專利名稱：一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白及其生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子藥物學(xué)，生物技術(shù)和疾病防治，具體地說是采用中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)生產(chǎn)一種抗腫瘤新生血管形成的長(zhǎng)效重組蛋白，該蛋白為人Kallistatin(Kal)與人絨毛膜促性腺激素(hCG) β鏈的羧基末端肽(CTP)的融合蛋白(LA-Kal，long acting Kal)。融合蛋白LA-Kal較野生型Kal的體內(nèi)半衰期顯著增加，提高了抗腫瘤療效。
背景技術(shù)：
目前惡性腫瘤已經(jīng)成為發(fā)達(dá)國家和地區(qū)居于前列的致死性疾病。雖然外科手術(shù)， 放療和化療作為的常規(guī)治療手段仍在不斷發(fā)展，但由于其固有的局限，其療效已基本達(dá)到極限，因而迫切需要開發(fā)新的治療手段。自從R)lkman于1971年首次闡述腫瘤與新生血管依賴關(guān)系，并提出有關(guān)分子機(jī)制假說以來，以腫瘤新生血管為靶點(diǎn)的抗血管生成治療成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。Kal是一新型的具有抗血管生成作用的內(nèi)源性蛋白(Miao RQ, et al. Blood 2002 ； 100 :3對(duì)5-52)，其抗血管生成作用與內(nèi)皮抑素(endostatin)類似。內(nèi)皮抑素通過其肝素結(jié)合活性介導(dǎo)其對(duì)血管生成的抑制作用。各種生長(zhǎng)因子必須結(jié)合細(xì)胞表面兩種不同的受體， 才能引發(fā)一個(gè)信號(hào)。硫酸肝素糖蛋白(HSPGs)是最普通的低吸附受體，在調(diào)節(jié)多種生長(zhǎng)因子的作用時(shí)，發(fā)揮關(guān)鍵作用。許多生長(zhǎng)因子，如VEGF和bFGF是肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，VEGF和 bFGF與內(nèi)皮細(xì)胞表面的HSPGs結(jié)合，可以調(diào)節(jié)它們與專屬受體的結(jié)合。Kal是肝素結(jié)合蛋白，可以與VEGF和bFGF，以及其它含有肝素結(jié)合區(qū)的生長(zhǎng)因子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HSPGs，因此阻斷了這些生長(zhǎng)因子與HSPGs的結(jié)合，阻斷了這些生長(zhǎng)因子引發(fā)的血管生成事件。另外，Kal還是絲氨酸蛋白酶抑制劑的一員，最初被認(rèn)為是組織胰激肽原酶結(jié)合蛋白。越來越多的證據(jù)顯示，組織胰激肽原酶在腫瘤相關(guān)事件中非常重要，其中包括腫瘤生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，血管生成，侵入和轉(zhuǎn)移等。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在Kal的作用下，HCC中作為細(xì)胞增殖的標(biāo)志Ki-67染色降低， 顯示Kal與組織胰激肽原酶的結(jié)合可能與HCC細(xì)胞增殖抑制有關(guān)。Kal可以從不同途徑抑制血管生成，因此是抗腫瘤血管生成治療的良好候選者。已進(jìn)行的Kal的抗腫瘤作用研究主要采用基因治療手段，而基因治療一般需要采用病毒載體，其長(zhǎng)期應(yīng)用的風(fēng)險(xiǎn)是各國衛(wèi)生部門重點(diǎn)關(guān)注的問題，目前尚不明朗，很難在短期內(nèi)實(shí)現(xiàn)上市并廣泛應(yīng)用于腫瘤病人。而多種重組蛋白藥物已廣泛地應(yīng)用于臨床，相關(guān)技術(shù)比較成熟，是開發(fā)基因重組藥物最常規(guī)的手段。Kal的發(fā)現(xiàn)者Chao等曾采用大腸桿菌表達(dá)Kal重組蛋白，但表達(dá)量很低。本課題組也曾用大腸桿菌表達(dá)人Kal蛋白，表達(dá)水平也極低，且雜蛋白多難以純化。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年來建立起來的一種真核表達(dá)系統(tǒng)，已成功地表達(dá)了大量的重組蛋白，它既具有原核表達(dá)系統(tǒng)繁殖快、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又具有原核表達(dá)系統(tǒng)所沒有的優(yōu)勢(shì)如能對(duì)表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行正確加工、折疊及適度糖基化，分泌表達(dá)的雜蛋白少，易于分離純化等，因此越來越廣泛地用于重組蛋白的表達(dá)。