Notch抗體結(jié)合，并可W競爭血清中Notch蛋白，故說明化ggedl激動劑多膚用競爭 法檢測Notch,實現(xiàn)腫瘤預(yù)測；
[0051]
【主權(quán)項】
1. Jaggedl激動劑多肽，其特征在于其序列為YSCTCP⑶DSCPGFVGGGCKGKP。
2. 如權(quán)利要求1所述的Jaggedl激動劑多肽在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求1所述的Jaggedl激動劑多肽在制備治療黑色素瘤藥物中的應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求1所述的Jaggedl激動劑多肽在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
5. -種檢測腫瘤的試劑盒，其含有權(quán)利要求1所述的Jaggedl激動劑多肽。
6. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于還有 (1) 包被液：ρΗ9· 6的0· 05mol / L碳酸鹽緩沖液； (2) PBS緩沖液：ρΗ7· 4的0· 02mol / L磷酸鹽緩沖液； (3) 抗體稀釋液：ρΗ7· 4 的 0· 02mol / LPBS 和 0· 2% BSA ; (4) 封閉液：ρΗ9· 6的0· 05mol / L碳酸鹽緩沖液和2. 0% BSA (5) 洗滌液：0· 02mol / LPBS(pH7. 4)和 0· 05% Tween-20 ; (6) 底物液：可溶性單組份TMB底物溶液； (7) 終止液：2mol / L硫酸溶液； (8) Notch 抗體； (9) 山羊抗小鼠 IgG。
【專利摘要】本發(fā)明Jaggedl激動劑多肽及其應(yīng)用，涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及具有促進Jaggedl與Notch的結(jié)合，治療惡性腫瘤的多肽。其序列為YSCTCPGDDSCPGFVGGGCKGKP是全新的序列，它們可以在體外抑制黑色素瘤細胞和肝癌干細胞的增殖，并在體內(nèi)試驗中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開發(fā)價值。
【IPC分類】A61P35-00, G01N33-68, C07K14-00, G01N33-574, A61K38-16
【公開號】CN104672313
【申請?zhí)枴緾N201510148151
【發(fā)明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達生物科技有限公司
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年3月31日