專利名稱：抑制腫瘤生長的融合蛋白HGFα-Fc及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蛋白質工程領域，具體涉及編碼包含HGF片段和Fc片段的融合蛋白及 其編碼DNA、以及該融合蛋白的制藥用途。
背景技術：
腫瘤是嚴重危害人類健康的一類疾病。大量研究已經(jīng)證實，許多生長因子與腫瘤 細胞表面的生長因子受體結合可以誘導腫瘤細胞的惡性增殖。體外細胞模型、動物模型和 人體臨床試驗都表明，阻斷該類生長因子與其受體的結合可以有效地抑制腫瘤細胞的生長 或誘發(fā)腫瘤細胞的死亡，從而達到抑制腫瘤生長的效果。因此，生長因子受體抑制劑是目前 抗腫瘤新藥的研究熱點，目前已經(jīng)有多個該類生物新藥獲得了美國FDA的上市批準，同時 還有數(shù)十種正處于各期臨床試驗階段。腫瘤的生長因子信號通路是一類多種活性生物因子參與的復雜調控過程，其中的 一個關鍵環(huán)節(jié)是腫瘤細胞表面的受體與多種生長因子相結合從而被激活，然后經(jīng)細胞內(nèi)酪 氨酸磷酸化信號轉導途徑控制腫瘤細胞的增殖，從而促進腫瘤的生長。在多種生長因子中， 肝細胞生長因子Ofepatocyte growth factor，簡稱為HGF)是控制腫瘤細胞生長的一種重 要因子，其受體肝細胞生長因子受體Ofepatocyte growth factor rec印tor，簡稱為HGFR， 又被稱為C-Met)在多種腫瘤細胞表面過量表達，因此導致此類腫瘤細胞對HGF的敏感性增 強。HGF與腫瘤細胞表面的HGFR結合可以引發(fā)HGFR 二聚化，從而導致HGFR細胞內(nèi)部分的 酪氨酸激酶位點活化，激活下游多種信號通路，最終促進腫瘤細胞的生長。目前許多研究已 經(jīng)證實，HGF依賴的HGFR活化與乳腺癌、肺癌、惡性膠質瘤、骨肉瘤等多種腫瘤的發(fā)生密切 相關，阻斷HGF/HGFR的結合可以有效抑制此類腫瘤的生長，因此，HGF/HGFR是治療此類惡 性腫瘤的一個重要的分子靶點。HGF是在體內(nèi)分布廣泛的一種生長因子，除主要來源于間質細胞的分泌外，還來自 于某些腫瘤細胞(如乳腺癌和惡性膠質瘤)的自分泌。HGF前體是由728個氨基酸組成的 單鏈多肽，成熟HGF是由α鏈和β鏈通過二硫鍵組成的異二聚體。α鏈由463個氨基酸 構成，其N端含有一個PAN結構域，C端含有四個連續(xù)的環(huán)餅(Kringle domain)結構域。β 鏈由234個氨基酸構成，其中含有一個P印tidase Sl結構域。已有研究證實HGF單獨的α 鏈依然保留了與HGFR結合的能力，并且可以與天然HGF競爭結合HGFR。由于缺乏β鏈， HGFa與HGFR的結合并不引發(fā)HGFR細胞內(nèi)部分的酪氨酸磷酸化，因此HGFa片段能夠起到 阻斷HGF/HGFR信號傳遞的作用，從而達到腫瘤細胞生長的效果。不僅如此，最近還有研究 表明，HGFa包含的環(huán)餅結構域也能夠誘導腫瘤和血管內(nèi)皮細胞凋亡，這種凋亡是通過抑制 EGF、VEGF和bFGF與其受體結合，從而抑制這些受體的磷酸化而發(fā)揮作用的。盡管HGF α能夠阻斷生長因子類受體信號通路的活化，抑制腫瘤細胞的生長，但 是其對腫瘤細胞的殺傷作用仍然不夠強大，而且在血漿中的半衰期不理想，因此十分有必 要進一步改造以提高其抗腫瘤效應。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是克服是HGF蛋白片段生物活性和穩(wěn)定性不好的缺陷。 解決該技術問題的技術方案是提供一種優(yōu)化的包含截斷的HGF片段和免疫球蛋白Fc的融 合蛋白，其在體內(nèi)外都具有良好的生物活性和穩(wěn)定性，能夠阻斷HGF/HGFR信號傳遞，并且 能夠殺傷腫瘤細胞，從而抑制腫瘤的生長。