專利名稱:一種微量磷酸化多肽除鹽小柱的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種微量磷酸化多肽除鹽小柱TMTipPPY_a8,這種小柱將聚吡咯和C18固定相以串聯(lián)的方式裝填于微量移液槍頭(Tandem Polypyrrole_C18 packedmicropipette tip,簡稱為TMTipPPY_a8)。該發(fā)明適用于分析微量生物樣品如細(xì)胞、組織中蛋白質(zhì)磷酸化位點,是一種綜合靜電相互作用、Π - Π堆積相互作用、疏水相互作用的分離方法。
背景技術(shù):
細(xì)胞中大量蛋白質(zhì)都會發(fā)生翻譯后磷酸化修飾,這種修飾直接參與多種信號傳導(dǎo)通路,它的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是許多藥物的作用靶標(biāo)。分析磷酸化修飾的難點在于這種修飾蛋白的豐度非常低,因此需要發(fā)展新型材料進(jìn)行磷酸化多肽的富集。金屬氧化物如二氧化鈦是目前為止分離富集磷酸化多肽效果最好的材料之一,但是用這種方法需要采用高達(dá)IM的磷酸銨溶液進(jìn)行洗脫,高濃度的鹽在進(jìn)一步進(jìn)行質(zhì)譜分析時嚴(yán)重干擾待測樣品信號,甚至完全不能檢測到相應(yīng)信號。現(xiàn)有的技術(shù)中,基于反相C18的ZipTip是最有效的除鹽小柱,也是目前唯一使用的除鹽技術(shù)。該技術(shù)利用疏水相互作用保留多肽,而鹽不能在這種小柱保留,上樣后用含
0.lwt%S氟乙烯(TFA)水溶液清洗,而多肽用含0.1wt% TFA的50被%乙腈溶液洗脫,因此達(dá)到除鹽的目的,洗脫液可用于質(zhì)譜分析。ZipTipa8的缺點是不能有效保留磷酸化修飾多肽,或者一些親水性較強(qiáng)的小肽。一個多肽上帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)越多,其親水性越強(qiáng),因而越不能被保留,常常被0.1wt% TFA水溶液洗掉。本發(fā)明利用聚吡咯酸性溶液中氮原子上所帶正電荷與帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)的靜電相互作用,以及聚吡咯上不飽和雙鍵與多肽上含芳環(huán)氨基酸,比如H、F、Y、W的Π - Π堆積相互作用,增強(qiáng)對各種多肽的保留。本發(fā)明不僅可以在酸性條件下使用,也可以在堿性條件下使用,因此使得一些在酸性條件下不溶解的多肽得以被檢測,因此擴(kuò)大了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種微量磷酸化多肽除鹽方法。一種微量磷酸化多肽除鹽小柱TMTipPPY_a8。該方法簡單,能夠?qū)邼舛塞}的多肽進(jìn)行除鹽處理,適合于質(zhì)譜分析。實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案:一種微量磷酸化多肽除鹽小柱,該小柱利用反相C18與聚吡咯復(fù)合物做分離材料,采用下述方法制成,制備包括以下步驟:I)、稱取0.01克石英棉于離心管,加入I毫升去離子水和25微升吡咯,超聲10分鐘;2)、將100微升濃度為20微克/微升過硫酸銨水溶液快速加入步驟I)所得的混合物中,渦流使其快速混勻,再超聲10分鐘;3)、取步驟2)得到聚吡咯修飾石英棉用乙醇清洗,并保存于乙醇溶液中;
4)、將保存在乙醇溶液中的聚吡咯修飾石英棉裝填于含C18反相分離材料的微量ZipTipa8移液管,用移液器將之填緊;5)、密封微量移液管上端即得。本發(fā)明的微量磷酸化多肽除鹽小柱的制備方法,其特征在于包括以下步驟:I)、稱取0.01克石英棉于離心管,加入I毫升去離子水和25微升吡咯,超聲10分鐘;2)、將100微升濃度為20微克/微升的過硫酸銨水溶液快速加入步驟I)所得的混合物中,渦流使其快速混勻,再超聲10分鐘;3)、取步驟2)得到聚吡咯修飾石英棉用乙醇清洗,并保存于乙醇溶液中;4)、將步驟3)保存在乙醇溶液中的聚吡咯修飾石英棉裝填于含C18反相分離材料的微量ZipTipa8移液管上部,用移液器將之填緊;5)、密封微量移液管上端即得。本發(fā)明的微量磷酸化多肽除鹽小柱的應(yīng)用,其特征在于,應(yīng)用于胰蛋白酶解液質(zhì)譜分析,其做法是,將微量磷酸化多肽除鹽小柱依次用含0.1wt % TFA的80wt%乙腈溶液、