本發(fā)明人曾利用畢赤酵母表達(dá)人Kal蛋白(刁勇，專利申請(qǐng)?zhí)?0091(^632^0)。但野生型Kal在體內(nèi)較短的半衰期(1-2小時(shí))，極大地限制了其藥效的發(fā)揮，在臨床應(yīng)用時(shí)必須連續(xù)反復(fù)注射給藥，病人依從性較差。因此，開發(fā)長(zhǎng)效蛋白藥物成為研究人員努力的方向。由于蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)會(huì)被快速清除，所以患者必須頻繁用藥才能保持藥物濃度在治療窗內(nèi)，限制了其治療效果。因此，延長(zhǎng)蛋白質(zhì)藥物體內(nèi)的半衰期已成為近年來的研究熱點(diǎn)?？商岣叩鞍踪|(zhì)藥物半衰期的技術(shù)包括化學(xué)修飾、蛋白質(zhì)融合、微囊化、糖基化、抗蛋白酶突變體等，許多長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物已經(jīng)研制成功并應(yīng)用于臨床治療。融合蛋白是將兩個(gè)或多個(gè)基因的編碼區(qū)首尾連接，由同一調(diào)控序列控制構(gòu)成的基因表達(dá)產(chǎn)物。在分子水平，這個(gè)技術(shù)具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單靈活的特性，因?yàn)闃?gòu)建突變體時(shí)不需要插入連接序列而直接在C端或N端融合。因此，這種技術(shù)能廣泛地應(yīng)用于構(gòu)建生物活性分子， 而且它的應(yīng)用性不會(huì)因?yàn)樯锓肿拥拇笮』蚧钚远艿较拗?。常選用半衰期較長(zhǎng)，分子量較大的分子作為載體構(gòu)建融合蛋白，如人血清白蛋白(HSA)或免疫球蛋白(IgG)的Fc片段應(yīng)用最為廣泛。蛋白質(zhì)表面的糖鏈?zhǔn)怯绊懙鞍左w內(nèi)半衰期的重要因素。糖基化形式的蛋白質(zhì)一方面增加了表面?zhèn)孺?，阻礙蛋白酶對(duì)蛋白藥物的降解作用，提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，另一方面使蛋白質(zhì)藥物分子量增大，減少腎小球?yàn)V過。如促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一個(gè)高度糖基化的蛋白，它含有3個(gè)N-連接和1個(gè)0-連接糖鏈。人EPO的0-連接糖基對(duì)于體內(nèi)外活性及清除速率作用無關(guān)，而N-連接糖基化不完全的人EPO體外活性正常，但體內(nèi)活性則降低到體外活性的1/500，且體內(nèi)清除率也明顯加快。因此，N-連接糖基化對(duì)蛋白質(zhì)藥物的修飾有重要作用。重組人EPO突變體(Amgen公司的Aranesp)即通過增加了兩個(gè)N-連接糖基，使半衰期延長(zhǎng)3倍以上，現(xiàn)已經(jīng)研制成功并上市。病人用藥頻率由一周3次減少到每周1次。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)野生型Kal現(xiàn)有體內(nèi)半衰期短，影響藥效發(fā)揮的問題和缺陷，本發(fā)明對(duì)野生型Kal進(jìn)行改造，采用蛋白融合和增加糖基化兩種手段，利用真核細(xì)胞CHO進(jìn)行表達(dá)和生產(chǎn)，得到了可以高效表達(dá)LA-Kal的分泌型表達(dá)細(xì)胞株，并建立了可以用于工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵工藝和純化工藝。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白，該融合蛋白含有成熟人 kallistatin的全部序列，以及人絨毛膜促性腺激素β鏈(hCGi3)的羧基末端肽(CTP)。所述的人絨毛膜促性腺激素β鏈(hCGi3)的羧基末端肽(CTP)長(zhǎng)度為沈-31個(gè)
氨基酸。一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白的生產(chǎn)工藝，采用中國倉鼠卵巢細(xì)胞 (CHO)表達(dá)，懸浮培養(yǎng)法生產(chǎn)得到其分泌的上清液經(jīng)柱層析工藝分離純化，得到純度大于 98%的所述的融合蛋白。所述的柱層析工藝分離純化步驟依次包括經(jīng)硫酸銨沉淀，苯基柱疏水層析，分子篩柱脫鹽，肝素親和層析后，除菌過濾得到融合蛋白。所述的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)基為含5mmol/L谷氨酰胺、 0. 1 % (ff/V) Pluronic F-68 (購于Sigma公司)及25 μ g/mL硫酸葡聚糖的SFM-CHO無血清培養(yǎng)基(購于Hyclone公司)，其中添加400mg/L的胰島素(購于Sigma公司)，6mg/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白(購于Sigma公司)，100mg/L的丁酸鈉，培養(yǎng)溫度為34°C。
