專利名稱：：通過不同的翻譯后修飾改變和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明大體上涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。更具體地說，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。
背景技術(shù)：
：直到最近，人們認(rèn)為細(xì)菌通常并未使其蛋白質(zhì)糖基化。雖然已報(bào)道一些例子，但這些被當(dāng)作罕見的異常情況而摒棄(Borman2006)?，F(xiàn)在人們逐漸接受細(xì)菌以比真核生物可能更多的方式使其蛋白質(zhì)糖基化，盡管這種看法尚未得到廣泛認(rèn)同(Schaffer等，2001)。在最近的評(píng)論文章中聲明，已顯示糖基化有助于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)物理性質(zhì)(如溶解性)、保護(hù)蛋白質(zhì)免受水解、改變活性和靶向外化(Upreti等，200。1994年，一組人員從酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)中純化淀粉酶并表示該淀粉酶在活性生長(zhǎng)期間與細(xì)胞結(jié)合(khwermarm等，1994)。隨著培養(yǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞將活性可溶糖基化形式的淀粉酶釋放至培養(yǎng)基中(khwermarm等，1994)。未嘗試比較各種形式的淀粉酶的活性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的實(shí)施方案包括通過用化學(xué)糖基化的方式和/或分離的或部分純化的糖基轉(zhuǎn)移酶和/或翻譯后修飾蛋白、包含糖基轉(zhuǎn)移酶和/或翻譯后修飾蛋白的細(xì)胞提取物，和/或在包含一種或多種糖基轉(zhuǎn)移酶和/或翻譯后修飾蛋白的細(xì)胞中改變極端酶或其它蛋白質(zhì)的酶活性的方法。本發(fā)明的實(shí)施方案包括翻譯后修飾蛋白質(zhì)的方法。在一些實(shí)施方案中，翻譯后修飾可通過使用糖基化(包括化學(xué)糖基化)、聚乙二醇化、磷酸化、甲基化或其它形式的翻譯后修飾的方式進(jìn)行，和/或是分離的或部分純化的糖基轉(zhuǎn)移酶和/或翻譯后修飾蛋白，包含糖基轉(zhuǎn)移酶和/或翻譯后修飾蛋白的細(xì)胞提取物，和/或在包含一種或多種糖基轉(zhuǎn)移酶和/或翻譯后修飾蛋白的細(xì)胞中。本發(fā)明的實(shí)施方案包括翻譯后修飾蛋白，所述翻譯后修飾蛋白包括但不限于SEQIDNOS:307(celB)、331(內(nèi)切葡聚糖酶C)、333(肽聚糖N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶)、335(β-半乳糖苷酶)、337(阿拉伯呋喃糖苷酶)和338(α-木糖苷酶)。因此實(shí)施方案包括上述蛋白質(zhì)的糖基化形式。本發(fā)明的第一方面涉及從極端微生物分離的酶，所述酶在溫度高于約80°C和pH低于約2時(shí)顯示最佳的酶活性。本發(fā)明的另一方面涉及來源于酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(ATCC27009)的半纖維素酶。本發(fā)明的再一方面涉及用于降解復(fù)合生物分子的酶。更進(jìn)一步地，本發(fā)明的再一方面涉及可用于同時(shí)糖化和發(fā)酵過程以將生物質(zhì)糖轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物的酶。本發(fā)明的再一方面涉及處理生物質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟提供具有生物質(zhì)糖的生物質(zhì)源，用來源于酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(ATCC27009)的水溶性半纖維素酶預(yù)處理生物質(zhì)以產(chǎn)生終產(chǎn)物。本發(fā)明的再一方面涉及制備半纖維素酶的方法，所述方法包括以下步驟提供酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(ATCC27009)源；在有上清液的微生物營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(ATCC27009)；從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上清液中分離酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌的細(xì)胞；以及從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上清液回收并純化來源于酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(ATCC27009)的半纖維素酶。而且，本發(fā)明的再一方面涉及水解多糖的方法，所述方法包括以下步驟提供來源于微生物的水溶性半纖維素酶；在PH低于約2時(shí)用水溶性半纖維素酶進(jìn)行多糖的水解。以下將更詳細(xì)地描述本發(fā)明的這些和其它方面。附圖簡(jiǎn)述圖1分另Ij描述了SEQIDNO:1(RAAC00164)與ref|YP_001223775.11、ref|YP_729290.1|、ref|ZP_01084440.1|、ref|ZP_01079150.1|禾口ref|ZP_01471594.l|(SEQIDNOS:3_7)之間的序列比對(duì)，所述序列均具有對(duì)表1中SEQIDN0:1指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“”表示一般保守氨基酸。圖2分別描述了SEQIDNO18(RAAC00517)與ref|ZP_00589533.11、refIZP_01386435.11、ref|YP_378533.11、ref|ZP_00513158.11和ref|YP_374173.11(SEQIDNOS20-24)之間的序列比對(duì)，所述序列均具有對(duì)表1中SEQIDNO:18指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“”表示一般保守氨基酸。圖3分別描述了SEQIDNO35(RAAC00650)與ref|YP_001127183.11、refIΖΡ_02038504.1|、ref|ΥΡ_001647987.1|、ref|YP_001377114·1|禾口ref|NP_835081.l|(SEQIDNOS:37-41)之間的序列比對(duì)，所述序列均具有對(duì)表1中SEQIDN0:35指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“”表示一般保守氨基酸。圖4分別描述了SEQIDNO52(RAAC00991)與ref|ZP_02327412.11、refIΥΡ_001487207.11、ref|ΖΡ_01172765.11、ref|NP_831314.11和ref|NP_844008.11(SEQIDNOS54-58)之間的序列比對(duì)，所述序列均具有對(duì)表1中SEQIDNO:52指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“”表示一般保守氨基酸。圖5A和5B分別描述了SEQIDNO:69(RAAC01110)與ref|YP_001519856.11、ref|YP_711688.11、ref|ZP_01331931.11、ref|YP_001076955.11和ref|YP_336440.11(SEQIDNOS71-75)之間的序列比對(duì)，所述序列均具有對(duì)表1中SEQIDNO:69指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“”表示一般保守氨基酸。圖6A禾口6B分別描述了SEQIDNO86(RAAC01166)與gb|AAR99615.1|、gb|ABM68334.2|,ref|ZP_01372248.11、ref|ΥΡ_519555·11和ref|ΖΡ_022;34077·11(SEQIDNOS88-92)之間的序列比對(duì)，所述序列均具有對(duì)表1中SEQIDNO:86指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“”表示一般保守氨基酸。