該抗腫瘤的融合蛋白質由來自人肝細胞生長因子HGF的α鏈與人免疫球蛋白Fc 段構成，人肝細胞生長因子HGF的α鏈在氮端，人免疫球蛋白Fc段在碳端，HGF的α鏈和 Fc之間由一條連接肽相連。其中，上述融合蛋白質中所述人肝細胞生長因子HGF的α鏈包括PAN結構域和四 個連續(xù)的環(huán)餅結構域，PAN結構域在氮端。其中，上述融合蛋白質中所述人肝細胞生長因子HGF的α鏈氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。其中，上述融合蛋白質中所述人免疫球蛋白為IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM或 IgA。其中，上述融合蛋白質中所述人免疫球蛋白為IgGl，IgGl的Fc段的氨基酸序列如 序列表中SEQ ID NO. 4所述。其中，上述抗融合蛋白質中所述連接肽的氨基酸序列為GGGGSGGGGSGGGGS。進一步的，上述融合蛋白質，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 8所示；或者其氨基酸序列為在SEQ ID NO. 8的基礎上缺失、替換或增加一個或幾個氨基酸后 所得的具有相同功能的融合蛋白質。本發(fā)明還提供了編碼上述的抗腫瘤的融合蛋白質的核苷酸序列。其中，上述核苷酸序列SEQ ID NO. 7所示。本發(fā)明還提供了含有編碼上述的抗腫瘤的融合蛋白質的核苷酸序列的重組載體。本發(fā)明也提供了含有編碼上述的抗腫瘤的融合蛋白質的核苷酸序列的重組載體 的宿主細胞。另外，本發(fā)明還提供了上述抗腫瘤的融合蛋白質、編碼上述的抗腫瘤的融合蛋白 質的核苷酸序列、含有編碼上述的抗腫瘤的融合蛋白質的核苷酸序列的重組載體、或者含 有上述重組載體的宿主細胞在制備抗腫瘤藥物中的應用。 本發(fā)明也提供了 一種抗腫瘤藥物組合物。該抗腫瘤藥物組合物由上述抗腫瘤的融 合蛋白質、編碼上述的抗腫瘤的融合蛋白質的核苷酸序列、含有編碼上述的抗腫瘤的融合 蛋白質的核苷酸序列的重組載體、或者含有上述重組載體的宿主細胞作為主要活性成分添 加藥學上可接受的輔助性成分制備而成的。進一步的，上述抗腫瘤藥物組合物還包括一種 或幾種其他的抗腫瘤藥物。本發(fā)明的抗腫瘤藥物組合物，組合物可以和其它治療方法一起治療腫瘤，所述其 它治療方法包括化學療法、放射療法、生物療法。本發(fā)明的有益效果在于設計并構建了一種優(yōu)化了的包含截斷型HGFa鏈片段即 HGFa、連接肽和人免疫球蛋白Fc的融合蛋白，使得HGFa和Fc之間具有足夠的柔韌性，保 證了正確的空間構象；更重要的是，此融合蛋白具有抑制HGF/HGFR信號轉導和發(fā)揮Fc免疫學效應的雙重作用，其功效得到了很大的提高。因此，這種融合蛋白與單純的截斷型HGF片 段或單純HGFa鏈片段加人免疫球蛋白Fc的融合蛋白相比，具有明顯更強的生物活性和血 漿半衰期，從而能夠更有效地抑制并殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤的發(fā)展。


圖1. HGF α -Fc融合蛋白的結構模式圖，為了方便表達，在其氨基端可連接一信號 肽。圖2. HGF α -Fc/pcDNA3. 1 (+)重組載體示意3.重組載體雙酶切鑒定。1，重組載體；2，載體經(jīng)Hindlll/Xhol雙酶切；M，分子 Marker圖4.免疫印跡檢測CHO細胞分泌表達HGF α -Fc融合蛋白。1，穩(wěn)定轉染的CHO細胞 培養(yǎng)上清；2 未轉染的CHO細胞培養(yǎng)上清。圖5.蛋白A親和層析純化HGFa-Fc融合蛋白(非還原SDS-PAGE)。Μ，蛋白 marker ；1和2，純化前；3和4，純化后。圖6.流式細胞術檢測HGF α -Fc融合蛋白對Α549肺癌細胞的結合效應。A，PBS ； B, HGF α -Fc(10ug/ml) ；C, HGF α -Fc(100ug/ml)1。圖7. HGF α -Fc融合蛋白對Α549肺癌細胞的體外抑制作用。圖8. HGFa-Fc融合蛋白的小鼠體內(nèi)抗腫瘤作用。
