專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基于金屬雜化介孔材料的磷酸化肽富集方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及磷酸化肽的富集，具體地說(shuō)是一種基于金屬雜化介孔材料的磷酸化肽 富集方法，采用合成的Ti-HMS快速高效地富集酶解液中的磷酸化肽。
背景技術(shù)：
磷酸化修飾是非常重要的一種蛋白質(zhì)的翻譯后修飾?，F(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的所有蛋白質(zhì)中超 過(guò)30%可被磷酸化修飾。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾與多種生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)，如DNA損傷修 復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)等。因?yàn)榈鞍琢姿峄闹匾?，已?jīng)開(kāi)發(fā)出各種磷 酸化蛋白和磷酸化位點(diǎn)的測(cè)定方法。MALDI-T0F-MS以其極高的靈敏度、精確度磷酸化蛋白 的分析中得到了廣泛的應(yīng)用，可直接用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)混合物的分子量，也能被用來(lái)測(cè)定經(jīng) 酶等降解后的混合物，以確定多肽的氨基酸序列。對(duì)磷酸化蛋白而言，磷酸化肽序列的測(cè)定 可以確定磷酸化蛋白序列中的磷酸化位點(diǎn)。MALDI-T0F-MS分析磷酸化肽時(shí)主要存在的問(wèn)題是，由于非磷酸化肽的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高 于磷酸化肽，混合物中磷酸化肽的信號(hào)被抑制。因此只有當(dāng)磷酸化肽被分離富集后，避開(kāi)大 量的非磷酸化肽的干擾，分析磷酸化肽才會(huì)變得容易。一些相應(yīng)的用于質(zhì)譜分析的磷酸化 肽或磷酸化蛋白質(zhì)前處理技術(shù)的分離和富集方法和技術(shù)已有很大發(fā)展。由于介孔材料具有空曠的空間結(jié)構(gòu)和巨大的表面積(內(nèi)表面和外表面)，因而被 廣泛用于催化劑和吸附載體，許多研究表明介孔材料對(duì)磷酸化蛋白和磷酸化肽也有很好的 吸附富集作用，特別是通過(guò)螯合作用固定了 Ti離子或ττ離子的介孔材料(如MCM-41)對(duì) 磷酸化肽的吸附具有很高的特異性和富集效率。主要原因是通過(guò)間隔臂固定到介孔粒子表 面金屬離子，可減少空間位阻，有利于磷酸化肽的特異性鍵合。HMS是近年來(lái)報(bào)道的一種新型氧化硅介孔材料，它是以長(zhǎng)鏈伯胺為模板劑，通過(guò)模 板劑形成的膠束與硅母體之間的氫鍵作用和自組裝途徑(S°I°模板途徑)合成的，具有較厚 的孔壁、較大的織物孔道結(jié)構(gòu)，因而具有較高的熱穩(wěn)定性和水熱穩(wěn)定性；同時(shí)其孔道較短、 且具有大的構(gòu)造孔的特點(diǎn)可使分子較易進(jìn)出孔道，有利于傳質(zhì)的進(jìn)行，這使得該材料在催 化、吸附和分離等領(lǐng)域有著潛在的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種Ti雜化的HMS(Ti-HMS)的制備方法，在常溫條件下， 以有機(jī)伯胺為模板劑，正硅酸乙酯(TEOS)為硅源，鈦酸丁酯為金屬源，通過(guò)溶膠-凝膠方法 制得。模板劑通過(guò)高溫焙燒去除。本發(fā)明提供了基于上述Ti-HMS的磷酸化肽分離富集方法，可以從蛋白酶解液中 簡(jiǎn)單、高效、高選擇性地分離富集出磷酸化肽，用于MALDI-T0F-MS分析。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種基于金屬雜化介孔材料的磷酸化肽富集方法，DTi-HMS的前處理將5-20mg Ti-HMS加入l_2ml的含有體積濃度10-80% ACN和1-10% TFA的混合溶液中，振蕩混勻后備用；所述Ti-HMS的前處理詳細(xì)過(guò)程為A.稱(chēng)取 5-20mg Ti-HMS 加入 l_2ml 的含有體積濃度 10-80 % ACN 和 1-10 % TFA 的 混合溶液中，振蕩離心后移走上清液；B.再加入l_2ml去離子水，振蕩離心后移走上清液；C.再加入l-2ml的含有體積濃度10-80% ACN和1-10% TFA的混合溶液中，振蕩 離心后移走上清液；D.再加入l-2ml的含有體積濃度10-80 % ACN和1-10 % TFA的混合溶液中，振蕩 混勻后備用。