圖7分另Ij描述了SEQIDNO103(RAAC01167)與ref|ZP_01515212.11、refIΥΡ_001277643.1|、ref|ΖΡ_02291400.1|、ref|ΥΡ_001633727·1|禾口ref|YP_001434357.1(SEQIDNOS:105-109)之間的序列比對(duì)，所述序列均具有對(duì)表1中SEQIDNO:103指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“”表示一般保守氨基酸。圖8A和8B分別描述了SEQIDNO120(RAAC01170)與ref|YP_001324592.11、ref|YP_342776.1|、ref|NP_780975.1|、ref|YP_001636830.1|禾口ref|YP_001299026.1(SEQIDNOS:122-126)之間的序列比對(duì)，所述序列均具有對(duì)表1中SEQIDNO:120指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“”表示一般保守氨基酸。圖9分別描述了SEQIDNO137(RAAC01248)與ref|ZP_02170160.11、refIΖΡ_01171895.1Uref|YP_076646.1Uref|YP_590910.11和ref|ZP_02175410.11(SEQIDNOS:139-143)之間的序列比對(duì)，所述序列具有對(duì)表1中SEQIDNO137指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“”表示一般保守氨基酸。圖IOA和IOB分別描述了SEQIDNO154(RAAC01348)與ref|ZP_01665^9.11、refIΖΡ_01643350.11、gb|AAW77167.11、ref|YP_452722.11和ref|ZP02241787.11(SEQIDNOS=156-160)之間的序列比對(duì)，所述序列均具有對(duì)表1中SEQIDNO:巧4指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“”表示一般保守氨基酸。圖11分別描述了SEQIDNO171(RAAC01377)與ref|YP_147952.11、refIΥΡ_520670·1|、ref|ΥΡ_001395809·1|、ref|ΥΡ_001309701·1|禾口ref|YP_001643660.1(SEQIDNOS:173-177)之間的序列比對(duì)，所述序列均具有對(duì)表1中SEQIDNO:171指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“”表示一般保守氨基酸。圖12分別描述了SEQIDNO188(RAAC01611)與ref|YP_146214.11、refIΥΡ_001124463.11,ref|NP_865262.11,ref|YP_426013.11和ref|ΖΡ_01885526·1(SEQIDNOS=190-194)之間的序列比對(duì)，所述序列均具有對(duì)表1中SEQIDNO:188指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“”表示一般保守氨基酸。圖13A禾Π13Β分別描述了SEQIDNO:205(RAAC01612)與ref|YP_146215.11、refIYP_001124464.1|、ref|ΥΡ_074948·1|、ref|ΥΡ_001039503·1|禾口ref|NP_621770.1(SEQIDNOS:207-211)之間的序列比對(duì)，所述序列均具有對(duì)表1中SEQIDN0:205指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“”表示一般保守氨基酸。圖14A和14B分別描述了SEQIDNO:222(RAAC01926)與ref|YP_001038202.11、refIΖΡ_01667587.1|、ref|ΖΡ_01575301.1|、ref|ΥΡ_001211020·1|禾口ref|YP_516465.1(SEQIDNOS:224-228)之間的序列比對(duì)，所述序列均具有對(duì)表1中SEQIDN0:222指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“”表示一般保守氨基酸。圖15分別描述了SEQIDNO239(RAAC01998)與ref|NP_348940.11、refINP_721244.11、dbj|BAC75700.11、ref|ZP_00605123.11和ref|YP_015329.11(SEQIDNOS=241-245)之間的序列比對(duì)，所述序列均具有對(duì)表1中SEQIDNO:239指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“”表示一般保守氨基酸。圖16分別描述了SEQIDNO256(RAAC02011)與ref|YP_754819.11、refIYP_184322.11、ref|NP_577787.11、ref|NP_142068.11和ref|NP_125751.11(SEQIDNOS=258-262)之間的序列比對(duì)，所述序列均具有對(duì)表1中SEQIDNO:256指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“”表示一般保守氨基酸。圖17A和17B分別描述了SEQIDNO:273(RAAC02381)與ref|NP_622177.11、ref|YP_848858.11、ref|ΥΡ_001374688·11、ref|ΝΡ_470039·11和ref|ΖΡ_01^9325·1(SEQIDNOS:275-279)之間的序列比對(duì)，所述序列均具有對(duì)表1中SEQIDNO:273指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“”表示一般保守氨基酸。圖18分別描述了SEQIDNO290(RAAC02421)與ref|ZP_01721811.11、refIΝΡ_241897·1|、ref|ΥΡ_001486101·l|、ref|ZP_01170532.1|禾口ref|ZP_02327994.1(SEQIDNOS=292-296)之間的序列比對(duì)，所述序列均具有對(duì)表1中SEQIDN0:290指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“”表示一般保守氨基酸。圖19為描述溫度對(duì)如本發(fā)明所提供的木聚糖酶活性的影響的圖表。圖20為描述在pH4.0時(shí)溫度對(duì)如本發(fā)明所提供的纖維素酶活性的影響的圖表。圖21為描述在溫度為60°C時(shí)pH對(duì)本發(fā)明的纖維素酶活性的影響的圖表。圖22為描述在溫度為60°C時(shí)pH對(duì)本發(fā)明的木聚糖酶活性的影響的圖表。圖23為描述在不同PH和溫度下用小麥阿拉伯木聚糖(WAX)測(cè)定的SEQIDNO307的木聚糖酶活性的圖表。從酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(黑色柱)分離所述酶或在大腸桿菌(E.coli)(白色柱)中產(chǎn)生所述酶。沒有在pH為5.5(60°C和80°C)時(shí)從酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌分離的酶的數(shù)據(jù)。圖M為描述在不同pH和溫度下用羧甲基纖維素(CMC)測(cè)定的SEQIDNO:307的纖維素酶活性的圖表。從酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(黑色柱)分離所述酶或在大腸桿菌(白色柱)中產(chǎn)生所述酶。沒有在pH為5.5(60°C和80°C)時(shí)從酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌分離的酶的數(shù)據(jù)。圖25為描述在不同pH和溫度下如圖23和M測(cè)定的SEQIDNO:307的纖維素/木聚糖酶活性比的圖表。從酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(黑色柱)分離所述酶或在大腸桿菌(白色柱)中產(chǎn)生所述酶。沒有在pH為5.5(60°C和80°C)時(shí)從酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌分離的酶的數(shù)據(jù)。