關(guān)于Jaggedl激動(dòng)劑多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及Jaggedl激動(dòng)劑多肽及其應(yīng)用，具體涉及具有促進(jìn)Jaggedl與Notch 的結(jié)合，治療惡性腫瘤的多肽。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤干細(xì)胞是腫瘤中具有自我更新能力并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞。腫瘤干 細(xì)胞對(duì)腫瘤的存活、增殖、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)有著重要作用。從本質(zhì)上講，腫瘤干細(xì)胞通過(guò)自我更 新和無(wú)限增值維持著腫瘤細(xì)胞群的生命力；腫瘤干細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和迀徙能力又使腫瘤細(xì)胞的 轉(zhuǎn)移成為可能；腫瘤干細(xì)胞可以長(zhǎng)時(shí)間處于休眠狀態(tài)并具有多種耐藥分子而對(duì)殺傷腫瘤細(xì) 胞的外界理化因素不敏感，因此腫瘤往往在常規(guī)腫瘤治療方法消滅大部分普通腫瘤細(xì)胞后 一段時(shí)間復(fù)發(fā)。
[0003] 研宄發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞中Notch信號(hào)表達(dá)比正常細(xì)胞高，抑制Notch活性后雖然還 有有活性的腫瘤干細(xì)胞，但已經(jīng)不能形成腫瘤.而對(duì)照組的腫瘤下細(xì)胞能夠形成腫瘤，并 且抑制Notch活性后腫瘤下細(xì)胞數(shù)量明顯降低。所以Notch信號(hào)在腫瘤干細(xì)胞形成腫瘤過(guò) 程中能夠降低腫瘤干細(xì)胞向惡性腫瘤轉(zhuǎn)變的能力。
[0004] Jaggedl是在哺乳動(dòng)物中Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的配體，Jaggedl和相鄰 細(xì)胞的Notch結(jié)合后，Notch被蛋白酶體切割，釋放出具有核定位信號(hào)的胞質(zhì)區(qū) ICN(intracellular domain of Notch)，進(jìn)入細(xì)胞核與CLS( -類(lèi)DNA結(jié)合蛋白）結(jié)合，調(diào) 芐基因表達(dá)。提高Jaggedl與Notch的結(jié)合親和力，促進(jìn)Jaggedl與Notch的結(jié)合，可以有 效降低腫瘤干細(xì)胞的活性，抑制腫瘤的生長(zhǎng)，從而達(dá)到治療腫瘤的效果。
[0005] 目前，沒(méi)有成熟開(kāi)發(fā)的Jaggedl激動(dòng)劑多肽問(wèn)世，用于治療惡性腫瘤。
[0006] 本專(zhuān)利中的Jaggedl激動(dòng)劑多肽已證明在黑色素瘤病中有效，具有在其他腫瘤模 型中開(kāi)發(fā)的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 發(fā)明目的
[0008] 本發(fā)明提供全新的序列，該序列為Jaggedl激動(dòng)劑，對(duì)惡性腫瘤具有很好的療 效。
[0009] 技術(shù)方案
[0010] Jaggedl激動(dòng)劑多肽，其特征在于其序列為NSFTDDCRRSDGHCRRELDPM。
[0011] 所述的Jaggedl激動(dòng)劑多肽在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0012] 所述的Jaggedl激動(dòng)劑多肽在制備治療黑色素瘤藥物中的應(yīng)用。
[0013] 所述的Jaggedl激動(dòng)劑多肽在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
[0014] -種檢測(cè)腫瘤的試劑盒，其含有權(quán)利要求1所述的Jaggedl激動(dòng)劑多肽。
[0015] 所述的試劑盒，其特征在于還有
[0016] (1)包被液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液；
[0017] (2)PBS緩沖液：pH7. 4的0? 02mol/L磷酸鹽緩沖液；
[0018] (3)抗體稀釋液：pH7. 4 的 0? 02mol/LPBS 和 0? 2% BSA ;
[0019] (4)封閉液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液和2. 0% BSA
[0020] (5)洗滌液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 05% Tween-20 ;
[0021] (6)底物液：可溶性單組份TMB底物溶液；
[0022] (7)終止液：2mol/L硫酸溶液；
[0023] (8) Notch 抗體；
[0024] (9)山羊抗小鼠IgG。
[0025] 有益效果
[0026] 利用固相合成法化學(xué)合成Jaggedl激動(dòng)劑多肽，該多肽具有全新的序列，該多肽 可體外促進(jìn)Jaggedl與Notch的結(jié)合，治療惡性腫瘤，如黑色素瘤。我們發(fā)現(xiàn)的Jaggedl激 動(dòng)劑多肽可以同時(shí)抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖活力，并在體內(nèi)試驗(yàn)中提高荷瘤小鼠生存率，具 有潛在的新藥開(kāi)發(fā)價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】[0027] 實(shí)施例1