2) Ti-HMS對(duì)磷酸化肽分離富集A.將蛋白酶解液樣品用含有體積濃度10-80% ACN和TFA的混合溶液稀釋 至 I-IOpmol/μ L ；B.取IyL稀釋后的蛋白酶解液，加入到25-100 μ L的步驟1)所獲得的Ti-HMS溶 液中，振蕩離心后移去上清液，收集底部沉淀物；C.底部沉淀物加入50-200 μ L含有體積濃度10-80 % ACN和1-10 % TFA的混合溶 液中，混合溶液中含100-500mM NaCl，振蕩離心后移去上清液，收集底部沉淀物；重復(fù)此步 驟0-1次；D.底部沉淀物再加入加入50-200 μ L含有體積濃度10-80 % ACN和0-1 % TFA的 混合溶液中，振蕩離心后移去上清液，收集底部沉淀物；重復(fù)此步驟0-1次；Ε.最后底部沉淀物用10_50μ L質(zhì)量濃度5-20%氨水超聲洗滌，離心后，收集上清 液于離心管中凍干后保存。所述金屬雜化介孔材料是以C12-C18有機(jī)伯胺為模板劑，正硅酸乙酯(TEOS)為硅 源，鈦酸丁酯為金屬源，以上三者的質(zhì)量比為1 (0.06-0.65) (1.5-5.0)，通過(guò)溶膠-凝 膠方法制得；具體制備過(guò)程如下，1)取4-8g C12-C18有機(jī)伯胺溶解于IOOg去離子水、15_25g乙醇和10_15g異丙 醇混合液中，制得溶液A ；2) 0. 5-2. 5g鈦酸丁酯、10_20g正硅酸乙酯和15_25g異丙醇組成溶液B ；3)在劇烈攪拌下，將溶液B滴加到溶液A中，2-6分鐘后加入l_3g三甲苯，陳化 12-30小時(shí)，抽濾、洗滌沉淀，烘干，500-600°C焙燒5_7小時(shí)得最終材料。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.以前文獻(xiàn)中關(guān)于介孔材料應(yīng)用于磷酸化肽分離富集都采用了介孔材料衍生的 辦法，就是介孔材料合成以后，通過(guò)化學(xué)試劑衍生，在材料表面螯合上Ti離子，以達(dá)到特異 吸附性磷酸化肽的目的。本發(fā)明在材料合成過(guò)程中直接在介孔材料骨架中引入Ti離子，應(yīng)用于磷酸化肽 分離富集過(guò)程可起到同樣的作用；其制備過(guò)程更為簡(jiǎn)便，Ti離子的螯合量更大，應(yīng)用時(shí)效 果更好、更為高效。2.由于特異性吸附效果好，洗滌和洗脫過(guò)程較為簡(jiǎn)單。


圖1為T(mén)i-HMS孔徑分布圖；圖2為T(mén)i-HMS紫外漫反射圖；圖3為所合成的Ti-HMS對(duì)α -酪蛋白酶解液中的磷酸化肽的吸附效果圖；圖4可見(jiàn)，所合成的Ti-HMS對(duì)β -酪蛋白酶解液中的磷酸化肽的吸附效果圖。
具體實(shí)施例方式一、Ti-HMS 的合成Ti-HMS的具體合成方法為取5g十六胺溶解于IOOg去離子水、20g乙醇和15g異 丙醇中，制得溶液A。2g鈦酸丁酯、16g正硅酸乙酯和15g異丙醇組成溶液B。在劇烈攪拌 下，將溶液B滴加到溶液A中，5分鐘后加入2g三甲苯。滴加完畢后，陳化24小時(shí)，抽濾、洗 滌沉淀，80°C烘干，550°C焙燒6小時(shí)得最終材料。Ti雜化的HMS (Ti-HMS)，其孔徑分布如下(圖1)；紫外可見(jiàn)漫反射(圖2)表明HMS 骨架外無(wú)TiO2相，Ti離子進(jìn)入HMS骨架。二、Ti-HMS對(duì)磷酸化肽分離富集1、樣品溶液的制備稱(chēng)取Img的α -酪蛋白和Img的β -酪蛋白分別解在lmL， 50mM的碳酸氫胺溶液中(pH8. 2)，按照與胰蛋白酶的質(zhì)量比40 1的比例加入胰蛋白酶進(jìn) 行酶解反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為16h，酶解溫度控制在37°C，最后加入0. 5%甲酸停止反應(yīng)。獲得的 蛋白酶解溶液置于-30°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?、Ti-HMS的前處理稱(chēng)取IOmg上述合成的Ti-HMS加入Iml的50% ACN,6 % TFA(ν/ν)的混合溶液，振蕩10分后，在13500g下離心10分鐘，移走上清液；再加入Iml去 離子水，振蕩10分后，在13500g下離心10分鐘，移走上清液；再加入Iml的50% ACN,6% TFA(ν/ν)的混合溶液，振蕩10分后，在13500g下離心10分鐘，移走上清液；再加入Iml的 50% ACN,6% TFA (ν/ν)的混合溶液，振蕩混勻后備用。3、磷酸化肽的富集及MALDI-T0F-MS分析將上述酶解的α -酪蛋白和β -酪蛋 白分別用50% ACN,6% TFA(ν/ν)的混合溶液稀釋至lpmol/μ L ；各取1 μ L，分別加入至Ij 50 μ L的Ti-HMS溶液中，振蕩30分鐘，13500g離心10分鐘后移去上清液；底部沉淀物加入 150 μ L 50% ACN,6% TFA(ν/ν)(含 500mM NaCl)混合液，振蕩 5 分鐘后，13500g 離心 10 分 鐘后移去上清液；底部沉淀物再加入150 μ L 50%ACN,0. 1% TFA (ν/ν)混合液，振蕩5分鐘 后，13500g離心10分鐘后移去上清液；最后底部沉淀物用25 μ L10%氨水超聲洗滌10分 鐘，13500g離心10分鐘后，收集上清液至離心管中凍干后保存；在離心管中加入5 μ L含有