0.1wt % TFA水溶液清洗各三次;pH 8為的胰蛋白酶解液先用0.1wt % TFA調(diào)至酸性,使pH2 3,或直接上樣;然后用0.1wt % TFA水溶液清洗兩次,最后用含0.1wt % TFA的50wt%乙腈溶液洗脫,洗脫液用于質(zhì)譜分析。本發(fā)明的效果和優(yōu)點:1.本發(fā)明制備的微量磷酸化多肽除鹽小柱,反應(yīng)條件溫和,無需有毒有害試劑。2.整個工藝過程簡單易控制,耗能少,產(chǎn)率高,成本低,符合實際生產(chǎn)需要。3.與現(xiàn)有基于反相疏水相互作用的技術(shù)相比,本發(fā)明以聚吡咯為分離材料,利用酸性條件下聚吡咯氮原子上的正電荷與帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)之間的靜電相互作用,以及聚吡咯不飽和雙鍵與芳香氨基酸殘基的Π - Π堆積相互作用,彌補(bǔ)了常規(guī)C18固定相單一疏水相互作用的不足,增強(qiáng)了分離材料與目標(biāo)分子的相互作用。以簡單易得的吡咯和過硫酸銨為原料,在室溫下經(jīng)超聲輔助反應(yīng)后,再經(jīng)過清洗、裝填、封口等過程制得所需的微量磷酸化多肽除鹽小柱。不僅能夠用于酸性條件,也可用于堿性條件,除鹽效果好,對磷酸化多肽的保留強(qiáng),應(yīng)用范圍廣。4.本發(fā)明的微量磷酸化多肽除鹽方法,不需要復(fù)雜的儀器即可制備相應(yīng)的微量磷酸化多肽除鹽小柱,能夠有效富集低豐度磷酸化多肽,實際樣品分析操作簡單,無需復(fù)雜的樣品前處理,操作容易,背景干擾小,分析速度快。以下結(jié)合附圖和實施例進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行說明。
圖1是實施例所制備的微量磷酸化多肽除鹽小柱實物圖。圖2是實施例所制備的微量磷酸化多肽除鹽小柱在酸性條件下分析標(biāo)準(zhǔn)磷酸化多肽的質(zhì)譜圖。圖3是實施例所制備的微量磷酸化多肽除鹽小柱在堿性條件下分析標(biāo)準(zhǔn)磷酸化多肽的質(zhì)譜圖。圖4是實施所制備的微量磷酸化多肽除鹽小柱在酸性條件下分析斑馬魚卵磷酸化蛋白的質(zhì)譜圖。圖5是實施例所制備的微量磷酸化多肽除鹽小柱在堿性條件下分析斑馬魚卵磷酸化蛋白的質(zhì)譜圖。從圖可以看到,各種不同類型的磷酸化多肽都得到了很好的除鹽效果,檢測到一個多肽上修飾的磷酸基團(tuán)數(shù)最高為6,標(biāo)準(zhǔn)蛋白的磷酸化修飾位點覆蓋率為100%,質(zhì)譜圖信噪比高,背景干擾少。
具體實施例方式本發(fā)明的微量磷酸化多肽除鹽方法,包括石英棉表面聚吡咯修飾方法、微量除鹽小柱制備方法、小柱保存及清洗方法、上樣方法、樣品洗滌方法以及樣品洗脫方法。石英棉表面聚吡咯修飾方法,包括以下步驟:I)、稱取0.01克石英棉于離心管,加入I毫升去離子水和25微升吡咯,超聲10分鐘;2)、將100微升濃度為20微克/微升的過硫酸銨水溶液快速加入步驟I)所得的混合物中,渦流使其快速混勻,再超聲10分鐘;3)、取步驟2)得到聚吡咯修飾石英棉用乙醇清洗,并保存于乙醇溶液中。微量除鹽小柱制備方法,包括以下步驟:I)、將保存在乙醇溶液中的聚吡咯修飾石英棉裝填于含C18反相分離材料的微量ZipTipa8移液管,用移液器將之填緊;2)、密封微量移液管上端,避免石英棉在使用過程中被吸出。小柱保存及清洗方法,包括以下步驟:I)、制備好的微量除鹽小柱保存在乙醇溶液中;2)、使用前用含0.1wt % TFA的80wt%乙腈溶液清洗三次,再用含0.1wt % TFA的水溶液清洗三次。上樣方法、樣品洗滌方法以及樣品洗脫方法,包括以下步驟:I)、胰蛋白酶解液( pH 8)用0.1wt % TFA調(diào)節(jié)酸度至pH 2 3,然后用移液器來回吸幾次,確保樣品完全吸附在固定相;2)、用含0.1wt % TFA的水溶液清洗三次;3)、用含0.1wt % TFA的50wt %乙腈溶液洗脫。實施例1微量磷酸化多肽除鹽小柱的制備及樣品分析。