本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明采用的融合蛋白片段是來自人絨毛膜促性腺激素 (hCG) β鏈的羧基末端肽(CTP)，長(zhǎng)度不超過30個(gè)氨基酸。因CTP本身來自人體天然蛋白， 不會(huì)引起免疫反應(yīng)。一般情況下，蛋白分子量的增加會(huì)降低表達(dá)效率，但令人意外的發(fā)現(xiàn)是，與野生型Kal比較，在C端引入CTP后，表達(dá)效率增加了 100%以上。N-連接糖基需要固定的氨基酸序列，即Asn-X-Thr/Ser序列，糖鏈與天冬氨酸 (Asn)的側(cè)鏈相連接，X為除脯氨酸外的任何氨基酸。0-連接糖基一般發(fā)生于絲氨酸或蘇氨酸的側(cè)鏈，目前尚未發(fā)現(xiàn)0-連接糖基的固定序列。引入N-連接糖基需要在蛋白序列內(nèi)突變產(chǎn)生Asn-X-Thr/Ser序列，常常因破壞了原氨基酸序列而引起活性或免疫源性的變化。很有意思的是，CTP本身即含有4個(gè)0-連接糖基化位點(diǎn)，與Kal融合后即可以自然增加糖基化程度。本發(fā)明采用CHO細(xì)胞高水平分泌表達(dá)LA-Kal蛋白。由于分泌蛋白水平高，下游純化非常方便，經(jīng)兩步層析純度即可達(dá)到98%以上，非常便于工藝化生產(chǎn)。


圖1是本發(fā)明LA-Kal融合蛋白的構(gòu)建圖；將人Kal cDNA序列與hCG β -CTP序列(羧基端28肽對(duì)應(yīng)的序列)連接在一起， 在5’端引入Hind III酶切位點(diǎn)，在3’端引入EcoR I酶切位點(diǎn)。圖2是本發(fā)明實(shí)施例PCR方法檢測(cè)傳代細(xì)胞株CHO-Kal和CHO-LA-Kal中Kal基因圖；M:DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 陰性對(duì)照；2 :CH0_Kal ;3 :CH0-LA_Kal (31) ;4 CHO-LA-Kal (28) ；5 =CHO-LA-Kal (26) ；6 陽性對(duì)照；圖3是本發(fā)明實(shí)施例RT-PCR方法檢測(cè)傳代細(xì)胞株CHO-Kal和CHO-LA-Kal的Kal 表達(dá)情況圖；M:DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 陰性對(duì)照；2 :CH0_Kal ;3 :CH0-LA_Kal (31) ;4 CHO-LA-Kal(28) ；5 =CHO-LA-Kal(26)；圖4是本發(fā)明實(shí)施例Wfestern Blot方法測(cè)定細(xì)胞株CHO-Kal和CHO-LA-Kal的 Kal表達(dá)情況圖；1 =CHO-Kal ；2 =CHO-LA-Kal (28) ；3 陰性對(duì)照；圖5是本發(fā)明實(shí)施例肝素柱分離純化LA-Kal圖；1 肝素柱上樣穿透峰；2 0. lmol/L NaCl洗滌峰；3 :0. 3mol/LNaCl洗滌峰；4 0. 5mol/L NaCl 洗脫峰；M :mark ；圖6是本發(fā)明實(shí)施例腫瘤生長(zhǎng)曲線圖。
具體實(shí)施例方式1、表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)人Kal cDNA 的 NCBI 參考序列(Reference Sequence :NM_006215. 2)，以及 hCG^鏈的NCBI參考序列(Reference kquence :NM_033378. 1)，委托大連寶生物公司全合成人Kal cDNA與hCG β -CTP的融合序列(圖1，見序列表SEQ ID No. 1)。hCG β -CTP為 hCGi3鏈C端第118-145位氨基酸序列。在融合序列的5’和3’端分別引入Hind III和EcoR I酶切位點(diǎn)，以便構(gòu)建真核表達(dá)載體。將含有Kal全長(zhǎng)cDNA序列與hCGP -CTP序列的融合序列進(jìn)行HindIII和EcoRI 雙酶切，連接于hvitrogen公司生產(chǎn)的pcDNA3. 1質(zhì)粒的HindIII和EcoRI雙酶切位點(diǎn)，得到 pcDNA3. I-LA-Kal (28)表達(dá)質(zhì)粒。同法構(gòu)建pcDNA3. I-LA-Kal (31)表達(dá)質(zhì)粒，區(qū)別在于hCG-CTP為hCG鏈C端第 115-145位氨基酸序列。同法構(gòu)建pcDNA3. I-LA-Kal (26)表達(dá)質(zhì)粒，區(qū)別在于hCG-CTP為hCG鏈C端第 130-145位氨基酸序列。