pH為5.5時(shí)對(duì)于大腸桿菌中產(chǎn)生的酶的柱頂端左側(cè)開口，表明所述比例高于10。圖沈?yàn)槊枋鲈诓煌琾H和溫度下用小麥阿拉伯木聚糖(WAX)測(cè)定的SEQIDNO307的木聚糖酶活性的圖表。畢赤酵母(Pichiapastoris)(黑色柱)或大腸桿菌(白色柱)中產(chǎn)生所述酶。圖27為描述在不同PH和溫度下用羧甲基纖維素(CMC)測(cè)定的SEQIDNO:307的纖維素酶活性的圖表。畢赤酵母(黑色柱)或大腸桿菌(白色柱)中產(chǎn)生所述酶。圖28為描述在不同pH和溫度下如圖沈和27測(cè)定的SEQIDNO:307的纖維素/木聚糖酶活性比的圖表。畢赤酵母(黑色柱)或大腸桿菌(白色柱)中產(chǎn)生所述酶。PH為5.5時(shí)對(duì)于大腸桿菌中產(chǎn)生的酶的柱頂端左側(cè)開口，表明所述比例高于10。圖四為描述在不同PH和溫度下用小麥阿拉伯木聚糖(WAX)測(cè)定的SEQIDNO307的木聚糖酶活性的圖表。從酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(黑色柱)分離所述酶或在畢赤酵母(白色柱)中產(chǎn)生所述酶。沒有在pH為5.5(60°C和80°C)時(shí)從酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌分離的酶的數(shù)據(jù)。圖30為描述在不同pH和溫度下用羧甲基纖維素(CMC)測(cè)定的SEQIDNO:307的纖維素酶活性的圖表。從酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(黑色柱)分離所述酶或在畢赤酵母(白色柱)中產(chǎn)生所述酶。沒有在pH為5.5(60°C和80°C)時(shí)從酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌分離的酶的數(shù)據(jù)。圖31為描述在不同pH和溫度下如圖四和30測(cè)定的SEQIDNO:307的纖維素/木聚糖酶活性比的圖表。從酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(黑色柱)分離所述酶或在畢赤酵母(白色柱)中產(chǎn)生所述酶。沒有在pH為5.5(60°C和80°C)時(shí)從酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌分離的酶的數(shù)據(jù)。圖32為描述在不同pH和溫度下用小麥阿拉伯木聚糖(WAX)測(cè)定的缺乏C端203個(gè)氨基酸的SEQIDNO:307的木聚糖酶活性的圖表。在畢赤酵母(黑色柱)或大腸桿菌(白色柱)中產(chǎn)生所述酶。圖33為描述在不同pH和溫度下用羧甲基纖維素(CMC)測(cè)定的缺乏C端203個(gè)氨基酸的SEQIDNO:307的纖維素酶活性的圖表。在畢赤酵母(黑色柱)或帶N端組氨酸標(biāo)簽的大腸桿菌(白色柱)中產(chǎn)生所述酶。圖34為描述在不同pH和溫度下如圖32和33測(cè)定的缺乏C端203個(gè)氨基酸的SEQIDNO307的纖維素/木聚糖酶活性比的圖表。在畢赤酵母(黑色柱)或大腸桿菌(白色柱)中產(chǎn)生所述酶。圖35為描述大腸桿菌中產(chǎn)生的RAAC00307(SEQIDNO:337)的阿拉伯呋喃糖苷酶活性比的圖表。示出在不同pH下在50°C(菱形)、60°C(正方形)、70°C(三角形)、80°C(“x”)、90°C(“*，，)時(shí)的活性。在pH為2時(shí)，所述酶無活性。圖36為描述大腸桿菌中產(chǎn)生的RAAC00307(SEQIDNO:337)的β-木糖苷酶活性比的圖表。示出在不同PH下在50°C(菱形)、60°C(正方形)、70°C(三角形)、80°C(“χ”)、90°C(“*”)時(shí)的活性。在pH為2時(shí)，所述酶無活性。圖37為描述畢赤酵母中產(chǎn)生的RAAC00307(SEQIDNO:337)β-木糖苷酶活性比的圖表。示出在不同pH下在60°C(菱形)和80°C(正方形)時(shí)的活性。具體實(shí)施例方式如下文所述，本發(fā)明一方面部分涉及從極端微生物分離的酶，所述酶在溫度高于約80°C和最適pH低于約2下顯示最佳的酶活性。在本發(fā)明的其它方面，所述酶可為來源于酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌的半纖維素酶和/或木聚糖酶，其中還將所述生物進(jìn)一步鑒別為ATCC27009。如下文所討論的酶似乎在pH約為1時(shí)顯示酶活性。更進(jìn)一步地，這種酶的分子量為至少約120kDa。在本發(fā)明中，所公開的酶可用于同時(shí)糖化和發(fā)酵過程和/或相繼水解和發(fā)酵過程以將生物質(zhì)糖轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物。更進(jìn)一步地，本文所述酶可用于預(yù)處理生物質(zhì)漿料以降解存在于生物質(zhì)漿料中的可溶于水的或不溶于水的低聚物和/或多糖，以產(chǎn)生終產(chǎn)物。如下文所使用的術(shù)語“極端微生物”指可在人類認(rèn)為極端的條件(如沸水、冰、蓄電池酸液或海洋底部)下生存并生長(zhǎng)的生物。此類微生物的實(shí)例包括但不限于在高達(dá)2350F(113°C)的溫度下生長(zhǎng)的延胡索酸火葉菌(Pyrolobusfumarii)、在_20°C(-40F)下存活的嗜冷桿菌(PsychrcAactercryopegella)、可在核反應(yīng)堆中存活的耐輻射奇球菌(Deinococcusradiodurans)、在海平面大氣壓300倍的壓力下生長(zhǎng)的深海發(fā)光桿菌(Photobacteriumprofundum)以及在與蓄電池酸液相同的pH為O的條件下生存的干熱嗜酸菌(Picrophilustorridus)。在其中可找到這些微生物的環(huán)境包括滾燙溫泉、深海熱泉、冰川、鹽灘以及核反應(yīng)堆。本發(fā)明所用微生物可從天然源和人造源獲得或者從培養(yǎng)物貯藏所購買獲得。在本發(fā)明中，在厭氧、需氧和/或微需氧條件下優(yōu)選在溫度高于40V，pH低于約5時(shí)，更優(yōu)選在溫度高于50°C，pH低于約4時(shí)，且最優(yōu)選在溫度高于55°C，pH低于約3.5時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。雖然培養(yǎng)周期隨PH、溫度和所用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基而不同，但12小時(shí)至數(shù)天的周期通常將產(chǎn)生良好的結(jié)果。如本文所使用，酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌定義為可從弗吉尼亞馬納薩斯的美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)獲得并鑒別為酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(ATCC27009)的微生物。如下文所使用的用語“酶活性”指由酶引起所發(fā)生的反應(yīng)。酶為所有生物體產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，其介導(dǎo)、引起和/或促進(jìn)將一種化學(xué)物質(zhì)變?yōu)榱硪环N化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)而不改變或破壞其本身。在本申請(qǐng)的上下文中，與術(shù)語“酶活性”相結(jié)合使用的詞“最佳”指使酶對(duì)于給定的最終結(jié)果最好且最快地發(fā)揮作用的最有利條件。最佳酶活性可受包括溫度、PH和鹽濃度在內(nèi)的條件的影響。如下文所使用的詞“木聚糖酶”指使半纖維素分裂開的酶，方式是斷開構(gòu)成半纖維素分子主鏈的木糖之間的化學(xué)鍵，或斷開半纖維素側(cè)鏈上的木糖之間的鍵。如下文所使用的詞“多糖”應(yīng)指通過化學(xué)鍵連在一起的糖鏈(可為相同的糖或不同的糖)。多糖可由這些糖的直鏈組成而有或無側(cè)鏈。多糖的實(shí)例包括淀粉、果膠、纖維素和半纖維素。本申請(qǐng)上下文中的詞“水解”應(yīng)指其中水與分子反應(yīng)并將該分子分裂為至少兩個(gè)部分的化學(xué)反應(yīng)。如下文所使用的用語“生物質(zhì)糖”應(yīng)指來自于生物質(zhì)組分分解的糖，如纖維素和半纖維素。