專利名稱：方法
方法
技 術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的合成和修飾。具體地，本發(fā)明涉及賴氨酸連接的蛋白質(zhì)的修飾。
背景技術(shù)：
賴氨酸殘基是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的關(guān)鍵決定因素，它們在主要的翻譯后修飾如泛素化、甲基化和乙?；械淖饔靡褳槿耸熘Ｈ欢?，選擇性地修飾蛋白質(zhì)中的特定賴氨酸殘基仍是一個問題。泛素化是一個可逆的翻譯后修飾，在該過程中受體蛋白中的特定賴氨酸殘基與泛素供體的C-末端形成異肽鍵。雖然泛素化通過蛋白酶體靶向來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的作用是公認(rèn)的，但目前顯示泛素參與生物學(xué)的幾乎每一個方面，包括細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和對DNA損傷的應(yīng)答W。泛素通過它的每個賴氨酸殘基(K6、K11、K27、K29、K33、K48或K63)或通過N-末端形成共價(jià)鏈，并且認(rèn)為泛素在不同的生物過程中介導(dǎo)的不同功能可能被編碼在不同泛素鏈的不同性質(zhì)中2’3。雖然蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示體內(nèi)存在所有的鏈類型4’5，但所知的多數(shù)均與K48鏈和K63鏈有關(guān)，這兩個鏈分別在蛋白酶體降解和細(xì)胞信號傳導(dǎo)中起重要作用w。相比之下，對其他所謂的“非典型”連接(linkage)知之甚少，而這些“非典型”連接則占在蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)已知的模式生物中發(fā)現(xiàn)的泛素連接的一半以上5。研究具體泛素鏈的作用的關(guān)鍵難題在于合成具有所定義的連接的均質(zhì)鏈。本發(fā)明旨在克服與現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的問題。發(fā)明概述本發(fā)明人已經(jīng)解決了特異靶向多肽鏈內(nèi)用于修飾的單個賴氨酸殘基的問題，其中一方面是在基因工程上編碼用于目標(biāo)賴氨酸的化學(xué)保護(hù)。這能夠?qū)崿F(xiàn)多肽鏈內(nèi)特定殘基的位點(diǎn)特異性保護(hù)。更重要的是，本發(fā)明人開發(fā)了用于差異保護(hù)多肽中的賴氨酸的技術(shù)。具體而言，本發(fā)明人教導(dǎo)了不同于基因工程編碼的保護(hù)的化學(xué)保護(hù)的使用。通過這種方式，產(chǎn)生的多肽可具有受通過目標(biāo)賴氨酸的基因工程編碼保護(hù)的位點(diǎn)特異性保護(hù)的所述目標(biāo)賴氨酸。然后，這種具有受位點(diǎn)特異性保護(hù)的賴氨酸的多肽可以進(jìn)行化學(xué)處理以保護(hù)每個剩余的(未被保護(hù)的)具有不同化學(xué)保護(hù)基團(tuán)的賴氨酸殘基。這種雙重方法具有的優(yōu)點(diǎn)是形成的多肽在其賴氨酸上具有兩種不同類型的化學(xué)保護(hù)。這能夠使原始的目標(biāo)賴氨酸通過化學(xué)被選擇性地去保護(hù)，同時使其他賴氨酸上的其他保護(hù)基團(tuán)保持完整。通過這種方式，目標(biāo)賴氨酸被位點(diǎn)特異地的去保護(hù)并因此可以被修飾，而其他賴氨酸則不受影響。最后，根據(jù)需要所有未被修飾的賴氨酸都可以被任選地去保護(hù)以留下與天然相同的賴氨酸殘基。本發(fā)明是基于選擇性的保護(hù)/去保護(hù)多肽序列中的目標(biāo)賴氨酸的創(chuàng)造性的差異化學(xué)方法。因此，一方面，本發(fā)明提供了修飾包含至少兩個賴氨酸殘基的多肽中的特定賴氨酸殘基的方法，所述方法包括(a)提供包含受第一保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的目標(biāo)賴氨酸殘基和至少一個另外的賴氨酸殘基的多妝；(b)處理所述多肽以保護(hù)所述另外的賴氨酸殘基，其中所述另外的賴氨酸殘基的保護(hù)基團(tuán)不同于所述目標(biāo)賴氨酸殘基的保護(hù)基團(tuán)；(C)選擇性地去保護(hù)目標(biāo)賴氨酸殘基；和
(d)修飾(C)的所述去保護(hù)了的賴氨酸殘基。合適地，所述多肽的產(chǎn)生包括(i)提供編碼所述多肽的核酸，所述核酸包含編碼所述目標(biāo)賴氨酸的正交密碼子;(ii)在正交tRNA合成酶/tRNA對存在下翻譯所述核酸，其中所述正交tRNA合成酶/tRNA對能夠識別所述正交密碼子并向所述多肽鏈中引入受第一保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的所述目標(biāo)賴氨酸殘基。合適地，所述正交密碼子包括TAG，所述tRNA包括MbtRNAatt,所述tRNA合成酶包括 MbPyIRS。合適地，由第一保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的所述目標(biāo)賴氨酸殘基選自由N ε -(叔丁氧基羰基)-L-賴氨酸組成的組。合適地，由第一保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的所述目標(biāo)賴氨酸殘基是N ε_(叔丁氧基羰基)-L-賴氨酸。合適地，所述另外的賴氨酸殘基的保護(hù)基團(tuán)選自N-(芐氧基羰基氧基)琥珀酰亞胺(Cbz-Osu)。當(dāng)所述另外的賴氨酸殘基的保護(hù)基團(tuán)是N-(芐氧基羰基氧基)琥珀酰亞胺(Cbz-Osu)時，合適地，它在堿性DMSO中提供。合適地，所述另外的賴氨酸殘基的保護(hù)基團(tuán)是N-(芐氧基羰基氧基)琥珀酰亞胺(Cbz-Osu)。合適地，步驟(b)包括用含N-(芐氧基羰基氧基)琥珀酰亞胺(Cbz-Osu)的堿性DMSO處理所述多肽。合適地，所用的Cbz-Osu的量計(jì)算為[與被處理的多肽的量相當(dāng)?shù)哪柫縘乘以[多肽中待保護(hù)的賴氨酸數(shù)目加I]。有利地，這提供了用于與待保護(hù)的賴氨酸反應(yīng)的略過量的保護(hù)基團(tuán)，并由此有助于推動反應(yīng)完全(飽和度/均勻性)。合適地，步驟(C)包括用含三氟乙酸(TFA)的水處理所述多肽。合適地，步驟(d)的修飾包括(i)通過在Ag (I)存在下轉(zhuǎn)換成N-羥基琥珀酰亞胺酯而活化硫酯；(ii)將待連接的多肽加入至所述目標(biāo)賴氨酸；和(iii)溫育以形成特異的異肽鍵。合適地，步驟(d)的修飾在目標(biāo)賴氨酸殘基的ε -氨基基團(tuán)上進(jìn)行。合適地，在步驟(d)中可對目標(biāo)賴氨酸進(jìn)行多個修飾。合適地，如上所述的方法另外包括步驟(e):使所述另外的賴氨酸殘基去保護(hù)。合適地，步驟(e)包括用比例為1:3:6的三氟甲磺酸(TFMSA):三氟乙酸(TFA) : 二甲基硫醚(DMS)的混合物處理所述多肽。修飾完成后去保護(hù)所有剩余的賴氨酸的好處之一是將所述多肽恢復(fù)至與其天然形式盡可能接近。合適地，步驟(a)包括通過在所述多肽的翻譯過程中從基因工程學(xué)上向所述多肽鏈中引入受第一保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的所述目標(biāo)賴氨酸殘基而產(chǎn)生所述多肽。合適地，所述多肽是泛素。合適地，步驟(d)的修飾是另外的多肽鏈與所述目標(biāo)賴氨酸的共價(jià)連接。合適地，所述另外的多肽鏈?zhǔn)欠核亍Ｔ谠搶?shí)施方式中，本發(fā)明可有利地應(yīng)用于多肽的泛素化。在一些實(shí)施方式中，所述多肽是泛素，所述另外的多肽鏈?zhǔn)欠核?。在這些實(shí)施方式中，本發(fā)明可有利地應(yīng)用于泛素鏈的生產(chǎn)。