用于治療人類或動(dòng)物的缺血性心臟的細(xì)胞外基質(zhì)的糖基化蛋白質(zhì)的制作方法
【專利說明】用于治療人類或動(dòng)物的缺血性心臟的細(xì)胞外基質(zhì)的糖基化蛋 白質(zhì)
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種細(xì)胞外基質(zhì)的糖基化蛋白質(zhì)，優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物細(xì)胞外基質(zhì)的糖 基化蛋白質(zhì)，用在治療有此需要的人類或動(dòng)物受試者的缺血性屯、臟的方法中，一種包含所 述糖基化蛋白質(zhì)的藥物組合物W及一種體外產(chǎn)生分化的屯、肌細(xì)胞的方法。
[0002] 局部缺血為一種血液供應(yīng)限制，其可導(dǎo)致組織的損傷或功能障礙。由于屯、血管疾 病所致的，特別是由于屯、肌梗塞所致的屯、肌的局部缺血是亟待現(xiàn)代醫(yī)學(xué)解決的主要問題。 屯、力衰竭是工業(yè)化國家的頭號(hào)死亡原因。因?yàn)榫植咳毖碌拇罅考?xì)胞損失之后屯、肌組織 缺乏固有再生能力，所W屯、肌梗塞通常導(dǎo)致形成纖維化癒痕W及屯、臟功能永久受損。在屯、 肌梗塞的幸存受試者中發(fā)生屯、臟膠原累積并且形成硬化的富膠原癒痕組織，運(yùn)可導(dǎo)致其余 屯、肌的肥大W及左屯、室的病理性崎形，并且最終導(dǎo)致屯、力衰竭。
[0003] EP 1730265A2公開了一種組合物，其包含生物可降解的基于凝膠的基質(zhì)、至少一 種活化劑W及能夠分化成屯、臟組織的干細(xì)胞。
[0004] EP 1856246A2公開了衍生自脫細(xì)胞化組織的細(xì)胞外基質(zhì)，W及產(chǎn)生和使用所述細(xì) 胞外基質(zhì)的方法。所述產(chǎn)生脫細(xì)胞化基質(zhì)的方法包括W下步驟：（a)使組織經(jīng)受洗涂和高滲 緩沖液處理，（b)用諸如膜蛋白酶的酶來使組織經(jīng)受酶促蛋白消化，和(C)使用包括化iton-X-IOO和氨氧化錠的去污液從所述組織中除去所有細(xì)胞組分。
[000引 EP 2W9292A2公開了一種組合物，其包含來源于屯、臟組織的脫細(xì)胞化細(xì)胞外基 質(zhì)。
[0006] Seif-Nara曲i等人（Sci Transl Med,2013,5(173) ,173)公開了可注射的細(xì)胞外 基質(zhì)水凝膠用于治療屯、肌梗塞的安全性和效力。
[0007] Sree jit等人（Stem Cell Reviews and Reports ,2013,9(2), 158至 171)公開了天 然細(xì)胞外基質(zhì)，其作為生物材料使用成人骨髓來源的干細(xì)胞用于基于支架的屯、臟再生。
[000引 Higuchi等人(J Biosci Bioeng,2013,115(3),320至5)公開了屯、臟細(xì)胞外基質(zhì)支 持小鼠胚胎干細(xì)胞的屯、肌細(xì)胞分化。
[0009] Hinderer等人(Biomaterials,2012,33(21) ,5259至66)公開了用于組織工程化氣 管的原纖維核屯、蛋白多糖基質(zhì)(fibrillar decorin matrices)的工程技術(shù)。
[0010] 因此，已提供了多種方法來發(fā)展策略W改善損傷再生的程度和質(zhì)量，尤其是局部 缺血性屯、臟組織再生的程度和質(zhì)量。然而，所公開的方法均未產(chǎn)生令人滿意的結(jié)果。因此， 對再生缺血性屯、臟組織的改進(jìn)方式和方法的需要仍未滿足。
[0011] 本發(fā)明的基礎(chǔ)技術(shù)問題具體而言是克服W上提及的缺點(diǎn)，優(yōu)選為提供組分，優(yōu)選 藥物組合物，其改善干細(xì)胞(優(yōu)選地為多潛能(Pluripotent)干細(xì)胞、屯、臟干細(xì)胞和/或屯、臟 祖細(xì)胞）向分化的屯、肌細(xì)胞的分化，運(yùn)意味著與無所述組分(優(yōu)選地為所述藥物組合物）的 情況相比，更多數(shù)量的細(xì)胞將朝屯、臟譜系進(jìn)行分化。具體而言，通過使用提供的所述組分 和/或藥物組合物，與未用所述組分和/或藥物組合物治療的動(dòng)物或人類受試者的屯、臟組織 相比，已經(jīng)經(jīng)受或正經(jīng)受局部缺血的動(dòng)物或人類受試者的屯、臟組織應(yīng)極好地再生或受到保 護(hù)。