生物質(zhì)糖的實(shí)例包括但不限于糖類、葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖及其組合、低聚物和/或其修飾或取代形式。用語“同時(shí)糖化和發(fā)酵過程”在下文應(yīng)指由可經(jīng)化學(xué)方法預(yù)處理或未預(yù)處理的生物質(zhì)制備燃料或化學(xué)品(如乙醇)的過程，并且其中纖維素酶和/或半纖維素酶用于將生物質(zhì)多糖分解為糖(糖化)；且所述糖由微生物源發(fā)酵為燃料或化學(xué)品產(chǎn)物(發(fā)酵)。這兩個(gè)過程在同一反應(yīng)器里同時(shí)發(fā)生(同時(shí)的)。如本申請(qǐng)中使用的用語“終產(chǎn)物”在下文應(yīng)指通過化學(xué)或酶促反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)品。本發(fā)明所涵蓋的終產(chǎn)物實(shí)例包括簡(jiǎn)單糖類(如單體、二聚體、三聚體、低聚物等)、醇類、燃料和/或酶促反應(yīng)的其它產(chǎn)物。本發(fā)明上下文中的詞“生物質(zhì)”應(yīng)指植物和其它木質(zhì)纖維材料，如玉米稈、麥稈和木材副產(chǎn)品(如鋸屑等)。術(shù)語“生物質(zhì)漿料的預(yù)處理”在本申請(qǐng)的上下文中應(yīng)指生物質(zhì)的制備，以用于隨后將其轉(zhuǎn)化為燃料，如乙醇。這種預(yù)處理包括將生物質(zhì)磨成粉末或小顆粒和加水(這樣形成漿料)的步驟。然后用若干方法處理該漿料，設(shè)計(jì)該若干方法以將木質(zhì)素從生物質(zhì)中部分或全部除去，并將半纖維素和纖維素轉(zhuǎn)化為可更易于用酶(如纖維素酶和半纖維素酶)降解為其組分糖的形式。一些預(yù)處理將半纖維素降解為其組分糖，而將纖維素留下作為固體殘?jiān)牟糠?。因?yàn)檫@種處理步驟在酶促降解步驟以及將糖轉(zhuǎn)化為乙醇的發(fā)酵步驟之前發(fā)生，所以稱其為“預(yù)處理”。本發(fā)明上下文中的用語“可溶于水的”應(yīng)指可完全溶于水而不留任何固體殘?jiān)幕瘜W(xué)品或其它物質(zhì)。本發(fā)明上下文中的詞“半纖維素”指植物的一種組分(另外兩種組分為纖維素和木質(zhì)素)，這種組分由用化學(xué)鍵連接的直鏈糖(如木糖或甘露糖)構(gòu)成。這種直鏈也有由沿著鏈的糖和其他化學(xué)物質(zhì)組成的分支。本發(fā)明上下文中的詞“半纖維素酶”指一類可將半纖維素分裂為其組分糖和其它化學(xué)單體的酶。半纖維素酶的實(shí)例包括但不限于木聚糖酶、甘露聚糖酶、葡糖苷酸酶和阿拉伯呋喃糖苷酶。本發(fā)明上下文中的用語“相繼水解和發(fā)酵過程”應(yīng)指由生物質(zhì)制備燃料或化學(xué)品(如乙醇)的過程，并且其中物理處理生物質(zhì)或用反應(yīng)的化學(xué)品或溶劑或其混合物處理生物質(zhì)以除去木質(zhì)素，并將生物質(zhì)中存在的纖維素和半纖維素轉(zhuǎn)化為其組分糖或轉(zhuǎn)化為可更易于用酶(如纖維素酶和半纖維素酶)降解為其組分糖的形式。這些的實(shí)例包括研磨、磨碎、酸、堿、有機(jī)溶劑等。這些處理可在環(huán)境溫度至300°C或更高的溫度，環(huán)境壓力至2000psig或更高的壓力下進(jìn)行。然后冷卻溶于水中的糖，將pH調(diào)至中性，然后接著用各種微生物將糖發(fā)酵為燃料或化學(xué)品產(chǎn)物(發(fā)酵)。這兩個(gè)過程在單獨(dú)的反應(yīng)器中發(fā)生，先進(jìn)行水解步驟，再進(jìn)行發(fā)酵步驟(例如，相繼的)。本發(fā)明上下文中的用語“培養(yǎng)酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌”應(yīng)指為上述微生物提供食物源(可溶或不溶木質(zhì)纖維素或其它多糖或糖源)和各種溶于水的維生素和礦物質(zhì)(這構(gòu)成營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基)，為微生物提供使其生長(zhǎng)的適當(dāng)條件(溫度為140T(600C)、pH為3.5和氧氣)。本發(fā)明上下文中的用語“分離酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌的細(xì)胞”應(yīng)包括通過如離心從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中除去細(xì)菌細(xì)胞的方法。本發(fā)明上下文中的用語“回收并純化半纖維素酶”應(yīng)指從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中分離半纖維素酶。在本發(fā)明中，稱為陽離子交換的過程用于從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中分離半纖維素酶。就這一點(diǎn)而言，將營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(含半纖維素酶)通過陽離子交換材料泵送。當(dāng)使其與陽離子交換材料接觸時(shí)，半纖維素酶將其自身附于陽離子交換材料上，但營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基將通過。然后從陽離子交換材料上除去半纖維素酶并純化。本申請(qǐng)上下文中的用語“微生物營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基”指微生物(酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌)的食物源和維生素、礦物質(zhì)，均溶于水并調(diào)至微生物生長(zhǎng)所需的PH。更具體而言，微生物營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包含約lg/L的木聚糖；約IOmM的NH4C1；約5.2mM的K2HPO4；約0.8mM的MgS04_7H20；約1.74mM的Na2SO4；約25mg/L的MgCl2；約6.6mg/L的CaCl2；約2.Omg/L的MnSO4；約0.5mg/L的ZnSO4；約0.5mg/L的硼酸；約5mg/L的FeCl3；約0.15mg/L的CuSO4；約0.025mg/L的NaMoO4；約0.05mg/L的CoNO3；約0.02mg/L的NiCl2；約0.08mg/L的鹽酸吡哆辛，；約0.Olmg/L的葉酸；約0.lmg/L的鹽酸硫胺素；約0.04mg/L的核黃素；約0.08mg/L的煙酰胺；約0.08mg/L的對(duì)氨基苯甲酸酯；約0.Olmg/L的生物素；約0.0004mg/L的氰鈷胺素；約0.08mg/L的D-泛酸鈣；約0.02mg/L的肌醇；約0.05mg/L的溴化膽堿；約0.02mg/L的乳清酸鈉；和約0.lmg/L的亞精胺，其中所得到的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基調(diào)至pH約為3.5。本申請(qǐng)上下文中的詞“上清液”應(yīng)指在從中基本上除去細(xì)菌細(xì)胞后剩余的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。發(fā)明人已分離并鑒定了溫度和酸穩(wěn)定性內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶，這兩種酶在高溫和低PH下顯示活性，當(dāng)在這些條件下長(zhǎng)時(shí)間孵育時(shí)表現(xiàn)出穩(wěn)定性。發(fā)明人認(rèn)為，如下文所述的熱和酸穩(wěn)定性半纖維素酶和纖維素酶在過程中具有特殊價(jià)值或作為這些過程的輔助，這些過程一方面可導(dǎo)致降低之前所述預(yù)處理過程的嚴(yán)格程度和/或消除不同過程過程中的這些限制因素。就這一點(diǎn)而言，發(fā)明人從黃石國(guó)家公園和不同培養(yǎng)物保藏所篩選大量生物，以獲得具有產(chǎn)生高溫和低PH下均穩(wěn)定的酶的能力的微生物。就這一點(diǎn)而言，從黃石國(guó)家公園的諾里斯間歇泉盆地(NorrisGeyserBasin)的6處溫泉采集水和沉淀物樣本。將這些樣本接種至pH為3.5并且還含有0.5g/L的燕麥木聚糖或0.5g/L的碎玉米棒的液態(tài)礦物鹽培養(yǎng)基中。