這些鏈可以簡單地通過在第一多肽中選擇適當(dāng)·的賴氨酸殘基進(jìn)行靶向而以泛素的任何K-連接形式(如K6、K11、K27、K29、K33、K48或Κ63連接的泛素)產(chǎn)生。在進(jìn)行多個修飾時，可重復(fù)步驟(c)-(d)以產(chǎn)生由通過賴氨酸殘基的共價(jià)連接而連接的多肽鏈。顯然，這可能包括在每輪修飾結(jié)束時且在按修飾順序的下一反應(yīng)進(jìn)行前的重復(fù)去保護(hù)?；蛘?，如果用于后續(xù)修飾的反應(yīng)化學(xué)已經(jīng)特異于來自前(幾)輪修飾的目標(biāo)賴氨酸(或經(jīng)修飾的目標(biāo)賴氨酸)，則后續(xù)的修飾可能不需要保護(hù)/去保護(hù)。本發(fā)明還提供了根據(jù)上述產(chǎn)生的多肽。所述多肽可包括K-連接的泛素鏈。所述K-連接可以是Κ6、Κ11、Κ27、Κ29、Κ33、Κ48或Κ63連接。合適地，所述K-連接是Κ6或Κ29連接。另一方面，本發(fā)明涉及TRABID作為Κ29去泛素化酶的應(yīng)用。另一方面，本發(fā)明涉及切割Κ29連接的泛素的方法，所述方法包括使Κ29連接的泛素與TRABID接觸。另一方面，本發(fā)明涉及包含至少一個受保護(hù)的賴氨酸殘基的泛素多肽。泛素多肽包含一個或多個K6Boc、K29Boc。另一方面，本發(fā)明涉及編碼泛素的核酸，其中在所述泛素中至少一個賴氨酸密碼子被正交密碼子替代。另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的K-連接泛素用于例如活化或增強(qiáng)對DNA損傷的響應(yīng)，和/或用于預(yù)防或治療諸如早發(fā)型乳腺癌或卵巢癌的癌癥中的應(yīng)用。這些應(yīng)用可有利地用于藥物中。本發(fā)明優(yōu)選的方法也可在以下說明書中稱為G0PAL(基因工程上編碼的正交保護(hù)和活性連接)。合適地，本發(fā)明方法中的靶向反應(yīng)用于將蛋白質(zhì)連接在一起。在本發(fā)明的另一方面，提供了可從所述方法獲得的蛋白質(zhì)。合適地，所述蛋白質(zhì)是泛素。在本發(fā)明的另一方面，提供了均勻連接的泛素鏈，其中所述泛素多肽通過第6位的賴氨酸殘基和C-末端而連接。所述泛素鏈用于活化或增強(qiáng)對DNA損傷的響應(yīng)，并因此用于預(yù)防或治療癌癥。


以下根據(jù)附圖對本發(fā)明進(jìn)行描述圖I :用于位點(diǎn)特異性異肽鍵形成的GOPAL策略，例示了用于K6-連接非雙泛素的合成的GOPAL策略。I為N ε -(叔丁氧基擬基)-L-賴氨酸,顯不為藍(lán)色。Cbz-Osu為N-(節(jié)氧基羰基)琥珀酰亞胺，其與蛋白質(zhì)中賴氨酸的N ε -胺反應(yīng)，產(chǎn)生N ε -(芐氧基羰基)_L_賴氨酸。TFA為三氟乙酸，DIEA為N，N-二異丙基乙胺，DMSO為二甲基亞砜，HOSu為N-(羥基)琥珀酰亞胺，TFMSA為三氟甲磺酸，DMS為二甲基硫。圖2 :用UCH-L3切割UbBocK6_His6的六組氨酸標(biāo)簽。圖3 :用于形成異肽鍵的供體和受體泛素反應(yīng)伴侶的表征。A.受體泛素的電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)。在第6位通過基因工程引入I的泛素(UbBocK6，綠色，i)。用UCH-L3去除UbBocK6-his6中的C-末端His標(biāo)簽(所觀察的質(zhì)量=866 a,所計(jì)算的質(zhì)量=866 a),ia為Na+加合物。藍(lán)色的ESI-MS圖譜顯示UbBocK6，其中的游離胺(amine)已經(jīng)用Cbz進(jìn)行了化學(xué)保護(hù)，并且I在第6位的保護(hù)基團(tuán)Boc已被選擇性地去保護(hù)。ii為UbK6 (Cbz7)，所觀察的質(zhì)量=9501. 5Da ;所計(jì)算的質(zhì)量=9503Da ;iia 為 UbK6 (Cbz7) +Na+。iii 為 UbK6 (Cbz8)，所觀察的質(zhì)量=9636. 5Da ;所計(jì)算的質(zhì)量=9637Da ;iiia為UbK6 (Cbz8) +Na+。iia和iia分別對應(yīng)于少量的UbBocK6 (Cbz7)和UbBoc6 (Cbz8)，它們由TFA對I中Boc基團(tuán)的不完全去保護(hù)而產(chǎn)生。B.純化的泛素-MES硫酯(UbSR，橙色，i)。所觀察的質(zhì)量=8690Da，所計(jì)算的質(zhì)量=8689Da。藍(lán)色的ESI-MS圖譜代表其中的游離胺已經(jīng)用Cbz保護(hù)基團(tuán)化學(xué)保護(hù)的UbSR。ii為UbSR(Cbz8)，所觀察的質(zhì)量=9760Da，所計(jì)算的質(zhì)量=976IDa ;iii為UbSR(Cbz9)，所觀察的質(zhì)量=98%Da,所計(jì)算的質(zhì)量=98%Da。圖4:K6-連接和K29-連接的雙泛素的合成、純化和表征。A. UbBocK6 (Cbz7_8)和UbSR (Cbz7_8)之間的異肽形成反應(yīng)的SDS-PAGE分析。泳道M，寬范圍的分子量標(biāo)記(Bio-Rad);泳道i，濃度經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的UbSR (Cbz7_8)上樣；泳道ii，濃度經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的UbK6 (Cbz7_8)上樣；泳道iii，16小時后的K6異肽鍵形成反應(yīng)混合物。B. MonoS陽離子交換色譜后純UbK62的洗脫部分。C.純化的K6-連接的雙泛素(UbK62)的ESI-MS分析證實(shí)了異肽鍵的形成(所觀察的質(zhì)量=17113Da，所計(jì)算的質(zhì)量=17112Da)。D.純化的K29-連接的雙泛素(UbK292)的ESI-MS分析。i為異肽鍵的形成(所觀察的質(zhì)量=17111Da，所計(jì)算的質(zhì)量=17112Da) ;ii為硝酸鹽(所觀察的質(zhì)量=17174Da，所計(jì)算的質(zhì)量=17175Da)。E.胰蛋白酶酶解的MS/MS圖譜證實(shí)在純化的K6-連接的雙泛素樣品中K6是異肽鍵形成的位點(diǎn)。肽MQIFVK (GG) TLTGK含有兩個來自與受體泛素連接的供體泛素的甘氨酸殘基。F.肽AK (GG)IQDKEGIPPDQQR的胰蛋白酶酶解的MS/MS圖譜證實(shí)了在純化的K29-連接的雙泛素樣品中K29是異肽鍵形成的位點(diǎn)。圖5 (UbK6)2的純化。A.粗的重折疊(UbK6)2的第一輪離子交換色譜。緩沖液A為pH 4. 5的NH40Ac。緩沖液B為pH 4. 5的NH4OAcUM NaCl。B.第二輪離子交換色譜，產(chǎn)生純的K6-連接的雙泛素。緩沖液A為pH 4. 5的NH40Ac。緩沖液B為pH 4. 5的NH4OAc、IM NaCl。圖6 :K6-連接的雙泛素的結(jié)構(gòu)。Α.源自晶體結(jié)構(gòu)的緊湊的Κ6-連接的雙泛素分子的兩個視圖，卡通圖中關(guān)鍵殘基用球和棒顯示。遠(yuǎn)端分子(黃色)通過其C-末端與鄰近部分(橙色)的Lys6連接。疏水性表面殘基分別顯示為藍(lán)色(Ile44、Val70)和綠色(Leu8)，并顯示了泛素分子的N-末端和C-末端。B.與A相同視圖的K6-連接的雙泛素分子的表面圖。遠(yuǎn)端分子的暴露出的Ile44和Val70顯示為藍(lán)色。C. K6-連接的二聚體中泛素-泛素界面的近視圖。與A中顏色相同的泛素骨架顯示為寬帶，界面殘基以棍圖顯示。形成近端界面的疏水殘基(Ile44、Val70和Arg42)顯示為藍(lán)色，遠(yuǎn)端界面的疏水殘基(Leu71、Leu8和Ile36)顯示為綠色。Gln49pra^PThr9dist之間的界面氫鍵用灰色虛線表示。D.