具體實施例方式以下實例對本發(fā)明所涉及的抗腫瘤融合蛋白(簡稱融合蛋白，也用HGF a -Fc融合 蛋白表示)的構建、試驗和應用作了詳細說明。但是本發(fā)明的內(nèi)容和用途并不僅限于實例 的范疇。本發(fā)明設計并構建了一種優(yōu)化了的包含截斷型HGFa鏈片段即HGFa、連接肽和 人免疫球蛋白Fc的融合蛋白，使得HGFa和Fc之間具有足夠的柔韌性，保證其正確的空間 構象；更重要的是，此融合蛋白具有抑制HGF/HGFR信號轉導和發(fā)揮Fc免疫學效應的雙重 作用。因此，這種融合蛋白與單純的截斷型HGF片段相比，具有更強的生物活性和血漿半衰 期，從而能夠更有效地抑制并殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤的發(fā)展。研究表明，天然成熟的HGF是由α鏈和β鏈組成的異二聚體，其中α鏈含有的 4個環(huán)餅結構對于HGF/HGFR的結合特別重要。HGF的β鏈含有P印tidase Sl結構域，對 于活化HGFR的細胞內(nèi)信號具有重要作用。單獨的β鏈由于缺乏環(huán)餅結構，失去了與HGFR 的結合能力。單獨的α鏈仍然可以與HGFR結合卻不活化HGFR，而且與天然的HGF存在競 爭結合HGFR的效應，因此HGF的α鏈是阻斷HGF/HGFR信號通路的優(yōu)選分子。然而，單獨 的HGFa鏈結構不穩(wěn)定，抗腫瘤的生物學效應也有待進一步提升。免疫球蛋白Fc段不但可 以延長融合蛋白的半衰期，而且還具有Fc免疫學效應，其作為融合分子來提高融合蛋白的 穩(wěn)定性和生物活性已經(jīng)被證實。HGF的α鏈和免疫球蛋白Fc段是兩個獨立的具有不同功 能的區(qū)域，均必須形成各自穩(wěn)定有活性的三維空間結構，特別是在兩個Fc段二聚化后，兩 個HGF α鏈必須保持其結構穩(wěn)定性和生物活性，從而保證其對HGFR的親和力。本發(fā)明提供 了一段柔性結構的連接肽，用以連接HGF α鏈和免疫球蛋白Fc段，使得HGF α和Fc都有足 夠的空間來形成各自穩(wěn)定的結構，避免了 HGFa可能與Fc之間可能形成的空間位阻，不僅
5保證了此優(yōu)化的HGF α -Fc融合蛋白對HGFR的親和力，還能夠使Fc發(fā)揮免疫學效應，從而 大大提高了融合蛋白的生物活性。由于天然HGF前體可以被蛋白酶在第494位氨基酸R (即HGF α碳末端最后一位氨 基酸)切割，而且天然HGF前體的第487位氨基酸C可與HGF β鏈形成二硫鍵，此類情況均 有可能影響本發(fā)明融合蛋白的結構和生物學功能，因此，本發(fā)明使用了天然HGF的32-477 位氨基酸，從而避免了上述情況的發(fā)生，保持了 HGFa-Fc融合蛋白的完整性，提高了其結 構的穩(wěn)定性。此融合蛋白的優(yōu)化設計也可以用于其它具有生物活性的片段與HGFa融合，以提 高融合蛋白的穩(wěn)定性和生物活性。所形成的融合蛋白一方面可以發(fā)揮HGF α對天然HGF的 競爭抑制效應和對腫瘤細胞的靶向作用，一方面可以發(fā)揮另一融合片段的生物活性，比如 腫瘤壞死因子α (TNF-α)、白介素2(IL_2)和CD3抗體等，以發(fā)揮融合蛋白對目標細胞的殺 傷作用。