在80°C下接種后來的培養(yǎng)物并每天用肉眼和通過顯微鏡觀察生長(zhǎng)情況。更進(jìn)一步地，美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)和德國(guó)微生物菌種保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenUndZellkulturen(DSMZ))的石禾中)(寸的M適溫度高于約60°C，最適pH低于約4的合適的異養(yǎng)生物。在由ATCC或DSMZ推薦的培養(yǎng)基(其中用如上所述燕麥木聚糖或碎玉米棒代替碳源)中孵育這幾種生物。隨后在其最適生長(zhǎng)溫度和pH為3.5下孵育這些培養(yǎng)物。通過混濁的出現(xiàn)在外觀上評(píng)估隨后微生物的生長(zhǎng)情況。在此項(xiàng)研究中，如果在木聚糖參存在下出現(xiàn)生長(zhǎng)，據(jù)推測(cè)假定半纖維素酶和/或纖維素酶活性存在。在孵育約3天后收獲出現(xiàn)生長(zhǎng)的培養(yǎng)物。通過離心從培養(yǎng)物中除去細(xì)胞。用具有10000MWC0膜的AMICON超濾細(xì)胞使培養(yǎng)物上清液濃縮約1000-2000倍。然后用小麥阿拉伯木聚糖(從Megazyme購買獲得)或羧甲基纖維素(從Sigma-Aldrich獲得)進(jìn)行砷鉬酸鹽還原糖酸測(cè)定化驗(yàn)(先前由Somogyi描述(，1952)，J.Biol.Chem.19519-23)測(cè)試隨后的上清液濃縮物中的半纖維素酶和纖維素酶活性。這些分別用作半纖維素酶和纖維素酶活性的底物。測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)條件設(shè)定為60°C和pH約3.5。參考附圖將看出，在溫度高達(dá)約90°C下測(cè)定半纖維素酶和纖維素酶活性，以確定酶活性的最適溫度。通過用底物改變上清液濃縮物的孵育溫度而修改上文提及的還原糖測(cè)定。同樣地，在PH為1至約8下測(cè)定酶活性以確定酶活性的最適pH。對(duì)于這些研究，通過在適當(dāng)pH緩沖液(pH為1-2，50mM馬來酸鈉或50mM甘氨酸；pH為2-6，50mM醋酸鈉；pH為6-8，50mM磷酸鈉；以及pH為8-9，50mM三羥甲基氨基甲烷(Tris))中制備測(cè)定組分而修改還原糖測(cè)定。除上述之外，通過在溫度約70°C和pH為2.0下孵育上清液濃縮物而檢驗(yàn)根據(jù)溫度和PH的半纖維素酶和纖維素酶穩(wěn)定性。在這點(diǎn)上，在濃縮物上置一層礦物油以限制在檢驗(yàn)期間蒸發(fā)。定時(shí)收集樣本并在先前所述標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定條件下測(cè)定其半纖維素酶和纖維素酶活性。關(guān)于半纖維素酶和纖維素酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，用不同量的小麥阿拉伯木聚糖或羧甲基纖維素進(jìn)行還原糖測(cè)定而確定。在601和？!1為3.5時(shí)測(cè)定反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。通過用可通過SynexChem獲得的ENZYMEKINETICSPRO進(jìn)行非線性分析計(jì)算Michaelis-Menten參數(shù)Vmax和Km。在以上提到的過程后，發(fā)明人鑒別酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(ATCC27009)以進(jìn)一步檢驗(yàn)。隨后，通過濃縮無細(xì)胞的培養(yǎng)物材料進(jìn)行粗酶制備。后來的SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-pagegel)顯示出5條主帶和若干次帶。后來計(jì)算的大量這些條帶與報(bào)道的其它木聚糖酶和纖維素酶一致。如圖19、20、21、22所見，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)從酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(本文鑒別為ATCC27009分離的酶的酶活性(木聚糖酶和纖維素酶)最適溫度約為80°C。如圖19所見，將相對(duì)酶活性與從另一種類似微生物嗜熱真菌(T.Ianuginosus)分離的類似酶所提供的酶活性形成對(duì)比。進(jìn)一步地，人們發(fā)現(xiàn)分離的內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶在低至1的PH下顯示酶活性，最適pH為2，而纖維素酶活性的最適pH約為4，盡管纖維素酶在低至2的pH下確實(shí)顯示一些活性。圖22顯示木聚糖酶活性為pH的函數(shù)，如上所述。就發(fā)明人所知，先前報(bào)道的最低最適半纖維素酶PH是關(guān)于Collins(2005，F(xiàn)EMS，Micro.Review,29(1):3-23)?？梢韵胂褚逊蛛x的該水溶性內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶可能在pH低于1時(shí)具有活性，然而目前，還原糖測(cè)定試劑在PH低于1時(shí)不穩(wěn)定。另一研究顯示當(dāng)在70°C和PH為2孵育時(shí)，新分離的半纖維素酶和纖維素酶顯示活性并未降低。上述研究引導(dǎo)發(fā)明人推斷酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(ATCC27009)能夠在木聚糖基質(zhì)上生長(zhǎng)，并且還產(chǎn)生細(xì)胞外半纖維素酶和纖維素酶活性，二者均溶于水并在PH約為2時(shí)表現(xiàn)出顯著的半纖維素酶活性，并且分子量至少約為120kDa。再次見圖22。現(xiàn)有技術(shù)公開已從白曲霉(Aspergilluskawachii)中純化并鑒定了酸穩(wěn)定性木聚糖酶，白曲霉的最適PH為2.0，最適溫度在50°C至60°C之間(PurificationandPropertiesofAcidStableXylanasesfromAspergilluskawachii,K.Ito,H.Ogasawara,T.Sugomoto禾口Τ·Ishikawa，BioscienceBiotechnologyandBiochemistry56(4)=547-550,1992年4月)。另外，已報(bào)道若干木聚糖酶的最適pH為4至5，并且已報(bào)道大量木聚糖酶的最適溫度高達(dá)100°C。然而，就發(fā)明人所知，如下文所述的酶是第一種已知在本文所要求的如此低的PH和如此高的溫度下有活性的酶。除上述之外，發(fā)明人意識(shí)到已從同種生物，即酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(ATCC27009)中純化了木聚糖酶，據(jù)報(bào)道酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌具有與之有關(guān)的木聚糖酶活性。據(jù)報(bào)道這種酶的最適PH為4.0，且最適溫度約為80°C。就這一點(diǎn)而言，來源于酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(ATCC27009)的嗜熱嗜酸內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶(celB)顯示出與屬于糖苷水解酶族51的阿拉伯呋喃糖苷酶的高度序列相似性(K.Eckert禾口E.Schneider,EuropeanJournalofBiochemistry,270(17)3593-3602，2003年9月)。通過研究如下所示的SEQIDNO307可最好地了解如現(xiàn)有技術(shù)參考中所述的前述纖維素酶前體。