來自K48-連接的雙泛素結(jié)構(gòu)的遠(yuǎn)端泛素分子(粉紅色，pdb-id Iaar,46)疊加在來自K6-連接的雙泛素的遠(yuǎn)端泛素(黃色/橙色，如A)上。IeuS通常有助于K48-連接的雙泛素中Ile44補(bǔ)丁和大多數(shù)泛素復(fù)合結(jié)構(gòu)的疏水性。K6-連接的雙泛素中Leu8環(huán)的構(gòu)象變化將Leu8從Ile44表面移開，以參與到K6-相互作用中的垂直Ile36表面中。E. K6-、K48-、K63-和線性雙泛素結(jié)構(gòu)的比較。F.由于K6-連接的雙泛素的不對稱界面，使得K6-接觸的擴(kuò)展成為可能。G. K6-連接的泛素六聚體的模建，在該六聚體中，二聚體的近端泛素部分連續(xù)疊加到遠(yuǎn)端泛素上。這表明，延長的K6-連接鏈可以形成具有五倍螺旋軸的螺旋絲。單個泛素分子間沒有碰撞，但在泛素單元的這種排列中，可在鏈中中UB+2ad UB-2之間形成額外界面(在分子C:A和C:E之間為83 A2 )。圖7 =DUB對(UbK6)2、(UbK29)2和(UbK63)2的活性的譜圖。A. K6-連接的雙泛素 (UbK6) 2針對在膠上方顯示的去泛素化酶作圖。10分鐘和60分鐘后通過SDS-PAGE分析樣品。去泛素化酶家族如膠上方所示。去泛素化酶實(shí)驗(yàn)如前所述7。3yg雙泛素和所示的去泛素化酶在30 μ L反應(yīng)體系中溫育。終止反應(yīng)并上樣到SDS-PAGE膠上以從雙泛素中分離由去泛素化酶介導(dǎo)的切割產(chǎn)生的單泛素(Ub)。對于高活性的USP2、USP5和USP21DUB，每個反應(yīng)使用O. 2 μ g的酶。使用O. I μ g Cezanne，其對Kll-連接的雙泛素的完全水解足以(A. Bremm,數(shù)據(jù)未顯示)。對于所有其他DUB，用2 μ g的酶。B和C. K29-連接的和K63-連接的雙泛素各自對與K6實(shí)驗(yàn)中同樣的去泛素化酶作圖。圖8 :顯示位點(diǎn)特異性異肽鍵形成的GOPAL策略，例示了 K6-連接的雙泛素的合成。I為N ε -(叔丁氧基擬基)-L-賴氨酸,顯不為藍(lán)色。Cbz-Osu為N-(節(jié)氧基擬基)玻珀酰亞胺，其與蛋白質(zhì)中賴氨酸的N ε -胺反應(yīng)產(chǎn)生N ε -(芐氧基羰基)-L-賴氨酸。TFA為三氟乙酸，DIEA為N，N- 二異丙基乙胺，HOSu為N-(羥基)琥珀酰亞胺，TFMSA為三氟甲磺酸。圖9 Lys6-連接和Lys29_連接的泛素的合成和表征。(a)受體泛素的ESI-MS。在綠色線條中，具有通過基因工程在第6位引入的I的泛素(UbBocLyse)為“I”(所觀察的質(zhì)量=8，665Da，所計(jì)算的質(zhì)量=8，665Da)?！癷a”為Na+加合物。藍(lán)色線條為用Cbz化學(xué)保護(hù)且選擇性地去保護(hù)I中第6位的Boc保護(hù)基團(tuán)后的UbBocLys6?！癷i”為UbLys6 (Cbz7)，所觀察的質(zhì)量=9, 501. 5Da,所計(jì)算的質(zhì)量=9，503Da ;“iia” 為 UbLys6 (Cbz7) +Na+ ；“iii” 為 UbLys6 (Cbz8),所觀察的質(zhì)量=9，636. 5Da,所計(jì)算的質(zhì)量=9，637Da iiia”為 UbLys6 (Cbz8) +Na+ “ii+Boc” 和 “iii+Boc” 分別對應(yīng)于其余的 UbBocLys6 (Cbz7)和UbBocLys6 (Cbz8)的線條。(b)純化的泛素-MES硫酯(UbSR，橙色線條，“ i ” :所觀察的質(zhì)量=8，690Da,所計(jì)算的質(zhì)量=8，689Da)。藍(lán)色線條表示Cbz保護(hù)后的UbSR。“ i i ”為UbSR (Cbz8)，所觀察的質(zhì)量=9，760Da,所計(jì)算的質(zhì)量=9，76IDa ; “ i i i ”為UbSR (Cbz9)，所觀察的質(zhì)量=9，8%0&，所計(jì)算的質(zhì)量=9，8950&。(c)經(jīng)純化的Lys6_連接的雙泛素(UbLys62)的ESI-MS分析表明形成了異肽鍵(所觀察的質(zhì)量=17，113Da，所計(jì)算的質(zhì)量=17，112Da)。(d)純化的Lys29-連接的雙泛素(UbLys292)的ESI-MS分析?！癷”為異肽鍵的形成(所觀察的質(zhì)量=17，lllDa，所計(jì)算的質(zhì)量=17，112Da) ;“^”為似+、1(+加合物(所觀察的質(zhì)量=17，174Da，所計(jì)算的質(zhì)量=17，172Da)。(e、f)胰蛋白酶酶解的MS/MS圖譜證實(shí)了在純化的Lys6和Lys29連接樣品中Lys6和Lys29是異肽鍵形成的位點(diǎn)。diUb :雙泛素。圖10 :Lys6_連接的雙泛素的結(jié)構(gòu)。(a) Lys6_連接的雙泛素的兩個視圖，遠(yuǎn)端分子用黃色表示，近端分子用橙色表示。疏水表面殘基用藍(lán)色(Ile44、Val70)和綠色(Leu8、Ile36、Leu71)表示。異肽連接是具有彈性的，而Gly76則被打亂(見補(bǔ)充圖3a)。(b)Lys6-連接的雙泛素用表面圖表示。遠(yuǎn)端分子的暴露出的Ile44和Val70用藍(lán)色表示。(c)不對稱的Lys6_連接的雙泛素的示意圖。(d)Lys6-連接的雙泛素界面的近視圖。形成近端界面的殘基用藍(lán)色表示，形成遠(yuǎn)端界面的殘基用綠色表示。Gln49pra和Thr9dist之間的界面氫鍵用灰色虛線表示。(e)來自于Lys48_連接的雙泛素結(jié)構(gòu)的遠(yuǎn)端泛素分子(灰色，PDB: Iaar41)疊加在Lys6_連接的雙泛素的遠(yuǎn)端泛素(黃色和橙色，如在a中)上。Lys48_連接的雙泛素中Ile44補(bǔ)丁的Leu8在Lys6-連接的雙泛素中經(jīng)歷了構(gòu)象變化以參與到Ile36表面中和 Lys6- 二聚體界面中。(f)Lys6_、Lysll-(PDB:2xewlI)、Lys48-(PDB: Iaar41)和Lys63-連接的(PDB:2jf5 ;ref. 7)雙泛素和線性雙泛素(PDB:2w9n7)的結(jié)構(gòu)比較。近端分 子用較淺的顏色顯示，Ile44、Val70和Leu8用藍(lán)色顯示。圖11 :對(UbLys6)2, (UbLys29)2^P (UbLys63)2的去泛素化酶活性的譜圖。每個裂解針對在膠上方顯示的去泛素化酶(DUB)作圖。10分鐘和60分鐘后通過SDS-PAGE和銀染分析樣品。去泛素化酶家族如所述去泛素化酶上方所示。去泛素化酶試驗(yàn)如補(bǔ)充方法中所述。整塊凝膠見補(bǔ)充圖4。圖12 :通過定量蛋白質(zhì)印跡測定，(UbLys29)2的TRABID特異性常數(shù)比(UbLys63)2的高40倍。(a)代表性定量蛋白質(zhì)印跡。用反應(yīng)中包含的Alexa-BSA的熒光對上樣量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。上方的兩個印跡為I. 3μ M TRABID，底部印跡為130nM TRABID。Lys29連接上
I.3μΜ TRABID的O時間點(diǎn)泳道來自與其他時間點(diǎn)相同的凝膠，但中間的無關(guān)泳道已經(jīng)被去除。(b、c)用TRABID切割(證1^863)2和(UbLys29)2的至少三次獨(dú)立試驗(yàn)的進(jìn)展曲線用如在補(bǔ)充方法中所描述的方法擬合，以獲得特異性常數(shù)。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。補(bǔ)充圖7中的完整凝膠。Ub，泛素。圖13顯示圖表和照片。圖14顯示PylS序列的比對。圖15顯示PylS序列的序列同一性。圖16顯示PylS序列催化域的比對(從350至480 ;編號按照圖14比對)。圖17顯示PylS序列催化域的序列同一性。圖18顯示基于巴氏甲燒八疊球菌(M. barkeri) PylS或馬氏甲燒八疊球菌(M. mazei)PylS序列的具有移入突變的合成酶的比對。紅色星號表示突變的位置。