本發(fā)明描述的HGF α鏈和Fc的優(yōu)化融合蛋白是通過常規(guī)的基因重組技術所構建， 具體實驗步驟如《分子克隆》第三版(Jowph Sambrook，科學出版社)及類似的實驗手冊所 記載。下述實施例中所使用的HGFa鏈、Fc和連接肽分別是1.肝細胞生長因子HGF的α鏈，表示為HGF α，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所述。2.人免疫球蛋白Fc段來自于IgGl，表示為Fe，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4所述。3. HGFa和Fc之間的所用的連接肽，表示為(G4S) 3，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 6 所述。上述的融合蛋白及其編碼的DNA可以通過常規(guī)的基因重組技術獲得。所需編碼 HGFa 禾口 Fc 的 DNA 序列由 NCBI (National Center for Biotechnology Information)的 GenBank中獲得(GenBank編號NM_000601)，將編碼上述融合蛋白的DNA序列用PCR或直接 合成獲得后分別克隆到載體中，所用載體可以是分子生物學常用的質粒、病毒或其他載體。 構建載體時可以在編碼上述融合蛋白的DNA序列前端加上蛋白分泌信號肽序列，以保證重 組蛋白從細胞中分泌出來。載體序列中包括用于基因表達的啟動子、蛋白質翻譯起始和終 止信號、以及多聚腺苷酸(PolyA)序列。載體中還可含有抗生素抗性基因，以利于載體在宿 主細胞如細菌和真核細胞中的復制或表達。另外，載體中還可包括真核細胞選擇性基因，用 于穩(wěn)定轉染宿主細胞株的選擇。本發(fā)明優(yōu)化融合蛋白中的HGFa發(fā)揮作用的區(qū)段為PAN結構域和四個連續(xù)的環(huán)餅 結構域(Kringle domain) 0因此在包含上述結構域的情況下，HGFa兩端的氨基酸序列和 長度可以有一定的變化而不減弱其生物活性，它們都屬于本發(fā)明的范疇。本發(fā)明融合蛋白中的Fc來自人免疫球蛋白IgGl，也可以是亞型IgG2、IgG3、IgG4、 或者人免疫球蛋白IgE、IgM和IgA，該免疫球蛋白Fc片段可以為Fc全長或部分Fc序列， 如選自CH2片段、CH3片段或鉸鏈區(qū)，它們都屬于本發(fā)明的范疇。本發(fā)明融合蛋白連接肽的目的在于提供更好的柔韌性，以避免HGFa和Fc形成結 構上的空間位阻，因此連接肽氨基酸序列和長度均可以有一定的變化，它們都屬于本發(fā)明 的范疇。
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在完成含編碼上述融合蛋白的DNA序列的質粒構建以后，即可用該重組載體轉染 或轉化宿主細胞，表達相應的融合蛋白質。能夠用于表達這些融合蛋白的表達系統(tǒng)有多種， 可以是真核細胞，也可以是原核細胞，它們包括(但不限于)哺乳動物細胞、細菌、酵母、昆 蟲細胞等。由于本發(fā)明優(yōu)化融合蛋白的氨基酸序列中包含可糖基化的氨基酸，因此哺乳動 物細胞是表達該蛋白的優(yōu)選系統(tǒng)。可用于大規(guī)模表達蛋白質的哺乳動物細胞有多種，例如 CHO細胞、293細胞、NSO細胞、COS細胞、BHK細胞等，其它許多細胞也可以用于蛋白的表達， 因此都包括在本發(fā)明所能使用的細胞之列。含有編碼上述優(yōu)化融合蛋白基因的重組質?？?經(jīng)轉染進入宿主細胞，轉染細胞的方法有多種，其中包括(但不限于)電穿孔法、脂質體轉 染法和磷酸鈣轉染法等。一種較佳的蛋白表達方法是在已經(jīng)穩(wěn)定轉染的宿主細胞中對重組載體進行基因 擴增，以提高相應重組融合蛋白的表達量。