1MKRPffSAALAALIALGTGASPAffAAAHPSPKVPAGAAGRVRAADVVSTPI0081]51SMEIQVIHDALTVPELAAVQAAAQAASNLSTSQffLQffLYP0082]NATPTTSAQS0083]101QAAQAVANLFNLATYGAVSTRGSNAAQILQTLQSISPLLS0084]PRAVGLFYQS0085]151FLTEIGQSSKAILARQASSSIVGNALAQAASLSPTISAYL0086]RQNGLSPSDL0087]201ARTffSSFETQVDPQGAAQTALATRICTNALGFGAPTASAT0088]ITVNTAARLR0089]251TVPATAFGLNAAVffDSGLNSQTVISEVQALHPALIRffPGG0090]SISDVYNWET0091]301NTRNDGGYVNPNDTFDNFMQFVNAVGASPIITVNYGTGTP0092]QLAADffVKYA0093]351DVTHHDNVLYWEIGNEIYGNGYYNGNGffEADDHAVPNQPQ0094]KGNPGLSPQA0095]401YAQNALQFIQAMRAVDPNIKIGAVLTMPYNWPffGATVNGN0096]DDffNTVVLKA0097]451LGPYIDFVDVHWYPETPGQETDAGLLADTDQIPAMVAELK0098]REINAYAGSN0099]501AKNIQIFVTETNSVSYNPGQQSTNLPEALFLADDLAGFVQ0100]AGAANVDffffD0101]551LLNGAEDNYTSPSLYGQNLFGDYGLLSSGQATPKGVQEPP0102]QYTPLPPYYG0103]601FQLVSDFARPGDTLLGSASSQSDIDVHAVREPNGDIALML0104]VNRSPSTIYS0105]651ADLNVLGVGPYAITKALVYGEGSSAVSPALTLPTAHSVKL0106]MPYSGVDLVL0107]701HPLIPAPHAAASVTDTLALSSPTVTAGGSETVTASFSSDR0108]PVRDATVELE0109]751LYDSTGDLVANHEMTGVDIAPGQPVSESffTFAAPAANGTY0110]TVEAFAFDPA0111]801TGATYDADTTGATITVNQPPAAKYGDIVTKNTVITVNGTT0112]YTVPAPDASG0113]851HYPSGTNISIAPGDTVTIQTTFANVSSTDALQNGLIDMEV0114]DGQNGAIFQK0115]901YffPSTTLLPGQTETVTATffQVPSSVSAGTYPLNFQAFDTS0116]NWTGNCYFTN0117]951GGWNFWN0118]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，SEQIDN0:307可被糖基化SEQIDN0:307可至少在174、193、297、393和404位被糖基化c關(guān)于本發(fā)明，從極端微生物分離的新酶具有包括如下所示SEQIDNO326的N端序列DWSTPISMEIQV。要注意該酶的N端序列與SEQIDNO307的第44_56位對(duì)齊/對(duì)應(yīng)。在本發(fā)明中，本發(fā)明所涵蓋的從極端微生物分離的酶包括在以下提供的SEQIDNO327中所見的酶QASSSIVGNALAQAASLSPTISAYLRQNGLSPSDLARTWSSYYCTQFDDPQGAAQTALATRICNDQALGGGAPTASATITVNTAAR。應(yīng)理解該SEQIDNO327與SEQIDNO307中所見celB序列的第166-248位對(duì)齊/對(duì)應(yīng)。應(yīng)注意，SEQIDNO327包括分別在第207、208、212、229和231位上的變化的氨基酸和在第209、213和230位上的添加的氨基酸。在本發(fā)明中，可通過研究以下的SEQIDNO:328進(jìn)一步鑒定和最好地了解本發(fā)明的所述酶GLNAAVWDSGLNSQTVISEVQALHPALIRWPGGSISDMDYNWETNTR應(yīng)理解SEQIDNO328與SEQIDNO307的第258-304位對(duì)齊/對(duì)應(yīng)。應(yīng)注意到SEQIDNO:328在第295位有變化的氨基酸，且在第296位有附加的氨基酸。在本發(fā)明中，本發(fā)明所涵蓋的酶進(jìn)一步包括如下所見的SEQIDNO329EADDHAVPNQPQKGNPGLSPQAYAQNALQFMQSPWYYR。SEQIDNO329與SEQIDNO307的第379-415位對(duì)齊/對(duì)應(yīng)。應(yīng)理解，相對(duì)于之前的SEQIDN0:307，該SEQIDNO:329分別在第409、411和413位的氨基酸有變化。更進(jìn)一步地，附加的氨基酸分別位于第412、414和415位。在上文提到的對(duì)Eckert和Schneider的現(xiàn)有技術(shù)參考中，可以看出為了確定具有多糖降解活性的細(xì)胞外嗜熱嗜酸酶類的存在，已經(jīng)對(duì)酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(ATCC27009)進(jìn)行了研究。作者提到發(fā)現(xiàn)生物利用多種多糖(包括木聚糖)作為唯一的碳源和能源。然而，作者未能檢測(cè)到培養(yǎng)物上清液中的木聚糖酶活性。作者假定細(xì)胞相關(guān)酶并成功地用TritonX-100從完整細(xì)胞中提取了具有相關(guān)木聚糖降解活性的纖維素降解活性。作者觀察到即使在培養(yǎng)物到了生長(zhǎng)穩(wěn)定期之后，纖維素降解活性及其相關(guān)的木聚糖酶活性仍保持與細(xì)胞結(jié)合。相反，從本發(fā)明的極端微生物分離的，在溫度等于或高于80°C和pH低于2時(shí)顯示最佳酶活性的酶被認(rèn)為是水溶性的，并且還已經(jīng)從細(xì)胞上清液分離。本發(fā)明還指向一種制備半纖維素酶的方法，所述方法包括以下步驟提供酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(ATCC27009)源；在有上清液的微生物營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(ATCC27009)；從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上清液中分離酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌的細(xì)胞；以及從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上清液回收并純化來源于酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(ATCC27009)的半纖維素酶。所述方法產(chǎn)生水溶性半纖維素酶，此酶在PH低于約2和溫度高于約80°C時(shí)顯示顯著的酶活性。在所述方法中，半纖維素酶包括如SEQID而5:326、327、328和/或329中描述的序列。更進(jìn)一步地，在所述方法中，所用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)一步包括約lg/L的木聚糖、約IOmM的NH4Clj^5.2mM的Κ2ΗΡ04、約0.8mM的MgS04_7H20、約1.74mM的Na2S04、約25mg/L的MgCl2、約6.6mg/L的CaCl2、約2.Omg/L的MnSO4、約0.5mg/L的ZnSO4、約0.5mg/L的硼酸、約5mg/L的FeCl3、約0.15mg/L的CuS04、約0.025mg/L的NaMo04、約0.05mg/L的CoN03、約0.02mg/L的NiCl2、約0.08mg/L的鹽酸吡哆辛、約0.01mg/L的葉酸、約0.lmg/L的鹽酸硫胺素、約0.04mg/L的核黃素、約0.08mg/L的煙酰胺、約0.08mg/L的對(duì)氨基苯甲酸酯、約0.Olmg/L的生物素、約0.0004mg/L的氰鈷胺素、約0.08mg/L的D-泛酸鈣、約0.02mg/L的肌醇、約0.05mg/L的溴化膽堿、約0.02mg/L的乳清酸鈉和約0.lmg/L的亞精胺，其中所得到的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基調(diào)至pH約為3.5。如本申請(qǐng)之前所討論的，該酶可用于各種過程。因此，如上所述方法包括以下步驟為同時(shí)糖化和發(fā)酵過程提供回收并純化的半纖維素酶以便使生物質(zhì)多糖轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物。使用上文提到的酶的過程包括用回收并純化的半纖維素酶或粗酶制劑預(yù)處理生物質(zhì)漿料的步驟以降解生物質(zhì)漿料中存在的低聚物和/或多糖而生成終產(chǎn)物，該粗酶制劑由含有大部分由半纖維素酶組成的蛋白質(zhì)的生物制得?？刹捎檬褂蒙衔乃雒傅钠渌赡芊椒?。例如，從極端微生物分離的酶可用于水解多糖的方法中，所述方法包括以下步驟提供來源于極端微生物的水溶性半纖維素酶；和在PH低于約2時(shí)用水溶性半纖維素酶對(duì)多糖進(jìn)行水解。