同法構(gòu)建僅含有Kal全長(zhǎng)cDNA序列的pcDNA3. I-Kal表達(dá)質(zhì)粒，區(qū)別在于不含有 hCG-CTP。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，經(jīng)菌落PCR、酶切等方法篩選出符合要求的陽性克隆，委托大連寶生物公司進(jìn)行測(cè)序。2CH0細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定高效表達(dá)株的篩選分別將含有Kal基因的質(zhì)粒pcDNA3. I-Kal和pcDNA3. I-LA-Kal線形化，按 hvitrogen的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofect AMINE 2000的工作手冊(cè)要求轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CHO-Kl細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染不含任何Kal基因的空載體作為對(duì)照。用0. 8-lmg/ml的G418 進(jìn)行篩選；挑取單克隆擴(kuò)增和傳代，G418(購于Sigma公司)維持量為0. 5mg/ml，最終形成可以穩(wěn)定表達(dá)Kal及LA-Kal的傳代細(xì)胞株CHO-Kal和CHO-LA-Kal。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在篩選的傳代細(xì)胞系中分別擴(kuò)增到與Kal單個(gè)基因大小相符的片段(如圖2所示)，表明Kal基因已經(jīng)整合到CHO細(xì)胞的基因組上；同時(shí)RT-PCR結(jié)果顯示，在篩選的傳代細(xì)胞系中分別擴(kuò)增到與Kal單個(gè)基因大小相符的片段(如圖3所示)， 表明整合在CHO細(xì)胞基因組上的Kal基因可以轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在細(xì)胞傳代至20代后，均能檢測(cè)到相應(yīng)的Kal基因；將細(xì)胞凍存后復(fù)蘇，PCR和RT-PCR同樣能檢測(cè)到相應(yīng)的基因，表明凍存和復(fù)蘇過程中沒有造成外源基因的丟失。篩選得到的細(xì)胞株在含有G418的培養(yǎng)基里正常傳代，取培養(yǎng)上清冷凍干燥獲得濃縮的細(xì)胞總蛋白。Western Blot方法測(cè)定Kal的表達(dá)(如圖4所示)，可見細(xì)胞株CHO-Kal 和CHO-LA-Kal均有Kal蛋白的表達(dá)。因LA-Kal中，hCG β-CTP序列連接于Kal的C末端，不影響Kal的抗原抗體結(jié)合， 所以可以采用市售ELISA試劑盒進(jìn)行含量測(cè)定。在細(xì)胞密度相同的情況下，LA-Kal的細(xì)胞上清內(nèi)表達(dá)水平是Kal的2倍左右，表明CTP序列可能有助于重組蛋白的表達(dá)與分泌。3懸浮培養(yǎng)法生產(chǎn)Kal及LA-Kal將細(xì)胞株CHO-Kal和CHO-LA-Kal在IOL生物反應(yīng)器中懸浮培養(yǎng)，接種密度 2.5父105細(xì)胞/1111，培養(yǎng)基為含511111101/1谷氨酰胺、0.1% (ff/V) Pluronic F-68 及 25 μ g/mL 硫酸葡聚糖的SFM-CHO無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)3天后ELISA方法測(cè)定Kal的表達(dá)水平?；跍囟群团囵B(yǎng)基中特定添加劑對(duì)CHO細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響，我們采用L9 (34)正交試驗(yàn)，考察溫度(A)、胰島素(B)、丁酸鈉(C)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(D)四種主要因素對(duì)目的產(chǎn)物表達(dá)的影響。按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表1，表1為正交試驗(yàn)因素水平表。配制不同的培養(yǎng)基，接種 CHO-LA-Kal后在IOL生物反應(yīng)器中培養(yǎng)3天，測(cè)定LA-Kal的表達(dá)水平，結(jié)果見表2，表2為正交分析試驗(yàn)結(jié)果及極差分析表。結(jié)果表明4個(gè)因素對(duì)細(xì)胞表達(dá)水平的影響順序依次是B>0>々>(，即胰島素>轉(zhuǎn)鐵蛋白>溫度>丁酸鈉。最佳培養(yǎng)條件為在含5mmol/L谷氨酰胺、0. 