例如，用含有新霉素(Neomycin)抗性基因的重 組載體穩(wěn)定轉染無新霉素抗性的宿主細胞后，可在細胞培養(yǎng)液中增加新霉素的濃度以擴增 重組載體在宿主細胞中的拷貝數(shù)量；又例如用含有二氫葉酸還原酶(DHFR)基因的重組載 體穩(wěn)定轉染缺乏DHFR的宿主細胞后，可在細胞培養(yǎng)液中增加氨甲喋呤(MTX)的濃度以擴增 重組載體在宿主細胞中的拷貝數(shù)量。哺乳動物細胞以外的其他表達系統(tǒng)，例如細菌、酵母、昆蟲細胞等也可以用于表達 本發(fā)明的優(yōu)化融合蛋白，它們也被包含本發(fā)明所能使用的宿主細胞之列。這些表達系統(tǒng)的 蛋白質產(chǎn)量比哺乳動物細胞的較高，但是所表達的蛋白質缺乏糖基化或形成的糖鏈結構與 哺乳動物細胞有所不同。本發(fā)明融合蛋白表達后，可用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)或其他方法測定細胞培 養(yǎng)液中的融合蛋白濃度。由于這些融合蛋白含有免疫球蛋白Fe，因此可以用蛋白A親和層 析法來純化所表達的融合蛋白。此外，與其它蛋白純化方法如離子交換層析等聯(lián)合使用，可 進一步純化本發(fā)明的融合蛋白。從重組體培養(yǎng)液中獲得相應的融合蛋白后，可以用細胞ELISA和流式細胞術來檢 測其對HGFR的結合活性，實驗結果表明，本發(fā)明的融合蛋白能夠結合HGFR陽性的細胞如 A549肺癌細胞，因此本發(fā)明所構建的優(yōu)化融合蛋白可以阻斷HGF/HGFR的結合，是一種針對 HGF/HGFR良好的蛋白抑制劑。應用純化方法獲得高純度的融合蛋白后，可利用體外細胞模型和體內(nèi)動物模型來 檢測其對腫瘤細胞的抑制效應。在體外實驗中，HGFR表達陽性的腫瘤細胞如A549肺癌細 胞、MDA-MB-435乳腺癌、Raji淋巴瘤細胞等都可以用MTT等方法來檢測優(yōu)化融合蛋白對這 些細胞的生長抑制作用。在體內(nèi)實驗中，上述HGFR陽性的腫瘤細胞可以用來構建小鼠腫瘤 模型，腫瘤模型可通過腹背側皮下、腹腔、尾靜脈等方法構建，以用于觀察融合蛋白的抗腫 瘤或抗轉移實驗。實施例一克隆編碼HGF α -Fc融合蛋白的DNA序列及構建重組載體本發(fā)明中編碼HGFa-Fc融合蛋白的基因片段可以通過經(jīng)典的分子生物技術獲 得，并且該基因序列可針對哺乳表達系統(tǒng)優(yōu)化，以便得到更佳的表達量。HGF α -Fc基因片段 與相應的表達載體重新連接可獲得重組載體，以適應哺乳細胞的表達和篩選。1、獲得編碼HGFa-Fc融合蛋白的基因片段本優(yōu)選實施例所構建的優(yōu)化融合蛋白的結構見附圖1。本發(fā)明的HGFa-Fc融合蛋白由HGFa和人免疫球蛋白IgGlFc融合而成，在HGFa與IgGlFc之間有一包含連續(xù)3個 (GGGGS)重復序列的連接肽，融合蛋白N端加上了白介素2(IL-2)的信號肽以保證其分泌到 哺乳細胞外。其中的HGFa片段是在其天然的cDNA序列基礎上，針對哺乳表達系統(tǒng)優(yōu)化過的序 列直接合成而得(SEQ ID NO. 1)其中的IgGlFc片段是其天然的cDNA序列基礎上，針對哺乳表達系統(tǒng)優(yōu)化過的序 列直接合成而得(SEQ ID NO. 3)其中連接肽的序列是通過基因合成而得(SEQ ID NO. 5)信號肽的的序列是基于IL-2的分泌肽序列通過基因合成而得(SEQ ID NO. 9)，在 構建載體時置于HGF a -Fc融合蛋白基因之前HGFa -Fc融合蛋白基因是以上述的HGF α、連接肽和IgGlFc的基因片段通過拼接 PCR擴增所得。