正如之前所討論的，水溶性半纖維素酶在約80°C的溫度下有最佳酶活性。操作本發(fā)明的所述實(shí)施方案的操作被認(rèn)為是顯而易見的，就此進(jìn)行簡(jiǎn)單概述。正如所述，通過分別研究SEQIDNOS:327_329最好了解從極端微生物分離的在溫度為約80°C和pH低于約2時(shí)顯示最佳酶活性的酶。已分離的酶用于處理生物質(zhì)的方法中，所述方法包括以下步驟提供具有生物質(zhì)糖的生物質(zhì)源；用來源于酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(ATCC27009)的水溶性半纖維素酶預(yù)處理生物質(zhì)以產(chǎn)生終產(chǎn)物。在該方法中，生物質(zhì)糖包含多糖，而半纖維素酶水解多糖。如上文所討論的，半纖維素酶在PH低于約2和溫度高于約80°C時(shí)顯示酶活性。如本發(fā)明所涵蓋的半纖維素酶的分子量約為120kDa。在上文所述的方法中，該方法包括附加步驟在有或無半纖維素酶存在下預(yù)處理生物質(zhì)；提供相繼水解和發(fā)酵過程以將生物質(zhì)糖轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物；以及向相繼水解和發(fā)酵過程供給半纖維素酶以便使生物質(zhì)糖轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物。在如上文所討論的可在有或無半纖維素酶存在下以更低的嚴(yán)格程度進(jìn)行的預(yù)處理生物質(zhì)的步驟之后，所述方法包括另一步驟提供同時(shí)糖化和發(fā)酵過程以將生物質(zhì)糖轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物；和向同時(shí)糖化和發(fā)酵過程供給半纖維素酶以便使生物質(zhì)糖轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物。因此，可見上文所述酶和方法避免了在此之前采用的現(xiàn)有技術(shù)酶和實(shí)踐帶有的許多缺點(diǎn)，進(jìn)一步提供產(chǎn)生各種所需終產(chǎn)物而同時(shí)降低預(yù)處理步驟的嚴(yán)格程度的便利方法，該預(yù)處理步驟傾向于產(chǎn)生多種有害廢物以及因需要高溫、高壓和大量酸而增加整個(gè)過程的成本從而達(dá)到高預(yù)處理嚴(yán)格程度。本發(fā)明的實(shí)施方案包括翻譯后修飾蛋白質(zhì)的方法。在某些實(shí)施方案中，可用分離的或部分純化的糖基轉(zhuǎn)移酶和/或翻譯后修飾蛋白、包含糖基轉(zhuǎn)移酶和/或翻譯后修飾蛋白的細(xì)胞提取物和/或在包含一種或多種糖基轉(zhuǎn)移酶和/或翻譯后修飾蛋白的細(xì)胞中進(jìn)行翻譯后修飾。糖基轉(zhuǎn)移酶和/或翻譯后修飾蛋白可為(不限于)以下種類UDPβ-葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶、多萜醇磷酸甘露糖轉(zhuǎn)移酶和糖基轉(zhuǎn)移酶。在某些實(shí)施方案中，糖基轉(zhuǎn)移酶和/或翻譯后修飾蛋白可為嗜熱嗜酸生物的糖基轉(zhuǎn)移酶和/或翻譯后修飾蛋白。嗜熱嗜酸菌的實(shí)例包括但不限于酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌和那些屬于酸菌屬(Acidianus)、脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)、除硫葉菌屬(Desulfurolobus)、憎葉菌屬(Stygiolobus)、硫化葉菌屬(Sulfolobus)、硫代謝球菌屬(Sulfurisphaera)、硫磺球形菌屬(Sulfurococcus)、熱原體屬(Thermoplasma)、嗜苦菌屬(Picrophilus)的生物。糖基轉(zhuǎn)移酶和/或翻譯后修飾蛋白的實(shí)例包括但不限于SEQIDNOS:1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273和290所提供的糖基轉(zhuǎn)移酶和/或翻譯后修飾蛋白，以及可從NCBI購買的登記號(hào)為XP_002490630.1、Q54IL5.1、ABN66322.2、XP_002493240.1、XP_002491463.1、XP_002491326.1、CAY71061.1、NP_344219.1、NP_343051.1、ACR41289.1、ACP37471.1、NP_111396.1、NP_111382.1、NP_394039.1、NP_394183.1、YP_023099.1、P_023093.1、AAT43750.1和AAT42890.1的糖基轉(zhuǎn)移酶和/或翻譯后修飾蛋白。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括根據(jù)本發(fā)明的方法糖基化的蛋白質(zhì)。此類蛋白質(zhì)的實(shí)例包括但不限于糖基化形式的蛋白質(zhì)SEQIDNOS:307、331、333、335、337和338。本發(fā)明的實(shí)施方案包括改變來自嗜熱嗜酸菌的內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶的物理和/或動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的方法。在某些實(shí)施方案中，通過內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶的翻譯后修飾來改變來自嗜熱嗜酸菌的內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶的纖維素酶活性與木聚糖酶活性比。在一些實(shí)施方案中，翻譯后修飾可為糖基化。在更多的實(shí)施方案中，通過內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶的翻譯后修飾來改變來自嗜熱嗜酸菌的內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶的溶解性。在一些實(shí)施方案中，內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶為酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶。在更多的實(shí)施方案中，內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶為celB(SEQIDNO307)。本發(fā)明的實(shí)施方案包括通過SEQIDNO:307的糖基化來改變SEQIDN0:307的纖維素酶活性與木聚糖酶活性之比。(作為非限制性實(shí)例)可通過在能夠糖基化SEQIDNO307的生物中表達(dá)編碼SEQIDNO307的序列、使SEQIDNO307與有糖基化活性的酶或產(chǎn)生有糖基化活性的酶的細(xì)胞接觸或現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法來進(jìn)行SEQIDN0:307的糖基化。在本發(fā)明更多的實(shí)施方案中，內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶的纖維素酶活性與木聚糖酶活性之比可根據(jù)翻譯后修飾的程度和位置而改變。在一些實(shí)施方案中，(作為非限制性實(shí)例)可通過利用有糖基化活性的不同酶、能夠使蛋白質(zhì)糖基化的不同細(xì)胞、糖基化的不同化學(xué)方法，和/或改變糖基化活性的量或與內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶接觸的時(shí)間來操縱翻譯后修飾的程度和位置。在一些實(shí)施方案中，內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶的翻譯后修飾引起在酸性PH下木聚糖酶活性升高。在一些實(shí)施方案中，(作為非限制性實(shí)例)在PH低于約5，pH約為5、3.5和2時(shí)，與未修飾形式的內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶相比，修飾形式的內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶的木聚糖酶活性升高。