[001引所述技術(shù)問題已由獨(dú)立權(quán)利要求的教導(dǎo)得W解決。
[0013] 在本發(fā)明的背景中，術(shù)語"細(xì)胞"在本領(lǐng)域中W其最廣含義理解并且是指活體，所 述活體是多細(xì)胞生物體的組織的結(jié)構(gòu)單元，由使其與外部隔離的膜結(jié)構(gòu)包圍，具有自我復(fù) 制的能力并且具有遺傳信息和用于表達(dá)遺傳信息的機(jī)制。本文所用細(xì)胞可W是天然存在的 細(xì)胞或人工修飾的細(xì)胞，例如融合細(xì)胞和遺傳修飾細(xì)胞。
[0014] 在本發(fā)明的背景中，術(shù)語"干細(xì)胞"是指能夠產(chǎn)生至少一種類型的更特定細(xì)胞的細(xì) 胞。干細(xì)胞具有自我更新的能力，即經(jīng)過多輪細(xì)胞分裂而同時(shí)維持未分化狀態(tài)，且具有分化 成特定細(xì)胞類型的能力。通常，干細(xì)胞可再生受傷組織。
[0015] 本文的干細(xì)胞優(yōu)選地為多潛能細(xì)胞或祖細(xì)胞或它們的混合物。多潛能細(xì)胞優(yōu)選地 為誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞或它們的混合物。祖細(xì)胞優(yōu)選地為多能 (multipotent)細(xì)胞。多能細(xì)胞優(yōu)選地為屯、臟祖細(xì)胞、組織干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞。多能干細(xì) 胞可來源于屯、臟、血液循環(huán)或其他組織。本文的干細(xì)胞優(yōu)選地為胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多潛能干 細(xì)胞或組織干細(xì)胞(還稱作組織特異性干細(xì)胞）、成體干細(xì)胞或體干細(xì)胞。
[0016] 在本發(fā)明的背景中，"多潛能干細(xì)胞'是運(yùn)樣的細(xì)胞，其可分化成來源于立個(gè)胚層 中任何胚層的細(xì)胞，例如分化成全能干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞的直接后代。因此，術(shù)語 "多潛能干細(xì)胞"還包括誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞。
[0017] "誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞"通?？s寫為細(xì)胞或iPSC，是指由非多潛能細(xì)胞(通常是 成人體細(xì)胞或末端分化細(xì)胞，諸如成纖維細(xì)胞、造血細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)元、表皮細(xì)胞等)通 過插入某些稱為重編程因子的基因或使用其他重編程方法來人工制備的一類多潛能干細(xì) 胞。
[0018] 在本發(fā)明的背景中，"胚胎干細(xì)胞"是來源于哺乳動(dòng)物胚胎或胚囊的細(xì)胞，其自我 更新且具有產(chǎn)生存在于成熟動(dòng)物或人類中的許多或所有細(xì)胞類型的能力。胚胎干細(xì)胞是多 潛能干細(xì)胞。在限定條件下，胚胎干細(xì)胞能夠無限地自我繁殖。所述多潛能使胚胎干細(xì)胞區(qū) 別于成體中發(fā)現(xiàn)的"成體干細(xì)胞"。雖然胚胎干細(xì)胞可產(chǎn)生體內(nèi)所有細(xì)胞類型，而成體干細(xì) 胞是多能的并且可產(chǎn)生僅有限數(shù)量的細(xì)胞類型。