最后包括信號肽的融合片段則是以上述IL-2的信號肽基因片段和HGF a -Fc 基因片段通過拼接PCR擴增所得。2、表達HGF a-Fc融合蛋白重組載體的構建編碼本發(fā)明優(yōu)化融合蛋白的基因克隆是由上述包括信號肽的HGFa-Fc融合片段 通過HindIII和XhoI酶切位點插入到質粒載體pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen公司)的HindIII 和XhoI酶切位點所得(見圖2)。該重組質粒利用CMV啟動子來表達融合蛋白，并包含SV40 的多聚腺苷酸(PolyA)序列以保證其表達最佳的表達量。該重組質粒還包括氨芐青霉素 (Ampicillin)抗性基因以利于在細菌中的復制，和新霉素(Neomycin)抗性基因以用于穩(wěn) 定轉染細胞的篩選。將編碼HGFa-Fc融合蛋白的重組質粒轉化E.Coli(DH5a)后加入LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，以獲取大量重組質粒的拷貝，用質粒提取試劑盒(Qiiagen公司)提取質 粒后進行酶切和測序鑒定(見圖3)，所獲得的編碼HGFa-Fc融合蛋白的DNA序列如SEQ ID N0. 7所示。實施例二 HGF a -Fc融合蛋白在細胞中的表達和純化本發(fā)明中HGF a -Fc融合蛋白是在CHO細胞中表達并分泌到培養(yǎng)液中的，并利用葡 萄球菌蛋白A親和層析的方法純化所得，具體見下。1、HGF a -Fc融合蛋白在CHO細胞中的瞬時表達獲得高純度編碼HGF a -Fc的重組質粒后，利用Lipofectamine 2000質粒轉染試 劑盒(Invitrogen公司)將重組質粒轉染CHO細胞(ATCC)，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天后 收集CHO細胞上清液，可以用免疫印跡檢測HGFa-Fc融合蛋白的表達(見圖4)。此方法可 用于快速地獲取少量的HGFa-Fc融合蛋白，其濃度可以用ELISA法定量檢測，所用一抗可 以為抗人IgGlFc或HGF α抗體。2、HGF α -Fc融合蛋白在CHO細胞中的穩(wěn)定表達將編碼HGF α -Fc的重組質粒用Lipofectamine 2000質粒轉染試劑盒 (Invitrogen公司)轉染CHO細胞，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天后加入新霉素，采用有限稀 釋法進行細胞克隆培養(yǎng)，大約14天后挑取新霉素抗性的細胞克隆進行細胞的擴大培養(yǎng)，并 選取狀態(tài)良好的細胞在液氮中冷凍保存。穩(wěn)定轉染后的CHO細胞可以在滾動細胞培養(yǎng)瓶中 進一步擴大培養(yǎng)以生產(chǎn)大量的HGFa-Fc融合蛋白，此方法可用于獲取大量的HGFa-Fc融 合蛋白，其濃度可以用ELISA法定量檢測，所用一抗可以為抗人IgGlFc或HGF α抗體。。
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3、HGF α -Fc融合蛋白的純化包含HGFa-Fc融合蛋白的細胞培養(yǎng)液可采用葡萄球菌蛋白A親和層析的方法進 行純化(見圖5)。將蛋白A-S印harose層析柱以PBS緩沖液平衡后，將超濾器濃縮過的CHO 細胞培養(yǎng)液上清液進樣，以A280進行監(jiān)測，用PBS緩沖液沖洗至未結合的蛋白全部被洗脫， 然后用IOOmM的檸檬酸洗脫結合蛋白，立刻以IM的Tris-HCl進行中和。純化后的融合蛋 白可以用ELISA法檢測濃度。包含融合蛋白的洗脫液經(jīng)脫鹽純化后可以凍干，凍干后可置 于-20°C長期保存。