磷酸的2，5-二羥基苯甲酸(10-50mg/mL)溶液，取0. 5 μ L溶液沉積于MALDI靶上，形成 共結(jié)晶，進(jìn)行MALDI-T0F-MS分析。4、分析結(jié)果由圖3和圖4可見(jiàn)，所合成的Ti-HMS對(duì)α-酪蛋白和β-酪蛋白酶解 液中的磷酸化肽具有很好吸附效果，而非磷酸化肽則很容易地被洗脫，說(shuō)明Ti雜化的HMS 可高特異性地分離純化磷酸化肽。表1在α -酪蛋白酶解液中檢測(cè)到的磷酸化肽 表2在β _酪蛋白酶解液中檢測(cè)到的磷酸化肽磷酸化序號(hào)[Μ+Η] +位點(diǎn)數(shù)β 1 2064. 718 1β 2 2558. 549 1β 3 3123.077 4磷酸化肽富集.ST25. txtSEQUENCE LISTING<110>中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所<120> 一種基于金屬雜化介孔材料的磷酸化肽富集方法<130><160>15<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>9<212>PRT <213>α-酪蛋白 <220>
<221>PH0SPH0RYLATI0N <222>(1). . (9) <223> <400>1
Thr Val Asp Met Glu Thr Glu Val Phe 15
<210>2 <211>11 <212>PRT <213>α-酪蛋白 <220>
<221>PH0SPH0RYLATI0N <222>(1). . (11) <223> <400>2
Thr Val Asp Met Glu Thr Glu Val Phe Thr Lys 1510
<210>3 <211>13 <212>PRT <213>α-酪蛋白 <220>
<221>PH0SPH0RYLATI0N <222>(1). . (13) <223> <400>3
Val Pro Gln Leu Glu lie Val Pro Asn Ala Glu Glu Arg
1510
<210>4
<211>14
<212>PRT
<213>α-酪蛋白
<220>
<221>PH0SPH0RYLATI0N <222>(1). . (14) <223>
<400>4Tyr Leu Gly Glu Tyr Leu lie Val Pro Asn Ala Glu Glu Arg1510<210>5<211>14<212>PRT<213>α-酪蛋白<220><221>PH0SPH0RYLATI0N<222>(1). . (14)<223><400>5Asp lie Gly Glu Thr Glu Asp Gln Ala Met Glu Asp lie Lys1510<210>6<211>15<212>PRT<213>α-酪蛋白<220><221>PH0SPH0RYLATI0N<222>(1). . (15)<223><400>6Tyr Lys Val Pro Gln Leu Glu lie Val Pro Asn Ala Glu Glu Arg151015<210>7<211>18<212>PRT<213>α-酪蛋白<220><221>PH0SPH0RYLATI0N<222>(1). . (18)<223><400>7Lys Lys Tyr Lys Val Pro Gln Leu Glu lie Val Pro Asn Ala Glu Glu151015Arg Leu<210>8<211>16
<212>PRT<213>α-酪蛋白<220><221>PH0SPH0RYLATI0N<222>(1). . (16)<223><400>8Asn Thr Met Glu His Val Glu Glu Ser lie lie Gln Glu Thr Tyr Lys151015<210>9<211>17<212>PRT<213>α-酪蛋白<220><221>PH0SPH0RYLATI0N<222>(1). . (17)<223><400>9Gln Met Glu Ala Glu Glu Glu lie Val Pro Asn Pro Asn Val Glu Gln151015Lys<210>10<211>23<212>PRT<213>a-酪蛋白<220><221>PH0SPH0RYLATI0N<222>(1). . (23)<223><400>10Lys Glu Lys Val Asn Glu Leu Lys Asp lie Gly Glu Thr Glu Asp Gln151015Ala Met Glu Asp lie Lys Gln20<210>11<211>21<212>PRT<213>a-酪蛋白<220>