[0019] "成體干細(xì)胞"又稱為體干細(xì)胞，是非多潛能且非末端分化的細(xì)胞，可見于發(fā)育之 后的整個(gè)身體中，其通過細(xì)胞分裂來增殖W補(bǔ)充死亡細(xì)胞和再生的受損組織。它們可見于 幼體W及成體動(dòng)物和人體中。成體干細(xì)胞能夠無限地分裂或自我更新，并且產(chǎn)生其起源器 官的所有細(xì)胞類型，可能由少許細(xì)胞再生整個(gè)器官。成體干細(xì)胞具有自我更新和多潛能的 性質(zhì)。"多潛能"意為具有產(chǎn)生若干獨(dú)特細(xì)胞類型的祖細(xì)胞的能力。
[0020] 與胚胎干細(xì)胞不同，"屯、臟干細(xì)胞"具有有限的分化潛力。屯、臟干細(xì)胞是組織特異 性干祖細(xì)胞，優(yōu)選地為成年哺乳動(dòng)物屯、臟內(nèi)的組織特異性祖細(xì)胞。
[0021] "祖細(xì)胞"是具有分化成若干不同細(xì)胞類型但非任何細(xì)胞類型的能力的細(xì)胞。運(yùn)些 細(xì)胞已知為多潛能的、雙潛能的或單潛能的。干細(xì)胞與祖細(xì)胞之間最重要的差別在于干細(xì) 胞可無限地復(fù)制，而祖細(xì)胞僅可分裂有限數(shù)量的次數(shù)。與干細(xì)胞相比，祖細(xì)胞處于細(xì)胞分化 的更晚階段。因此，在分化細(xì)胞的過程中，祖細(xì)胞處于干細(xì)胞與完全分化細(xì)胞之間。
[0022] 在本發(fā)明的背景中，"屯、肌細(xì)胞kardiomyocyte)"(也稱作屯、臟肌肉細(xì)胞(cardiac muscle cell))是構(gòu)成屯、肌的肌細(xì)胞。每個(gè)屯、肌細(xì)胞均含有肌原纖維，肌原纖維為長鏈的肌 節(jié)(肌細(xì)胞的可收縮單元）。屯、肌細(xì)胞顯示出與骨骼肌細(xì)胞上的那些條紋類似的條紋。多倍 性與多核化為哺乳動(dòng)物屯、肌細(xì)胞的特性特征。術(shù)語"屯、肌細(xì)胞"包括:屯、肌樣細(xì)胞，其具有成 熟屯、肌細(xì)胞的一些但非所有的特性；W及成熟和全功能性屯、肌細(xì)胞，優(yōu)選的是全功能性屯、 肌細(xì)胞，其在體外和體內(nèi)功能測定中經(jīng)形態(tài)學(xué)、特征性蛋白質(zhì)標(biāo)識(shí)物表達(dá)而確定具有屯、肌 細(xì)胞的所有特性。
[0023] 術(shù)語"胚狀體(embryoid body)"理解為分化細(xì)胞和未分化細(xì)胞的聚集體，其可優(yōu) 選地如W下實(shí)施例1中所述或通過將單層聚集多潛能干細(xì)胞添加至它們不能粘附的基材來 產(chǎn)生。
[0024] 如本文所使用，術(shù)語"載劑(carrier)"是指用W施用化合物的稀釋劑、助劑、賦形 劑或載體(vehicle)。藥學(xué)上可接受的載劑優(yōu)選地為無菌液體，諸如水、油和水凝膠。優(yōu)選 地，將水或水溶液、鹽溶液和葡萄糖水溶液和甘油水溶液用作載劑，尤其用于可注射溶液。 尤其對可注射培養(yǎng)基而言，最優(yōu)選地，使用水凝膠作為載劑。
[0025] 在本發(fā)明的背景中，術(shù)語"治療有效量"意味著至少10%、優(yōu)選地至少20%、優(yōu)選地 至少50%、優(yōu)選地至少60%、優(yōu)選地至少70%、優(yōu)選地至少80%、優(yōu)選地至少90%、優(yōu)選地至 少99%、優(yōu)選地100%的可分化細(xì)胞、優(yōu)選未分化細(xì)胞分化成屯、肌細(xì)胞，所述可分化細(xì)胞優(yōu) 選地選自由干細(xì)胞(優(yōu)選多潛能干細(xì)胞、屯、臟干細(xì)胞、屯、臟祖細(xì)胞、多能干細(xì)胞和它們的組 合)組成的組。優(yōu)選地，W治療有效量將至少一種糖基化蛋白質(zhì)施用于有此需要的人類或動(dòng) 物受試者，從而與在不添加糖基化蛋白質(zhì)(尤其是在藥物組合物中的糖基化蛋白質(zhì)）的相同 情況下被分化的可分化細(xì)胞、優(yōu)選未分化細(xì)胞相比，多達(dá)至少1.1倍、優(yōu)選至少1.2倍、優(yōu)選 至少1.3倍、優(yōu)選至少1.4倍、優(yōu)選至少1.5倍、優(yōu)選至少2倍、優(yōu)選至少5倍、優(yōu)選至少10倍的 可分化細(xì)胞、優(yōu)選未分化細(xì)胞分化成屯、肌細(xì)胞，所述可分化細(xì)胞選自由干細(xì)胞(優(yōu)選為胚胎 干細(xì)胞、屯、臟干細(xì)胞、屯、臟祖細(xì)胞、多能干細(xì)胞和它們的組合)組成的組。