在一些實(shí)施方案中，內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶的翻譯后修飾引起在酸性pH下更高的溶解性。在一些實(shí)施方案中，(作為非限制性實(shí)例)在PH低于約5，pH約為5、3.5和2時(shí)，修飾形式的內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶比未修飾形式的內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶更易溶。本發(fā)明的實(shí)施方案包括與嗜熱嗜酸菌酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌的蛋白質(zhì)的糖基化和/或翻譯后修飾有關(guān)的基因和相關(guān)蛋白質(zhì)。由通過對(duì)酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌的基因組測(cè)序產(chǎn)生的序列信息確定與這些過程有關(guān)的基因的編碼序列。這些基因和蛋白質(zhì)可代表酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌或其它生物的代謝工程的目標(biāo)。表1中列出了在酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌的基因組中發(fā)現(xiàn)的核苷酸序列及由其編碼的與蛋白質(zhì)的糖基化和/或翻譯后修飾相關(guān)的氨基酸的非限制性實(shí)例。糖基轉(zhuǎn)移酶和/或翻譯后修飾蛋白可為(不限于)以下種類UDPi3_葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶、多萜醇磷酸甘露糖轉(zhuǎn)移酶和糖基轉(zhuǎn)移酶等等。本發(fā)明的實(shí)施方案部分涉及包括酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌的基因和/或蛋白質(zhì)在內(nèi)的基因序列和/或蛋白質(zhì)序列。所包括的基因和蛋白質(zhì)為在蛋白質(zhì)的糖基化和/或翻譯后修飾中起作用的那些。事實(shí)上胞內(nèi)酶活性可為嗜熱的和/或嗜酸的，并且文獻(xiàn)中描述了類似基因的一般實(shí)例?；?、序列、酶和因子的種類包括但不限于表1所列的那些。權(quán)利要求1.一種分離的和/或純化的糖基化蛋白，其中所述糖基化蛋白包括SEQIDN0:307。2.一種改變極端酶的酶活性的方法，所述方法包括使所述極端酶與能夠使所述極端酶糖基化的分離的和/或純化的酶或化學(xué)體系進(jìn)行流體接觸；以及使所述極端酶糖基化。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中從生物中分離和/或純化能夠使所述極端酶糖基化的所述分離的和/或純化的酶。4.根據(jù)權(quán)利要求3、9、10、13、18和22任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物選自酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)禾口畢赤酵母(Pichiapastoris)。5.根據(jù)權(quán)利要求2、9和10任一項(xiàng)所述的方法，其中所述極端酶為嗜熱嗜酸菌的極端酶。6.根據(jù)權(quán)利要求2、9和10任一項(xiàng)所述的方法，其中所述極端酶選自SEQIDNOS:307、337和338。7.根據(jù)權(quán)利要求2、9和10任一項(xiàng)所述的方法，其中與非糖基化形式的極端酶相比，所述極端酶具有改變的纖維素酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶活性。8.根據(jù)權(quán)利要求2、9和10任一項(xiàng)所述的方法，其中在選自低于約5、約3.5和約2的PH下，或在選自低于約900C、約800C、約700C、約600C和約500C的溫度下，與非糖基化形式的極端酶相比，所述糖基化極端酶具有改變的纖維素酶、木聚糖酶或木糖苷酶活性。9.一種改變極端酶的酶活性的方法，所述方法包括使所述極端酶與能夠使所述極端酶糖基化的生物細(xì)胞提取物進(jìn)行流體接觸；以及使所述極端酶糖基化。10.一種改變極端酶的酶活性的方法，所述方法包括為能夠表達(dá)所述極端酶并使所述極端酶糖基化的生物提供編碼所述極端酶的核酸；以及由所述生物產(chǎn)生糖基化形式的極端酶。11.根據(jù)權(quán)利要求10和22任一項(xiàng)所述的方法，其中所述編碼蛋白質(zhì)的核酸進(jìn)一步包含分泌信號(hào)。12.一種通過根據(jù)權(quán)利要求2、9和10任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的分離的和/或純化的極端酶。13.一種翻譯后修飾目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括使目標(biāo)蛋白質(zhì)與從能夠使所述目標(biāo)蛋白質(zhì)糖基化的生物分離的糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行流體接觸。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述糖基轉(zhuǎn)移酶選自SEQIDNOS:1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290的糖基轉(zhuǎn)移酶。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)為極端酶。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述極端酶選自SEQIDNOS:307、331、333、335,337和338。17.根據(jù)權(quán)利要求13、18和22任一項(xiàng)所述的方法，其中所述翻譯后修飾包括糖基化。18.—種翻譯后修飾目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括使目標(biāo)蛋白質(zhì)與嗜熱嗜酸生物的細(xì)胞提取物進(jìn)行流體接觸。19.根據(jù)權(quán)利要求18和22任一項(xiàng)所述的方法，其中所述嗜熱嗜酸生物為酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌。20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)為嗜熱嗜酸菌的酶。21.根據(jù)權(quán)利要求18和22任一項(xiàng)所述的方法，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)選自SEQIDNOS307、331、333、335、337和338。22.一種使目標(biāo)蛋白質(zhì)糖基化的方法，所述方法包括為嗜熱嗜酸生物提供編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸；以及在所述嗜熱嗜酸生物中產(chǎn)生所述目標(biāo)蛋白質(zhì)。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)為嗜熱嗜酸菌的內(nèi)切葡聚糖酶和/或木聚糖酶。24.一種通過根據(jù)權(quán)利要求13、18和22所述的方法的任意一種產(chǎn)生的分離的和/或純化的蛋白質(zhì)。25.一種分離的和/或純化的糖基化蛋白，其中所述蛋白選自SEQIDNOS:307,331,333、335、337和338。全文摘要本發(fā)明的實(shí)施方案包括通過使用分離的或部分純化的糖基轉(zhuǎn)移酶和/或翻譯后修飾蛋白、包含糖基轉(zhuǎn)移酶和/或翻譯后修飾蛋白的細(xì)胞提取物和/或在包含一種或多種糖基轉(zhuǎn)移酶和/或翻譯后修飾蛋白的細(xì)胞中改變極端酶的酶活性或溶解性或翻譯后修飾目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法。文檔編號(hào)C07K14/195GK102317309SQ201080008795公開日2012年1月11日申請(qǐng)日期2010年2月26日優(yōu)先權(quán)日2009年2月26日發(fā)明者D·N·湯普森,D·W·瑞德,J·A·萊西,V·S·湯普森,W·A·阿佩爾申請(qǐng)人:巴特勒能源同盟有限公司