1 % (ff/V) Pluronic F-68及25 μ g/mL硫酸葡聚糖的SFM-CHO無血清培養(yǎng)基中，添加400mg/L的胰島素，6mg/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白，100mg/L的丁酸鈉，培養(yǎng)溫度為34°C。4 純化Kal及LA-Kal的純化過程包括發(fā)酵上清液的硫酸銨預(yù)處理和連續(xù)的三步層析。CHO上清液用1.5mol/L硫酸銨沉淀，離心。棄沉淀，預(yù)處理后上清經(jīng)Phenyl Superose介質(zhì)(購于GE公司)疏水層析，平衡緩沖液為1. 5mol/L硫酸銨，20mM/L Tis-HCl (PH 6. 0)；然后采用 1. 2，1. O 和 0. 3mol/L 硫酸銨，20mmol/L Tris-HCl (pH 6. 0)梯度洗脫；用G25分子篩柱脫鹽，平衡緩沖液和洗脫液均為20mmol/L Tris-HCl (pH 6.0)；洗脫液透析后經(jīng)過肝素親和層析，用20mmol/L Tris-HCl (pH 6. 0),0. 1-0. 5mol/L NaCl溶液梯度洗脫；除菌過濾得到LA-Kal蛋白原液。肝素柱純化各步驟產(chǎn)物的SDS-PAGE見圖5。5體外對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響本實(shí)驗(yàn)部分所用LA-Kal的CTP長(zhǎng)度為28個(gè)氨基酸。5.1細(xì)胞增殖抑制取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞，按每孔4X IO3個(gè)接種于96孔板，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，分別作用24、48、7濁。實(shí)驗(yàn)組每孔加含重組Kal終濃度分別為5、10、20、40 μ g/和80 μ mol/L 的15%新生牛血清DMEM(購于Hyclone公司)，對(duì)照組加等體積的15%新生牛血清DMEM， 并設(shè)空白對(duì)照。將培養(yǎng)板移入37°C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，每隔24h取一塊96孔板， 每孔加入20 μ 1 MTT (購于Sigma公司)，37°C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育4h，小心吸除培養(yǎng)液，加入150 μ 1 DMSO (購于Sigma公司)，振蕩IOmin (1000r/min)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定 492nm吸光值(OD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果Kal及LA-Kal的體外細(xì)胞增殖抑制活性無明顯差異。5. 2細(xì)胞遷移抑制取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以5 X IO4/孔接種于 96孔板中，細(xì)胞貼壁(約90%融合生長(zhǎng))后，以移液器槍頭在孔的底部劃“一”字形劃痕， 以磷酸鹽緩沖液(PBQ沖洗，實(shí)驗(yàn)組加含不同濃度重組Kal(10、20、40ymOl/L)的無血清 DMEM，對(duì)照組只加無血清DMEM，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，即刻攝像記錄，于37°C、5% C02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后分別攝像記錄，用“電子尺”軟件分別測(cè)量每組0、24h劃痕兩側(cè)細(xì)胞間的距離，用Oh劃痕邊緣的距離減去24h遷移邊緣的距離，取3次測(cè)量平均值表示遷移距離。 遷移速度=遷移距離+遷移時(shí)間，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。結(jié)果Kal及LA-Kal的體外抑制細(xì)胞遷移的活性無明顯差異。5. 3體外管道形成抑制在已包被Matrigel的96孔板中，每孔添加200 μ 1含1 X IO4個(gè)HUVEC細(xì)胞的懸液 (用無血清DMEM配制)。實(shí)驗(yàn)組加含不同濃度重組Kal(10、20、40ymol/L)的無血清DMEM， 對(duì)照組只加無血清DMEM，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。37°C、5 % CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每隔4h觀察不同處理組之間的細(xì)胞管狀排列情況及完整程度，顯微鏡下隨機(jī)取上、下、左、右、中心5個(gè)視野，計(jì)數(shù)管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量，取每個(gè)視野的平均值。結(jié)果Kal及LA-Kal的體外抑制細(xì)胞管道形成的活性無明顯差異。