制備步驟依次如下:I)、稱取0.01克石英棉于離心管,加入I毫升去離子水和25微升吡咯,超聲10分鐘;2)、將100微升濃度為20微克/微升的過硫酸銨水溶液快速加入步驟I)所得的混合物中,渦流使其快速混勻,再超聲10分鐘;3)、取步驟2)得到聚吡咯修飾石英棉用乙醇清洗,并保存于乙醇溶液中;4)、分析樣品前,將步驟3)所得產(chǎn)物裝填于微量ZipTipci8移液管上部,然后依次用含0.1wt % TFA的80wt%乙腈溶液、0.1wt % TFA水溶液清洗各三次。胰蛋白酶解液( pH8)先用0.1wt % TFA調(diào)至酸性,pH 2 3,或直接上樣。然后用0.1wt % TFA水溶液清洗兩次,最后用含0.1wt% TFA的50%乙腈溶液洗脫,洗脫液用于質(zhì)譜分析。所制備的微量磷酸化多肽除鹽小柱實物圖如圖1。實施例2實施例1制備的微量磷酸化多肽除鹽小柱用于分析斑馬魚卵磷酸化蛋白1、制備 TMTIPppy_c18 —批;2、將步驟I所得的微量磷酸化多肽除鹽小柱依次用含0.lwt%三氟乙烯(TFA)的80Wt%乙腈溶液和水溶液清洗;3、使用移液器,將斑馬魚卵的胰蛋白酶裂解液直接上樣,或者調(diào)節(jié)pH 2 3后上樣;4、用含0.1 % TFA的水溶液清洗三次;5、含 0.1 % TFA 的 50 % 乙腈洗脫;6、質(zhì)譜分析實驗,將洗脫液與基質(zhì)混合后滴加于樣品靶,放入質(zhì)譜儀(SYNAPTG2HDMS,WATERS, USA),將紫外激光的頻率調(diào)節(jié)為200HZ,所得的質(zhì)譜圖如圖4和5所示。
權(quán)利要求
1.一種微量磷酸化多肽除鹽小柱,其特征在于:該小柱利用反相C18與聚吡咯復(fù)合物做分離材料,采用下述方法制成,制備包括以下步驟: 1)、稱取0.0l克石英棉于離心管,加入I毫升去離子水和25微升吡咯,超聲10分鐘; 2)、將100微升濃度為20微克/微升過硫酸銨水溶液快速加入步驟I)所得的混合物中,渦流使其快速混勻,再超聲10分鐘; 3)、取步驟2)得到聚吡咯修飾石英棉用乙醇清洗,并保存于乙醇溶液中; 4)、將保存在乙醇溶液中的聚吡咯修飾石英棉裝填于含C18反相分離材料的微量ZipTipa8移液管,用移液器將之填緊; 5)、密封微量移液管上端即得。
2.權(quán)利要求1所述的微量磷酸化多肽除鹽小柱的制備方法,其特征在于包括以下步驟: 1)、稱取0.01克石英棉于離心管,加入I毫升去離子水和25微升吡咯,超聲10分鐘; 2)、將100微升濃度20微克/微升的過硫酸銨水溶液快速加入步驟I)所得的混合物中,渦流使其快速混勻,再超聲10分鐘; 3)、取步驟2)得到聚吡咯修飾石英棉用乙醇清洗,并保存于乙醇溶液中; 4)、將步驟3)保存在乙醇溶液中的聚吡咯修飾石英棉裝填于含C18反相分離材料的微量ZipTipa8移液管上部,用移液器將之填緊; 5)、密封微量移液管上端即得。
3.權(quán)利要求1所述的微量磷酸化多肽除鹽小柱的應(yīng)用,其特征在于,應(yīng)用于胰蛋白酶解液質(zhì)譜分析,其做法是,將微量磷酸化多肽除鹽小柱依次用含0.1wt % TFA的80wt%乙腈溶液、0.1wt % TFA水溶液清洗各三次;pH為8的胰蛋白酶解液先用0.1wt % TFA調(diào)至酸性,使pH 2 3,或直接上樣;然后用0.1wt % TFA水溶液清洗兩次,最后用含0.1wt % TFA的50wt%乙腈溶液洗脫,洗脫液用于質(zhì)譜分析。
全文摘要
一種微量磷酸化多肽除鹽小柱。它以反相C18與聚吡咯復(fù)合物為分離材料,利用聚吡咯氮原子上的正電荷與帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)間的靜電作用,聚吡咯不飽和雙鍵與芳香氨基酸殘基的∏-∏堆積作用,彌補(bǔ)C18固定相單一疏水相互作用的不足,增強(qiáng)了分離材料與目標(biāo)分子的相互作用。以吡咯和過硫酸銨為原料,在室溫下經(jīng)超聲后,再經(jīng)過清洗、裝填、封口制得微量磷酸化多肽除鹽小柱。本發(fā)明制備的聚吡咯修飾石英材料分離效率高、純度和穩(wěn)定性高。該材料能用于酸性條件和堿性條件,因此常規(guī)C18固定相所不能檢測的多肽得以檢測,信噪比高,干擾小。本發(fā)明方法簡單,不需要復(fù)雜的儀器,能夠有效富集低豐度磷酸化多肽,樣品分析操作簡單,無需復(fù)雜的樣品前處理。
文檔編號G01N27/62GK103185678SQ201110445490
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者鐘鴻英, 鄭石, 付潔英, 王曉麗, 黃璐璐 申請人:華中師范大學(xué)