具體實(shí)施例方式對于本發(fā)明重要的是多肽中目標(biāo)賴氨酸和其它賴氨酸的保護(hù)基團(tuán)不同。正是通過這些保護(hù)基團(tuán)的化學(xué)差異，差異去保護(hù)化學(xué)可以通過其特異的或選擇性的去保護(hù)和由此的修飾能力來特異地或選擇性地修飾目標(biāo)殘基。
合適地，步驟(d)中期望的反應(yīng)在賴氨酸殘基的ε -氨基上進(jìn)行。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(b)中待保護(hù)的其他賴氨酸側(cè)鏈也是ε -氨基。這種情況下，上述方法也適用于多肽鏈的末端氨基基團(tuán)。在本發(fā)明的方法中，所述基因工程引入優(yōu)選使用正交或擴(kuò)展的遺傳密碼，在所述密碼中，一個或多個特定的正交密碼子已經(jīng)分配而編碼特定的賴氨酸殘基，其中賴氨酸側(cè)基團(tuán)鏈被保護(hù)而使其能夠通過使用正交tRNA合成酶/tRNA對在基因工程學(xué)上被引入。原則上，所述正交tRNA合成酶/tRNA對可以是能夠響應(yīng)正交密碼子而使tRNA裝載受保護(hù)的賴氨酸并能夠?qū)⒃撌鼙Ｗo(hù)的賴氨酸引入到所述多肽鏈中的任何此類對。所述正交密碼子可以是正交的琥拍(amber)密碼子、赭石(ochre)密碼子、乳白 (opal)密碼子或四聯(lián)體密碼子。所述密碼子僅需對應(yīng)于用于攜帶受保護(hù)的賴氨酸分子的正交tRNA。優(yōu)選地，所述正交密碼子是琥珀密碼子。應(yīng)該指出的是，本文所述具體實(shí)例已經(jīng)使用了琥珀密碼子和相應(yīng)的tRNA/tRNA合成酶。如上所述，這些是可變的。或者，為了使用其他密碼子而不影響使用或選擇能夠與受保護(hù)的賴氨酸共同作用的可選tRNA/tRNA合成酶對，tRNA的反密碼子區(qū)可簡單地更換為用于所選密碼子的期望反密碼子區(qū)。所述反密碼子區(qū)既不參與tRNA的攜帶或引入功能也不參與tRNA合成酶的識別，從而使這種互換完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。因此，如果需要，可以使用可選的正交tRNA合成酶/tRNA對。優(yōu)選地，正交合成酶/tRNA對是巴氏甲燒八疊球菌(Methanosarcinabarkeri)MS吡咯賴氨酸t(yī)RNA合成酶(MbPylRS)及其關(guān)連琥珀抑制tRNA (MbtRNAatt)。巴氏甲烷八疊球菌的PylT基因編碼MbtRNAcm tRNA。巴氏甲烷八疊球菌的PylS基因編碼MbPylRS tRNA合成酶蛋白。當(dāng)使用數(shù)字編號提及特定的氨基酸殘基時，所述編號采用MbPylRS (巴氏甲烷八疊球菌吡咯基-tRNA合成酶)的氨基酸序列作為參考序列(即，由可公開獲得的登錄號為Q46E77的野生型巴氏甲烷八疊球菌PylS基因所編碼)MDKKPLDVLI SATGLWMSRT GTLHKIKHYE VSRSKIYIEM ACGDHLVVNNSRSCRTARAF RHHKYRKTCK RCRVSDEDIN NFLTRSTEGK TSVKVKVVSAPKVKKAMPKS VSRAPKPLEN PVSAKASTDT SRSVPSPAKS TPNSPVPTSAPAPSLTRSQL DRVEALLSPE DKISLNIAKP FRELESELVT RRKNDFQRLYTNDREDYLGK LERDITKFFV DRDFLEIKSP ILIPAEYVER MGINNDTELSKQIFRVDKNL CLRPMLAPTL YNYLRKLDRI LPDPIKIFEV GPCYRKESDGKEHLEEFTMV NFCQMGSGCT RENLESLIKE FLDYLEIDFE IVGDSCMVYGDTLDIMHGDL ELSSAVVGPV PLDREffGIDK PffIGAGFGLE RLLKVMHGFKNIKRASRSES YYNGISTNL.所述序列在下面稱為SEQ ID NO. I。如果需要，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過突變MbPylRS tRNA合成酶蛋白來對其進(jìn)行改造，從而針對具有待使用的特定受保護(hù)側(cè)鏈的賴氨酸類別進(jìn)行優(yōu)化。對突變的需求取決于賴氨酸殘基和所用的保護(hù)/掩蔽基團(tuán)(caging group)。不需要突變MbPylRS tRNA合成酶的實(shí)例是在步驟(a)所用的具有受保護(hù)側(cè)鏈的賴氨酸殘基是N ε -(叔丁氧基羰基)-L-賴氨酸的情況?？赡苄枰蛔僊bPylRS tRNA合成酶的實(shí)例是在步驟(a)所用的賴氨酸側(cè)基鏈被較大的化學(xué)基團(tuán)如光不穩(wěn)定的掩蔽基團(tuán)保護(hù)的情況。
這種突變可以通過在MbPylRS tRNA合成酶的一個或多個以下位置引入突變而實(shí)現(xiàn)M241、A267、Y271、L274 和 C313。優(yōu)選地，所述突變可以包括 M241F、A267S、Y271C 和L274M。
tRNA 合成酶本發(fā)明的tRNA合成酶可以為多種。雖然在實(shí)施例中所用的是具體的tRNA合成酶序列，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。原則上，任何一個具有相同tRNA攜帶(氨?；?功能的tRNA合成酶都可應(yīng)用于本發(fā)明。例如，tRNA合成酶可來自諸如古細(xì)菌(archea)的任何合適的物種，如來自巴氏甲燒八疊球菌 MS、巴氏甲燒八疊球菌 str. Fusaro (Methanosarcinabarkeri str. Fusaro)、馬氏甲燒八疊球菌Gol、嗜乙酸甲燒八疊球菌(Methanosarcina acetivorans) C2A、嗜熱甲燒八疊球菌(Methanosarcinathermophila)或布氏擬甲燒球菌(Methanococcoidesbutonii)。或者，tRNA合成酶可來自細(xì)菌，如來自哥本哈根脫亞硫酸桿菌(Desulfitobacteriumhafniense)DCB-2、哥本哈根脫亞硫酸桿菌Y51、哥本哈根脫亞硫酸桿菌 PCPl 和醋酸氧化脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum acetoxidans) DSM 771。來自這些生物體的示范序列是公眾可獲得的序列。提供下面的實(shí)例作為吡咯賴氨酸t(yī)RNA合成酶的示范序列>巴氏甲烷八疊球菌MS/1-419/巴氏甲烷八疊球菌MSVERSION Q6WRH6. IGI:74501411MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIV ⑶ SCMVY ⑶ TUHMHGDLELSSAWGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL>巴氏甲烷八疊球菌F/1-419/巴氏甲燒八疊球菌str. FusaroVERSION ΥΡ_304395· IGI:73668380MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKASTDTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNIAKPFRELESELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRDFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPDPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLESLIKEFLDYLEIDFEIV ⑶ SCMVYGDTUHMHGDLELSSAWGPVPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL>馬氏甲烷八疊球菌/1-454馬氏甲烷八疊球菌GolVERSION ΝΡ_633469· IGI:21227547MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPI LIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL>嗜乙酸甲烷八疊球菌/1-443嗜乙酸甲烷八疊球菌C2AVERSION NP_615128. 