[0028] Jaggedl激動(dòng)劑多肽對(duì)體外培養(yǎng)人黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活I(lǐng)C50。
[0029] 采用MTT比色法。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的人黑色素瘤細(xì)胞，以1. OX 105加入96孔培養(yǎng)板 中，培養(yǎng)24h，實(shí)驗(yàn)孔、陽(yáng)性藥物對(duì)照孔分別加入不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物Jaggedl激動(dòng)劑多肽 (上海生工合成）和陽(yáng)性對(duì)照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設(shè)五個(gè)復(fù)孔， 培養(yǎng)48h，分別在Oh、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h每孔加入MTT，作用4h后，加入DMS0，孵 育30min，在酶標(biāo)儀620nm處測(cè)定吸光度A值，按公式人黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-實(shí) 驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值）X 100%。計(jì)算出實(shí)驗(yàn)藥物的IC50為4. 59 y M，陽(yáng)性對(duì)照藥的 4. 43 yM，顯示本發(fā)明與紫杉醇有相同的治療效果。
[0030] 實(shí)施例2
[0031] Jaggedl激動(dòng)劑多肽對(duì)體外培養(yǎng)人肝癌干細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活I(lǐng)C50。
[0032] 采用MTT比色法。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的人肝癌干細(xì)胞，以1. 0X 105加入96孔培養(yǎng)板中， 培養(yǎng)24h，實(shí)驗(yàn)孔、陽(yáng)性藥物對(duì)照孔分別加入不同濃度的實(shí)驗(yàn)藥物Jaggedl激動(dòng)劑多肽（上 海生工合成）和陽(yáng)性對(duì)照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設(shè)五個(gè)復(fù)孔，培 養(yǎng) 48h，分別在 Oh、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h 每孔加入 MTT，作用 4h 后，加入 DMS0，孵 育30min，在酶標(biāo)儀620nm處測(cè)定吸光度A值，按公式人肝癌干細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-實(shí)驗(yàn) 組吸光值/對(duì)照組吸光值）X 100%。計(jì)算出實(shí)驗(yàn)藥物的IC50為6. 73 yM，陽(yáng)性對(duì)照藥的 6. 51 yM，說(shuō)明Jaggedl激動(dòng)劑多肽具有顯著的抑制腫瘤活性。
[0033] 實(shí)施例3
[0034] 用腫瘤模型檢測(cè)Jaggedl激動(dòng)劑多肽的體內(nèi)活力。
[0035] 建立黑色素瘤腫瘤模型，陽(yáng)性對(duì)照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑，實(shí)驗(yàn) 組多肽（上海生工合成）設(shè)3個(gè)劑量：0.5、1.0、2.0mg/Kg。21天后，觀察小鼠存活數(shù)量，計(jì) 算存活率。結(jié)果顯示，Jaggedl激動(dòng)劑多肽可有效地保護(hù)小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存率， 5、 10、20mg/Kg，及陽(yáng)性組生存率達(dá)到依次為96%，89. 0%，85%和56%。說(shuō)明Jaggedl激動(dòng) 劑多肽具有良好的安全性。
[0036] 實(shí)施例4含有Jaggedl激動(dòng)劑多肽的ELISA試劑盒檢測(cè)
[0037] 酶連免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA)試劑盒包括如下試劑：
[0038] (1)包被液：0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)。稱(chēng)取0? 75g碳酸鈉，1. 46g碳酸氫 鈉，加去離子水定容至500ml ;
[0039] (2)PBS緩沖液：0? 02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7. 4)。稱(chēng)取0? 2g磷酸二氫鉀，2. 90g 磷酸氫二鈉，8g氯化鈉，加去離子水定容到1000ml ;
[0040] (3)抗體稀釋液：0? 02mol/LPBS (pH7. 4)和 0? 2% BSA。稱(chēng)取 0? 2gBSA 加入配好的 0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液溶解定量至100ml ;
[0041] (4)封閉液：0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)和2. 0% BSA。2. OgBSA加配好的 0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液溶解定量至100ml ;