6體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)SD大鼠靜脈注射重組Kal，劑量為lmmol/kg。在規(guī)定時(shí)間經(jīng)靜脈取血，ELISA方法測(cè)定血藥濃度。根據(jù)血藥濃度經(jīng)時(shí)曲線計(jì)算生物半衰期。結(jié)果Kal在大鼠體內(nèi)的半衰期為1. 5士0. 3小時(shí)，而LA-Kal (CTP長(zhǎng)度為31個(gè)氨基酸)則為6. 3士 1. 5小時(shí)，LA-Kal (CTP長(zhǎng)度為觀個(gè)氨基酸)則為6. 5士 1. 6小時(shí)，LA-Kal (CTP 長(zhǎng)度為26個(gè)氨基酸)則為5. 9士 1. 2小時(shí)，均較野生型Kal有明顯延長(zhǎng)。6體內(nèi)抑瘤作用取7周齡雄性BALB/c裸鼠，隨機(jī)分成3組，每組10只，麻醉后背側(cè)部分別接種 A549細(xì)胞，接種量為2 X IO6個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞懸浮于100 μ LPBS中。接種7d后，每日經(jīng)皮下注射重組Kal，劑量為0. lmmol/kg,以生理鹽水為對(duì)照。定期觀察并測(cè)定腫瘤體積，腫瘤體積 =0. 52XaXb2, a和b分別為腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑。裸鼠皮下接種A549細(xì)胞7d時(shí)，腫瘤大小約為50mm3。腫瘤體積經(jīng)時(shí)曲線見圖6。 給藥組腫瘤生長(zhǎng)速率顯著小于對(duì)照組。LA-Kal組腫瘤生長(zhǎng)速率明顯小于Kal組，自25d起兩組腫瘤體積大小有顯著性差異(P < 0. 05)。說明生物半衰期的延長(zhǎng)對(duì)提高Kal的體內(nèi)抗腫瘤活性有重要作用。表 權(quán)利要求
1.一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白，其特征在于該融合蛋白含有成熟人 kallistatin的全部序列，以及人絨毛膜促性腺激素β鏈的羧基末端肽)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白，其特征在于所述的人絨毛膜促性腺激素β鏈的羧基末端肽長(zhǎng)度為沈-31個(gè)氨基酸。
3.一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白的生產(chǎn)工藝，其特征在于采用中國倉鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)，懸浮培養(yǎng)法生產(chǎn)得到其分泌的上清液經(jīng)柱層析工藝分離純化，得到純度大于98%的權(quán)利要求1所述的融合蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的柱層析工藝分離純化步驟依次包括經(jīng)硫酸銨沉淀，苯基柱疏水層析，分子篩柱脫鹽，肝素親和層析后，除菌過濾得到融合蛋白。
5.如權(quán)利要求3所述的一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的中國倉鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)基為含5mmol/L谷氨酰胺、0. 1% (W/V) Pluronic F-68及25 μ g/mL硫酸葡聚糖的SFM-CHO無血清培養(yǎng)基，其中添加400mg/L的胰島素，6mg/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白，100mg/L的丁酸鈉，培養(yǎng)溫度為34°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白，該融合蛋白含有成熟人kallistatin的全部序列，以及人絨毛膜促性腺激素β鏈(hCGβ)的羧基末端肽(CTP)；及其生產(chǎn)工藝。本發(fā)明采用CHO細(xì)胞高水平分泌表達(dá)LA-Kal蛋白。由于分泌蛋白水平高，下游純化非常方便，經(jīng)兩步層析純度即可達(dá)到98％以上，非常便于工藝化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/22GK102358755SQ20111032239
公開日2012年2月22日 申請(qǐng)日期2011年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月20日
發(fā)明者刁勇, 黃曉平 申請(qǐng)人:華僑大學(xué)