2GI:161484944MDKKPLDTLISATGLWMSRTGMIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGERLVVNNSRSSRTARALRHH KYRKTCRHCRVSDEDINNFLTKTSEEKTTVKVKVVSAPRVRKAMPKSVARAPKPLEATAQVPLSGSKPAPATPVSAPAQAPAPSTGSASATSASAQRMANSAAAPAAPVPTSAPALTKGQLDRLEGLLSPKDEISLDSEKPFRELESELLSRRKKDLKRIYAEERENYLGKLEREITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINSDTELSKQVFRIDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLEAIITEFLNHLGIDFEII⑶SCMVYGNTLDVMHDDLELSSAVVGPVPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRAARSESYYNGISTNL>嗜熱甲烷八疊球菌/1-478嗜熱甲烷八疊球菌，VERSIONDQ017250. IGI: 67773308MDKKPLNTLISATGLWMSRTGKLHKIRHHEVSKRKIYIEMECGERLVVNNSRSCRAARALRHHKYRKICKHCRVSDEDLNKFLTRTNEDKSNAKVTVVSAPKIRKVMPKSVARTPKPLENTAPVQTLPSESQPAPTTPISASTTAPASTSTTAPAPASTTAPAPASTTAPASASTTISTSAMPASTSAQGTTKFNYISGGFPRPIPVQASAPALTKSQIDRLQGLLSPKDEISLDSGTPFRKLESELLSRRRKDLKQIYAEEREHYLGKLEREITKFFVDRGFLEIKSPILIPMEYIERMGIDNDKELSKQIFRVDNNFCLRPMLAPNLYNYLRKLNRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLEAIIKDFLDYLGIDFEIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPVPMDRDWGINKPWIGAGFGLERLLKVMHNFKNIKRASRSESYYNGISTNL>布氏擬甲烷球菌/1-416布氏擬甲烷球菌DSM 6242, VERSION YP_566710. IGI :91774018MEKQLLDVLVELNGVWLSRSGLLHGIRNFEITTKHIHIETDCGARFTVRNSRSSRSARSLRHNKYRKPCKRCRPADEQIDRFVKKTFKEKRQTVSVFSSPKKHVPKKPKVAVIKSFSISTPSPKEASVSNSIPTPSISVVKDEVKVPEVKYTPSQIERLKTLMSPDDKIPIQDELPEFKVLEKELIQRRRDDLKKMYEEDREDRLGKLERDITEFFVDRGFLEIKSPIMIPFEYIERMGIDKDDHLNKQIFRVDESMCLRPMLAPCLYNYLRKLDKVLPDPIRIFEIGPCYRKESDGSSHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENMEALIDEFLEHLGIEYEIEADNCMVYGDTIDIMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGVNKPWMGAGFGLERLLKVRHNYTNIRRASRSELYYNGINTNL>哥本哈根脫亞硫酸桿菌_DCB-2/l_279哥本哈根脫亞硫酸桿菌DCB-2VERSION YP_002461289. IGI:219670854 MSSFWTKVQYQRLKELNASGEQLEMGFSDALSRDRAFQGIEHQLMSQGKRHLEQLRTVKHRPALLELEEGLAKALHQQGFVQVVTPTIITKSALAKMTIGEDHPLFSQVFWLDGKKCLRPMLAPNLYTLWRELERLWDKPIRIFEIGTCYRKESQGAQHLNEFTMLNLTELGTPLEERHQRLEDMARWVLEAAGIREFELVTESSVVYGDTVDVMKGDLELASGAMGPHFLDEKWEIVDPWVGLGFGLERLLMIREGTQHVQSMARSLSYLDGVRLNIN
>哥本哈根脫亞硫酸桿菌_Y51/1-312哥本哈根脫亞硫酸桿菌Υ51VERSION YP_521192. IGI:89897705MDRIDHTDSKFVQAGETPVLPATFMFLTRRDPPLSSFWTKVQYQRLKELNASGEQLEMGFSDALSRDRAFQGIEHQLMSQGKRHLEQLRTVKHRPALLELEEGLAKALHQQGFVQVVTPTIITKSALAKMTIGEDHPLFSQVFffLDGKKCLRPMLAPNLYTLWRELERLWDKPIRIFEIGTCYRKESQGAQHLNEFTMLNLTELGTPLEERHQRLEDMARWVLEAAGIREFELVTESSVVYGDTVDVMK⑶LELASGAMGPHFLDEKWEIVDPWVGLGFGLERLLMIREGTQHVQSMARSLSYLDGVRLNIN>哥本哈根脫亞硫酸桿菌PCP1/1-288哥本哈根脫亞硫酸桿菌·
VERSI0NAY692340. IGI:53771772MFLTRRDPPLSSFWTKVQYQRLKELNASGEQLEMGFSDALSRDRAFQGIEHQLMSQGKRHLEQLRTVKHRPALLELEEKLAKALHQQGFVQVVTPTIITKSALAKMTIGEDHPLFSQVFWLDGKKCLRPMLAPNLYTLWRELERLffDKPIRIFEIGTCYRKESQGAQHLNEFTMLNLTELGTPLEERHQRLEDMARWVLEAAGIREFELVTESSVVYGDTVDVMKGDLELASGAMGPHFLDEKWEIFDPWVGLGFGLERLLMIREGTQHVQSMARSLSYLDGVRLNIN>醋酸氧化脫硫腸狀菌/1-277醋酸氧化脫硫腸狀菌DSM 771VERSION YP_003189614. IGI:258513392MSFLWTVSQQKRLSELNASEEEKNMSFSSTSDREAAYKRVEMRLINESKQRLNKLRHETRPAICALENRLAAALRGAGFVQVATPVILSKKLLGKMTITDEHALFSQVFWIEENKCLRPMLAPNLYYILKDLLRLWEKPVRIFEIGSCFRKESQGSNHLNEFTMLNLVEWGLPEEQRQKRISELAKLVMDETGIDEYHLEHAESVVYGETVDVMHRDIELGSGALGPHFLDGRWGVVGPWVGIGFGLERLLMVEQGGQNVRSMGKSLTYLDGVRLNI在通過突變tRNA合成酶已經(jīng)提供了特定的tRNA攜帶(氨酰化)功能時，簡單地使用另一種如選自上述中一種的野生型tRNA序列可能是不恰當(dāng)?shù)摹＿@種情況下，重要的是保持同樣的tRNA攜帶(氨?；?功能。這可以通過把示范tRNA合成酶中的突變轉(zhuǎn)移到如選自上述中一種的備用的tRNA合成酶骨架上來實(shí)現(xiàn)。通過這種方式，能將所選擇的突變轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的tRNA合成酶序列上，如來自示范的巴氏甲烷八疊球菌和/或馬氏甲烷八疊球菌序列以外的其他生物體的相應(yīng)的PylS序列。