[0042] (5)洗滌液：0?02mol/LPBS(pH7. 4)和0?05 % Tween-20。將 50ulTween-20 溶入 100ml0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液中，震蕩混勻；
[0043] (6)底物液：可溶性單組份TMB底物溶液；
[0044] (7)終止液：2mol/L硫酸溶液。10ml98%濃硫酸加入60ml雙蒸水中，定容至 100ml，室溫保存；
[0045] (8) Jaggedl 激動(dòng)劑多肽
[0046] (9) Notch抗體（一抗）由上海生工合成。
[0047] (10)二抗（山羊抗小鼠IgG)購(gòu)自艾美捷科技有限公司
[0048] 使用方法：
[0049] 1、血清樣本制備：取3只荷瘤裸鼠，進(jìn)行眼眶取血，每只200 yL，迅速離心 12000rpm 3min，取上清，按體積比 1 :2 加 PBS，80 °C 水浴 30min，12000rpm 3min 取上 清，-20°C凍存?zhèn)溆?br>[0050] 2、Notch抗體為包被抗體，將Notch抗體溶于包被稀釋液中，濃度為100 y g/mL。 96孔酶標(biāo)板每孔加入100 y L，4°C包被過(guò)夜。棄去包被液，加入封閉液200 y L，37°C封閉lh。 棄去封閉液，分別加入樣品稀釋液稀釋的血清樣本100 yL(稀釋比1 :50)和Jaggedl激動(dòng) 劑多肽100 U L (10 y g/ml)及上述血清樣本50 y L和Jaggedl激動(dòng)劑多肽50 y L的混合物， 分成3組，37°C孵育lh。棄去血清，PBST和自來(lái)水間隔洗滌三次。洗滌后，每孔加入樣品稀 釋液稀釋酶標(biāo)二抗100 U L(稀釋比1 :10000)，37°C孵育lh。棄去二抗，洗滌。洗滌后，每孔 加入lOOyL底物液（50yL底物A，50yL底物B)，37°C反應(yīng)30min后，加入50yL 2M H2S04 終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)定每孔的光密度值0D45tol。結(jié)果Jaggedl激動(dòng)劑多肽 可以和Notch抗體結(jié)合，并可以競(jìng)爭(zhēng)血清中Notch蛋白，故說(shuō)明Jaggedl激動(dòng)劑多肽用競(jìng)爭(zhēng) 法檢測(cè)Notch，實(shí)現(xiàn)腫瘤預(yù)測(cè)，
[0051]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. Jaggedl激動(dòng)劑多肽，其特征在于其序列為NSFTDDCRRSDGHCRRELDPM。
2. 如權(quán)利要求1所述的Jaggedl激動(dòng)劑多肽在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求1所述的Jaggedl激動(dòng)劑多肽在制備治療黑色素瘤藥物中的應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求1所述的Jaggedl激動(dòng)劑多肽在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
5. -種檢測(cè)腫瘤的試劑盒，其含有權(quán)利要求1所述的Jaggedl激動(dòng)劑多肽。
6. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于還有 (1) 包被液：p!19. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液； (2)PBS緩沖液：pH7. 4的0? 02mol/L磷酸鹽緩沖液； (3) 抗體稀釋液：pH7. 4 的 0? 02mol/LPBS和 0? 2%BSA; (4) 封閉液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液和2. 0%BSA (5) 洗滌液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 05%Tween-20 ; (6) 底物液：可溶性單組份TMB底物溶液； (7) 終止液：2mol/L硫酸溶液； (8) Notch抗體； (9) 山羊抗小鼠IgG。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明關(guān)于Jaggedl激動(dòng)劑多肽及其應(yīng)用，涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及具有促進(jìn)Jaggedl與Notch的結(jié)合，治療惡性腫瘤的多肽。其序列為NSFTDDCRRSDGHCRRELDPM，是全新的序列，它們可以在體外抑制黑色素瘤細(xì)胞和肝癌干細(xì)胞的增殖，并在體內(nèi)試驗(yàn)中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開(kāi)發(fā)價(jià)值。
【IPC分類(lèi)】G01N33-68, C07K14-00, A61P35-00, A61K38-16, G01N33-574
【公開(kāi)號(hào)】CN104761622
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510149303
【發(fā)明人】羅瑞雪
【申請(qǐng)人】蘇州普羅達(dá)生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2015年3月31日