實施例三HGF α -Fc融合蛋白與HGFR陽性腫瘤細胞的體外結合實驗本發(fā)明的優(yōu)化融合蛋白在體外可以能夠結合HGFR陽性的細胞。本發(fā)明以Α549肺 癌細胞作為HGFR陽性的細胞，并以本發(fā)明中的HGF α -Fc融合蛋白來檢測其細胞結合活性。 HGFa-Fc融合蛋白與Α549肺癌細胞的結合活性用流式細胞術檢測。 HGF a -Fc融合蛋白與A549肺癌細胞混合于1 %的牛血清白蛋白(BSA)和0. 02 % 疊氮鈉的PBS(染色緩沖液)中，至冰上孵育1小時。用同種型免疫球蛋白IgGl作為陰性 對照。細胞用PBS緩沖液洗滌2次，然后與異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗人IgG抗 體在染色緩沖液中冰上孵育30分鐘。細胞用流動緩沖液洗滌2次，并用流式細胞儀(ESP Elite，Coulter)進行分析。根據(jù)前向和側向光散射，從分析中剔除死細胞和碎片。以平均 對數(shù)熒光乘以陽性群體的百分數(shù)計算平均熒光強度(見圖6)。結果表明濃度為lOug/ml 和100ug/ml的HGF a -Fc都可以有效結合A549肺癌細胞，而且表現(xiàn)出濃度依賴效應。實施例四HGF a -Fc融合蛋白的體外細胞生長抑制活性檢測本發(fā)明利用HGFR陽性的A549肺癌細胞作為細胞模型來檢測HGFa-Fc融合蛋白 的細胞生長抑制活性。在96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)接種A549肺癌細胞(1 X IO4/孔，200ul)，待細胞貼壁后，將 不同濃度的HGF a -Fc融合蛋白加入到細胞培養(yǎng)孔，每個濃度設立5個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)細胞 72小時后，每孔加20ul濃度為5mg/ml的MTT噻唑藍溶液。繼續(xù)孵育4小時后，吸棄細胞培 養(yǎng)孔內(nèi)的上清液，每孔加150ul 二甲基亞砜(DMS0)，振搖10分鐘，使結晶物充分融解。用 酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔490nm波長的吸收值，以時間為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制細 胞生長曲線(見圖7)。結果表明濃度為5ug/ml和50ug/ml的HGF a -Fc都可以有效抑制 A549肺癌細胞的生長，而且表現(xiàn)出濃度依賴效應。實施例五HGF a -Fc融合蛋白的體內(nèi)抗腫瘤活性本發(fā)明利用HGFR表達陽性的A549細胞在SCID小鼠體內(nèi)建立肺癌腫瘤模型，來檢 測HGF a -Fc融合蛋白的體內(nèi)抗腫瘤活性。6-8周齡SCID小鼠分為3組(6只/組)，5 X IO6個A549細胞皮下腹背側接種 于SCID小鼠建立腫瘤模型。在接種第5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天進行尾靜脈注射 HGF a -Fc融合蛋白(2組分別給藥10ug/day和30ug/day, 10天共給藥IOOug和300ug)或 PBS (對照組，給予等體積PBS)，觀察腫瘤大小和生存。腫瘤體積按照如下公式計算腫瘤體 積=0.5X長徑X寬徑X寬徑。結果表明=HGFa-Fc融合蛋白可以有效抑制體內(nèi)A549肺 癌腫瘤的生長，而且300ug給藥組的抗腫瘤效果優(yōu)于IOOug給藥組(見圖8)。實驗期間，各 組小鼠生命體征基本正常，小鼠本身體重并無明顯減輕，主要器官組織形態(tài)良好。