通過與已知的tRNA合成酶如示范的巴氏甲烷八疊球菌和/或馬氏甲烷八疊球菌的序列比對，可能會選擇目標(biāo)tRNA合成酶蛋白/骨架?，F(xiàn)通過參照pylS (吡咯賴氨酸t(yī)RNA合成酶)序列來闡述該問題，但所述原理同樣適用于感興趣的特定tRNA合成酶。例如，圖14提供了所有PylS序列的比對。這些序列可能出現(xiàn)低的整體百分序列同一性。因此，重要的是通過例如和已知tRNA合成酶進(jìn)行序列比對(而不是簡單地用低的序列同一性評分)對序列進(jìn)行研究，以確保所用的序列的確是tRNA合成酶。因此，合適地，當(dāng)考慮序列同一性時，它被合適地認(rèn)為是跨越如圖14所示的tRNA合成酶。合適地，百分同一性可以如圖14所定義。圖15顯示tRNA合成酶之間序列同一性的圖。合適地，百分同一性可以如圖15所定義。關(guān)注催化區(qū)域可能是有用的。圖16比對的僅僅是催化區(qū)域。這樣做目的是提供由其可以定義高百分同一性的tRNA催化區(qū)域，以捕獲/鑒別適合接受所引入的突變的骨架，從而產(chǎn)生相同的tRNA攜帶(氨酰化)功能，例如新的或非天然的氨基酸識別。因此，合適地，當(dāng)考慮序列同一性時，合適地，它被認(rèn)為是跨越如圖16所示的催化區(qū)域。合適地，百分同一性可以如圖16所定義。圖17顯示了催化區(qū)域之間序列同一性的圖。合適地，百分同一性可以如圖17所定義。通過定點(diǎn)誘變編碼tRNA合成酶骨架的核苷酸序列，可以將突變“轉(zhuǎn)移”或“引入(植入)”到可選的tRNA合成酶骨架上。該技術(shù)在本領(lǐng)域里是眾所熟知的。實(shí)質(zhì)上，選擇骨架PylS序列(例如用上面所討論的活性位點(diǎn)比對)且將所選擇的突變轉(zhuǎn)移到(即安置在)相應(yīng)的/同源位置。當(dāng)使用數(shù)字地址表示特定的氨基酸殘基時，除非明顯，否則編號使用MbPylRS (巴氏甲烷八疊球菌吡咯賴氨酸-tRNA合成酶)的氨基酸序列作為參考序列(即由公眾可獲得
的登陸號為Q46E77的野生型巴氏甲烷八疊球菌PylS基因所編碼)MDKKPLDVLI SATGLWMSRT GTLHKIKHYE VSRSKIYIEM ACGDHLVVNN SRSCRTARAFRHHKYRKTCK RCRVSDEDIN NFLTRSTEGK TSVKVKVVSA PKVKKAMPKS VSRAPKPLENPVSAKASTDT SRSVPSPAKS TPNSPVPTSA PAPSLTRSQL DRVEALLSPE DKISLNIAKPFRELESELVTRRKNDFQRLY TNDREDYLGK LERDITKFFV DRDFLEIKSP ILIPAEYVER MGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTL YNYLRKLDRI LPDPIKIFEV GPCYRKESDG KEHLEEFTMV NFCQMGSGCTRENLESLIKE FLDYLEIDFE IVGDSCMVYG DTLDIMHGDL ELSSAVVGPV PLDREffGIDKPffIGAGFGLE RLLKVMHGFK NIKRASRSES YYNGISTNL根據(jù)本領(lǐng)域的廣泛理解使用該序列定位感興趣的殘基。這并不總是一個嚴(yán)格的計(jì)數(shù)練習(xí)——必須注意背景或?qū)R。例如，如果感興趣的蛋白的程度稍有不同，正確殘基在對應(yīng)于(例如)L266的序列中的定位可能需要將序列對齊，并挑出相當(dāng)或相應(yīng)的殘基，而不是簡單地取用感興趣序列的第266位殘基。這在本領(lǐng)域技術(shù)人員范圍內(nèi)。本文所用的突變表示法是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)。例如，L266M是指與野生型序列的第266位的L對應(yīng)的氨基酸被替換為M。交替的tRNA骨架之間突變的引入現(xiàn)可參照示范性的巴氏甲烷八疊球菌和馬氏甲烷八疊球菌的序列進(jìn)行描述，但相同的原則同樣適用于引入到其他骨架或從其他骨架引入。例如，Mb AcKRS是用于引入AcK的工程化的合成酶。親本蛋白/骨架巴氏甲烷八疊球菌PylS突變L266V、L270I、Y271F、L274A、C317FMb PCKRS :用于引入PCK的工程化的合成酶。親本蛋白/骨架巴氏甲烷八疊球菌PylS。突變M241F、A267S、Y271C、L274M。通過把這些突變引入至馬氏甲烷八疊球菌PylS中能得到具有相同底物特異性的合成酶。在圖18可以看出兩個合成酶的序列同源性。因此，可以通過將來自Mb骨架的突變引入至Mm tRNA骨架上而產(chǎn)生下列合成酶
Mm AcKRS :引入突變 L301V、L305I、Y306F、L309A、C348F 至馬氏甲烷八疊球菌PylS ；Mm PCKRS :引入突變 M276F、A302S、Y306C、L309M 至馬氏甲烷八疊球菌 PylS。下面給出所引入突變的示范性合成酶的全長序列。>Mb_PylS/l-419MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLAPTLYNYLRKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL>Mb_AcKRS/l-419MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSGEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERMGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMVAPTIFNYARKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFFQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL>Mb_PCKRS/l-419MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRTARAFRHHKYRKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTESKNSVKVRVVSAPKVKKAMPKSVSRAPKPLENSVSAKASTNTSRSVPSPAKSTPNSSVPASAPAPSLTRSQLDRVEALLSPEDKISLNMAKPFRELEPELVTRRKNDFQRLYTNDREDYLGKLERDITKFFVDRGFLEIKSPILIPAEYVERFGINNDTELSKQIFRVDKNLCLRPMLSPTLCNYMRKLDRILPGPIKIFEVGPCYRKESDGKEHLEEFTMVNFCQMGSGCTRENLEALIKEFLDYLEIDFEIVGDSCMVYGDTLDIMHGDLELSSAVVGPVSLDREffGIDKPWIGAGFGLERLLKVMHGFKNIKRASRSESYYNGISTNL>Mm_PylS/l-454MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIV⑶SCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL>Mm_AcKRS/l-454MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPM·VAPNIFNYARKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFFQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIV⑶SCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL
>Mm_PCK RS/1-454MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARALRHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLENTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMSAPVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERFGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPMLSPNLCNYMRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLESIITDFLNHLGIDFKIV⑶SCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL同一原則同樣適用于其他突變和/或其他骨架?？捎欣貙τ眠@種方式產(chǎn)生的具有引入的多肽進(jìn)行測試，以確保保留了期望的功能/底物特異性?？梢詫⒕幋a用于上述方法的感興趣多肽的多核苷酸引入到重組的可復(fù)制載體中。該載體可用于在兼容的宿主細(xì)胞中復(fù)制該核酸。因此，在進(jìn)一步的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了通過將本發(fā)明的多核苷酸引入到可復(fù)制載體、將該載體引入到兼容的宿主細(xì)胞并在使載體復(fù)制的條件下培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞來生產(chǎn)本發(fā)明的多核苷酸的方法。所述載體可從宿主細(xì)胞中回收。合適地，宿主細(xì)胞包括諸如大腸桿菌的細(xì)菌。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸在載體中與控制序列可操作地連接，所述控制序列能夠使宿主細(xì)胞表達(dá)編碼序列，即所述載體為表達(dá)載體。術(shù)語“可操作地連接”指的是所描述的組分處于允許其以預(yù)期的方式發(fā)揮作用的關(guān)系中?！翱刹僮鞯剡B接”到編碼序列的調(diào)節(jié)序列以在與調(diào)控序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)編碼序列的表達(dá)的方式連接。本發(fā)明的載體可被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到所描述的合適的宿主細(xì)胞中，以表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。該方法包括在使載體表達(dá)編碼所述蛋白的編碼序列的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，和任選地回收所表達(dá)的蛋白質(zhì)。所述載體可以是，例如提供有復(fù)制起點(diǎn)、任選的用于表達(dá)所述多核苷酸的啟動子和任選的所述啟動子的調(diào)節(jié)子的質(zhì)粒或病毒載體。所述載體可包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，例如細(xì)菌質(zhì)粒情況下的氨芐青霉素抗性基因。可以使用載體以例如，轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞?？刹僮鞯剡B接到編碼本發(fā)明的蛋白序列的序列上的調(diào)控序列包括啟動子/增強(qiáng)子和其它表達(dá)調(diào)控信號?？蛇x擇這些調(diào)控序列以使其與經(jīng)設(shè)計(jì)使表達(dá)載體用于其中的宿主細(xì)胞相容。術(shù)語“啟動子”在本領(lǐng)域中是熟知的，包括在大小和復(fù)雜度上從最小啟動子到包括上游元件和增強(qiáng)子的啟動子的范圍內(nèi)的核酸區(qū)域。目標(biāo)賴氨酸被保護(hù)基團(tuán)保護(hù)(如所述方法的步驟(a))。所述保護(hù)基團(tuán)不同于用來保護(hù)另外的賴氨酸的保護(hù)基團(tuán)(如所述方法的步驟(b))。必須實(shí)施用于在所述方法的步驟(C)中選擇性地從目標(biāo)賴氨酸去除所述保護(hù)基團(tuán)的方法，從而不使所述另外的賴氨酸同時去保護(hù)。賴氨酸側(cè)鏈的化學(xué)保護(hù)劑是多種多樣的，并可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)要用的去保護(hù)方法的類型來選擇。然而，適當(dāng)選擇所述保護(hù)劑以允許通過基因工程引入賴氨酸殘基，并由此允許其通過細(xì)胞中的正交合成酶/tRNA對引入。合適地，步驟(a)中使用的保護(hù)劑如本文所述。更合適地，帶有步驟(a)中使用的保護(hù)劑的賴氨酸是N ε -(叔丁氧基羰基)-L-賴氨酸。另一個實(shí)施方式采用了受光不穩(wěn)定的掩蔽基團(tuán)保護(hù)的賴氨酸。這樣的優(yōu)點(diǎn)是允許光去掩蔽(去保護(hù))，這比化學(xué)去保護(hù)更容易。所述另外的賴氨酸殘基和任意的N-末端氨基使其側(cè)鏈?zhǔn)艿奖Ｗo(hù)，從而允許目標(biāo)賴氨酸的特異性修飾。有利地，這可以通過使用如下反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)在所述反應(yīng)中保護(hù)基團(tuán)可達(dá)到或至少接近所述多肽鏈中存在的所述另外的賴氨酸殘基的飽和(100% )。使用容易變性和復(fù)性且不失去其特性的多肽作為蛋白質(zhì)是有利的。因此，如果本發(fā)明的多肽是一個小蛋白，可能是有利的。還有利的是，所述多肽很少或沒有翻譯后修飾，如糖基化。進(jìn)行修飾的示范性多肽包括組蛋白和/或小的轉(zhuǎn)錄因子。合適地，進(jìn)行修飾的多肽不太大。合適地，不太大是指不超過幾百個氨基酸的長度，合適地，400個氨基酸或更少，更合適地，約300個氨基酸或更少。多結(jié)構(gòu)域蛋白因?yàn)橛绊懪c其他結(jié)構(gòu)域(如多蛋白復(fù)合物的其他成員)相互作用的機(jī)會增加而較少用于缺乏。合適地，所用的保護(hù)基團(tuán)可以如本文所述。更合適地，保護(hù)劑是N-(芐氧基羰基氧基)琥珀酰亞胺(Cbz-Osu)。合適，其可以在堿性DMSO中使用。 可選的或額外的保護(hù)基團(tuán)和它們的操作(如它們的添加/刪除的化學(xué))描述如下。BocLys 描述在“Genetic incorporation of N ε - (t-butyloxycarbonyl)-L-Iysine (BocLys) 〃 (YANAGISAWAj Τ·，ISHIIj R.，F(xiàn)UKUNAGA, R.，K0BAYASHI，Τ·，SAKAMOTO, K. &Υ0Κ0ΥAM，S. (2008)Multistep engineering ofpyrrolysyl-tRNA synthetase to geneticallyencodeN(epsilon)-(o~az idobenzyloxycarbonyI)lysine for site-specificproteinmodification. Chem Biol,15，1187-97)。去(off)-三氟乙酸(TFA)
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ο能被溫和地連接到蛋白質(zhì)胺上的正交保護(hù)基團(tuán)，其中
XI.芐氧基羰基(Cbz或Ζ)連接(on) -N-(芐氧基羰基氧基)-琥珀酰亞胺(KAWAKAMI, T.，HASEGAWA, K.，TERUYA, K.，AKAJI, K.，H0RIUCHI, M.，INAGAK