<223)
<400>14
Phe Gln Olu Olu Gln Gln Gln／hr Olu Asp Olu Leu Gln Asp Lys工le
l5lo15
HiS Pro Phe
<210>15
<211>2l
<2 l 2)PRT
<213>p一酪蛋白
<220)
<22l>PH。SPH。RYLAT工。N
<222)(1)．．(21)
<223)
<400>15
Arg Olu Leu Olu Olu Leu Ash Val Pro 61y Olu工le Val Olu Leu Olu
l5lo15
Olu Set 11e Thr Arg
20
權(quán)利要求
一種基于金屬雜化介孔材料的磷酸化肽富集方法，其特征在于1)Ti HMS的前處理將5 20mg Ti HMS加入1 2ml的含有體積濃度10 80％ACN和1 10％TFA的混合溶液中，振蕩混勻后備用；2)Ti HMS對(duì)磷酸化肽分離富集A.將蛋白酶解液樣品用含有體積濃度10 80％ACN和1 10％TFA的混合溶液稀釋至1 10pmol/μL；B.取1μL稀釋后的蛋白酶解液，加入到25 100μL的步驟1)所獲得的Ti HMS溶液中，振蕩離心后移去上清液，收集底部沉淀物；C.底部沉淀物加入50 200μL含有體積濃度10 80％ACN和1 10％TFA的混合溶液中，混合溶液中含100 500mM NaCl，振蕩離心后移去上清液，收集底部沉淀物；重復(fù)此步驟0 1次；D.底部沉淀物再加入加入50 200μL含有體積濃度10 80％ACN和0 1％TFA的混合溶液中，振蕩離心后移去上清液，收集底部沉淀物；重復(fù)此步驟0 1次；E.最后底部沉淀物用10 50μL質(zhì)量濃度5 20％氨水超聲洗滌，離心后，收集上清液于離心管中凍干后保存。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述Ti-HMS的前處理詳細(xì)過(guò)程為Α.稱(chēng)取5-20mg Ti-HMS加入l_2ml的含有體積濃度10-80% ACN和1-10% TFA的混合 溶液中，振蕩離心后移走上清液；B.再加入l_2ml去離子水，振蕩離心后移走上清液；C.再加入l_2ml的含有體積濃度10-80%ACN和1-10% TFA的混合溶液中，振蕩離心后移走上清液；D.再加入l_2ml的含有體積濃度10-80%ACN和1-10% TFA的混合溶液中，振蕩混勻后備用。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述金屬雜化介孔材料是以C12-C18 有機(jī)伯胺為模板劑，正硅酸乙酯為硅源，鈦酸丁酯為金屬源，以上三者的質(zhì)量比為 1 (0. 06-0. 65) (1.5-5.0)，通過(guò)溶膠-凝膠方法制得。
4.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于具體制備過(guò)程如下，1)取4-8gC12-C18有機(jī)伯胺溶解于IOOg去離子水、15_25g乙醇和10_15g異丙醇混 合液中，制得溶液A ；2)0. 5-2. 5g鈦酸丁酯、10-20g正硅酸乙酯和15_25g異丙醇組成溶液B ；3)在劇烈攪拌下，將溶液B滴加到溶液A中，2-6分鐘后加入l_3g三甲苯，陳化12-30 小時(shí)，抽濾、洗滌沉淀，烘干，500-600°C焙燒5-7小時(shí)得最終材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及磷酸化肽的富集，具體地說(shuō)是一種基于金屬雜化介孔材料的磷酸化肽富集方法，1)將Ti-HMS加入含有ACN和TFA的混合溶液中，振蕩混勻后備用；2)將蛋白酶解液樣品用含有ACN和TFA的混合溶液稀釋與步驟1)所獲得的Ti-HMS溶液中，振蕩離心后移去上清液，收集底部沉淀物；3)去除沉淀物中未被吸附的蛋白，離心后，沉淀物用氨水超聲洗滌，離心后，收集上清液于離心管中凍干后保存。本發(fā)明可以從蛋白酶解液中簡(jiǎn)單、高效、高選擇性地分離富集出磷酸化肽，用于MALDI-TOF-MS分析。
文檔編號(hào)C07K7/08GK101906131SQ20091001185
公開(kāi)日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2009年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月5日
發(fā)明者吳仁安, 張宇, 徐杰, 鄒漢法, 陳晨 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所