權利要求
融合蛋白，其特征在于由來自人肝細胞生長因子HGF的α鏈與人免疫球蛋白Fc段構成，人肝細胞生長因子HGF的α鏈在氮端，人免疫球蛋白Fc段在碳端，HGF的α鏈和Fc之間由一條連接肽相連。
2.根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述人肝細胞生長因子HGF的α鏈 包括PAN結構域和四個連續(xù)的環(huán)餅結構域，PAN結構域在氮端。
3.根據(jù)權利要求2所述的融合蛋白，其特征在于所述人肝細胞生長因子HGF的α鏈 氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述人免疫球蛋白為IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgE、IgM 或 IgA。
5.根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述人免疫球蛋白為IgGl，其Fc段 的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4所述。
6.根據(jù)權利要求1 5任一項所述的融合蛋白，其特征在于所述連接肽的氨基酸序 列為 GGGGSGGGGSGGGGS。
7.根據(jù)權利要求1 6任一項所述的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 8所示；或者其氨基酸序列為在SEQ ID NO. 8的基礎上缺失、替換或增加一個或幾個氨基酸后所得 的具有相同功能的融合蛋白質。
8.編碼權利要求1 7任一項所述的抗腫瘤的核苷酸序列。
9.根據(jù)權利要求8所述的核苷酸序列，其特征在于其序列為SEQID NO. 7所示。
10.含有權利要求8或9所述核苷酸序列的重組載體。
11.含有權利要求10所述重組載體的宿主細胞。
12.權利要求1 7任一項所述的融合蛋白、權利要求8或9所述核苷酸序列、權利要 求10所述重組載體或者權利要求11所述宿主細胞在制備抗腫瘤藥物中的應用。
13.一種藥物組合物，由權利要求1 7任一項所述的抗腫瘤的融合蛋白、權利要求8 或9所述核苷酸序列、權利要求10所述重組載體或者權利要求11所述宿主細胞作為主要 活性成分添加藥學上可接受的輔助性成分制備而成的。
14.如權利要求13所述的藥物組合物，其特征在于，還包括一種或幾種其他的抗腫瘤 藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白質工程領域，具體涉及編碼包含HGF片段和Fc片段的融合蛋白及其編碼DNA。本發(fā)明要解決的技術問題是克服是HGF蛋白片段生物活性和穩(wěn)定性不好的缺陷。解決該技術問題的技術方案是提供一種優(yōu)化的融合蛋白。該抗腫瘤的融合蛋白質由來自人肝細胞生長因子HGF的α鏈與人免疫球蛋白Fc段構成，人肝細胞生長因子HGF的α鏈在氮端，人免疫球蛋白Fc段在碳端，HGF的α鏈和Fc之間由一條連接肽相連。此融合蛋白具有抑制HGF/HGFR信號轉導和發(fā)揮Fc免疫學效應的雙重作用，其功效得到了很大的提高，具有明顯更強的生物活性和血漿半衰期，從而能夠更有效地抑制并殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤的發(fā)展。
文檔編號C07K19/00GK101914161SQ20101025332
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月13日 優(yōu)先權日2010年8月13日
發(fā)明者勾藍圖, 楊金亮, 魏于全 申請人:四川大學