I,F. , KURIHARA, Y. , UESUGI, S. &ΑΙΜ0Τ0, S. (2001) Polypeptide synthesis usingan expressed peptide as a building block forcondensation with a peptidethioester!application to the synthesis ofphosphorylated p2IMax protein(1-101) ·J Pept Sci,7，474-87)
去-HF/DMS,TFMSA/TFA/DMS,催化氫化(TAM, J. , HEATH, ff. &MERRIFIELD, R. (1983) SN2DEPR0TECTI0N0F SYNTHETICPEPTIDES WITH A LOW CONCENTRATION OF HF INDIMETHYL SULFIDE-EVIDENCE ANDAPPLICATION INPEPTIDE-SYNTHESIS. Journal of the American Chemical Society,105，6442-6455)(TAM, J. P. , HEATH, ff. F. &MERRIFIELD, R. B. (1986) Mechanisms forthe removal ofbenzyl protecting groups in synthetic peptides bytrifluoromethanesulfonic acidtrifluoroacetic-acid dimethyl sulfide. Journal of theAmerican Chemical Society,108，5242-5251)有機(jī)合成中的Greene保護(hù)基團(tuán)
權(quán)利要求
1.修飾包含至少兩個賴氨酸殘基的多肽中特定賴氨酸殘基的方法，所述方法包括 (a)提供一種多肽，所述多肽包含受第一保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的目標(biāo)賴氨酸殘基和至少一個另外的賴氨酸殘基； (b)處理所述多肽以保護(hù)所述另外的賴氨酸殘基，其中，所述另外的賴氨酸殘基的保護(hù)基團(tuán)與所述目標(biāo)賴氨酸殘基的保護(hù)基團(tuán)不同； (C)選擇性地去保護(hù)所述目標(biāo)賴氨酸殘基；和 (d)修飾(c)中所述的去保護(hù)了的賴氨酸殘基。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述多肽的產(chǎn)生包括 (i)提供編碼所述多肽的核酸，其中所述核酸包含編碼所述目標(biāo)賴氨酸的正交密碼子; ( )在正交tRNA合成酶/tRNA對存在下翻譯所述核酸，其中所述正交tRNA合成酶/tRNA對能夠識別所述正交密碼子并將受第一保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的所述目標(biāo)賴氨酸殘基引入至所述多肽鏈中。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述正交密碼子包括TAG，所述tRNA包括MbtRNACUA，所述tRNA合成酶包括MbPylRS。
4.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，受第一保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的所述目標(biāo)賴氨酸殘基是N ε -(叔丁氧基羰基)-L-賴氨酸。
5.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，所述另外的賴氨酸殘基的保護(hù)基團(tuán)是N-(芐氧基羰基氧基)琥珀酰亞胺(Cbz-Osu)。
6.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，步驟(b)包括在堿性DMSO中用N-(芐氧基羰基氧基)琥珀酰亞胺(Cbz-Osu)處理所述多肽。
7.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，步驟(c)包括用含三氟乙酸(TFA)的水處理所述多肽。
8.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，步驟(d)的修飾包括 (i)通過在Ag (I)存在下轉(zhuǎn)換成N-羥基琥珀酰亞胺酯而活化硫酯； ( )添加將與所述目標(biāo)賴氨酸連接的多肽；和 (iii)溫育以形成特異的異肽鍵。
9.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，步驟(d)的修飾在所述目標(biāo)賴氨酸殘基的ε-氨基基團(tuán)上進(jìn)行。
10.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，在步驟(d)中對所述目標(biāo)賴氨酸進(jìn)行多個修飾。
11.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，進(jìn)一步包括使所述另外的賴氨酸殘基去保護(hù)的步驟(e)。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中，步驟(e)包括用比例為1:3:6的三氟甲磺酸(TFMSA):三氟乙酸(TFA) : 二甲基硫醚(DMS)的混合物處理所述多肽。
如權(quán)利要求I所述的方法，其中，步驟(a)包括通過在所述多肽的翻譯過程中通過基因工程方式向所述多肽鏈中引入受第一保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的所述目標(biāo)賴氨酸殘基而產(chǎn)生所述多肽。
13.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，所述多肽為泛素。
14.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，步驟(d)的修飾是另外的多肽鏈與所述目標(biāo)賴氨酸的共價(jià)連接。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述另外的多肽鏈為泛素。
16.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，重復(fù)步驟(c)-(d)以生產(chǎn)由通過賴氨酸殘基的共價(jià)連接而連接的多肽鏈。
17.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求生產(chǎn)的多肽。
18.如權(quán)利要求17所述的多肽，其包括K-連接的泛素鏈。
19.如權(quán)利要求18的多肽，其中，所述K-連接是K6或K29連接。
20.TRABID作為K29去泛素化酶的應(yīng)用。
21.切割K29連接的泛素的方法，所述方法包括使K29連接的泛素與TRABID接觸。
全文摘要
本發(fā)明涉及修飾包含至少兩個賴氨酸殘基的多肽中特定的賴氨酸殘基的方法，所述方法包括(a)提供包含受第一保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的目標(biāo)賴氨酸和至少一個另外的賴氨酸殘基的多肽；(b)處理所述多肽以保護(hù)所述另外的賴氨酸殘基，其中，所述另外的賴氨酸殘基的保護(hù)基團(tuán)與目標(biāo)賴氨酸殘基的保護(hù)基團(tuán)不同；(c)選擇性地去保護(hù)目標(biāo)賴氨酸殘基；和(d)修飾(c)中去保護(hù)了的賴氨酸殘基。
文檔編號C07K14/00GK102939302SQ201180025551
公開日2013年2月20日 申請日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月24日
發(fā)明者賈森·欽, 維·P·阮, 薩特帕爾·維爾德 申請人:醫(yī)藥研究委員會