[0026] 在本發(fā)明的背景中，"編碼"特定蛋白質(zhì)的"生物分子"是核酸分子，當(dāng)該核酸分子 受到適當(dāng)調(diào)控序列的控制時(shí)，其在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄且任選地還翻譯成基因產(chǎn)物（例如多 膚）。編碼區(qū)可WcDNA、基因組DNA或RNA形式存在。當(dāng)WDNA形式存在時(shí)，核酸分子可為單鏈 (其為有義鏈)或雙鏈。通過5'（氨基)末端處的起始密碼子和3'（簇基)末端處的翻譯終止密 碼子來確定編碼區(qū)的邊界。
[0027] 在本發(fā)明的背景中，術(shù)語"重組DNA分子"理解為包含借助于分子生物技術(shù)連接在 一起的DNA片段的DNA分子。
[0028] 在本發(fā)明的背景中，術(shù)語"重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)"理解為由重組DNA分子表達(dá)的蛋白 質(zhì)。重組DNA(rDNA)分子為包含借助于分子生物技術(shù)連接在一起的DNA片段的DNA序列。
[0029] 在本發(fā)明的背景中，"體外"理解為人造環(huán)境和發(fā)生在人造環(huán)境內(nèi)的過程或反應(yīng)。 體外環(huán)境可優(yōu)選地包括試管和細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0030] 術(shù)語"細(xì)胞外基質(zhì)"意為可見于動(dòng)物或人類組織的細(xì)胞之間并且在組織中充當(dāng)結(jié) 構(gòu)元件的富含蛋白質(zhì)的物質(zhì)。它通常包含由細(xì)胞分泌的多糖和蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物。所用 細(xì)胞外基質(zhì)可W用各種方式分離并且處理。細(xì)胞外基質(zhì)材料化CM)優(yōu)選地來源于細(xì)胞或干 細(xì)胞，或分離自小腸粘膜下層、胃粘膜下層、膀脫粘膜下層、組織粘膜、硬膜、肝基底膜、屯、 肌、屯、包膜或其他組織。在分離和處理后，該細(xì)胞外基質(zhì)材料通常稱為細(xì)胞外基質(zhì)ECM材料。 [0031 ]術(shù)語"藥物組合物"應(yīng)理解為提供一些治療性和/或有益效應(yīng)，優(yōu)選地在動(dòng)物或人 類中、優(yōu)選地在溫血哺乳動(dòng)物中、優(yōu)選地在人中產(chǎn)生一種或多種局部或全身效應(yīng)的配制物。
[0032] 在本發(fā)明背景中，術(shù)語"有此需要的受試者"理解為已經(jīng)經(jīng)歷或正經(jīng)歷局部缺血的 任何動(dòng)物或人受試者，所述局部缺血優(yōu)選選自W下的一種或多種：屯、肌梗塞、慢性屯、力衰 竭、缺血性屯、臟病、冠狀動(dòng)脈病、糖尿病性屯、臟病、血栓性中風(fēng)(thrombotic stroke)或栓塞 性中風(fēng)(embolic stroke)。動(dòng)物或人類受試者優(yōu)選地為溫血哺乳動(dòng)物，優(yōu)選地為人類。
[0033] 術(shù)語"施用"意為經(jīng)由適合于將功能劑或配制物或組合物遞送至治療部位的任何 方法來將藥物組合物或活性劑配制物提供至治療部位，例如受損組織。遞送方法優(yōu)選地為 在治療部位直接注射、經(jīng)皮遞送和局部施加。
[0034]在本發(fā)明的背景中，術(shù)語"治療（trea