Elatoside C在制備用于治療和預(yù)防缺血性心臟病藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了Elatoside C在制備用于治療和預(yù)防缺血性心臟病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的Elatoside C可以是Elatoside C的藥物組合物，包括口服及腸胃外給藥形式的各種劑型。用于口服時(shí)，可以是片劑、膠囊、軟膠囊、口服液、糖漿、顆粒、滴丸、口崩片、緩釋片、緩釋膠囊、控釋片、控釋膠囊；用于腸胃外給藥途徑時(shí)，可以是水針、凍干粉針、無菌粉針、輸液。本發(fā)明藥物組合物優(yōu)選片劑和水針劑型。
【專利說明】Elatoside C在制備用于治療和預(yù)防缺血性心臟病藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，本發(fā)明涉及一種藥用活性成分在制備藥物中的應(yīng)用，尤其涉及在Elatoside C制備藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]心肌缺血再灌注損傷是臨床上常見的病理過程，是制約急性心肌梗死患者從成功的再灌注療法中獲得最佳療效的主要因素之一。降低缺血再灌注對(duì)心肌損傷的程度一直是心臟病學(xué)臨床和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)課題。
[0003]龍牙惚木系五加科惚木屬植物，具有補(bǔ)氣安神、活血化瘀的功效。我們從80年代即開始了對(duì)龍牙惚木的系統(tǒng)研究，通過研究發(fā)現(xiàn)了龍牙惚木總皂苷治療冠心病、心絞痛的新用途，目前以龍牙惚木總皂苷為成分研制的惚木心脈通膠囊已獲得藥物臨床研究批件(批件2003L01111)，現(xiàn)已完成臨床觀察。盡管龍牙惚木總皂苷對(duì)心血管系統(tǒng)具有明顯的保護(hù)作用，化學(xué)成分研究較深入，但目前對(duì)其單體皂苷心血管活性方面的基礎(chǔ)研究薄弱，缺乏三萜皂苷結(jié)構(gòu)與功效相關(guān)性研究，并且分子機(jī)制尚不清楚，嚴(yán)重影響了龍牙惚木三萜皂苷的開發(fā)與臨床應(yīng)用。
[0004]我們通過對(duì)所分離得到的單體皂苷進(jìn)行活性篩選，發(fā)現(xiàn)其中單體皂苷ElatosideC(SM-3)對(duì)過氧化氫及缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷均具有顯著的保護(hù)作用。但是SM-3是否對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用尚需進(jìn)一步的驗(yàn)證，并且其具體保護(hù)機(jī)制尚不明確。
[0005]通過Elatoside C對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用進(jìn)行體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)探究。同時(shí)進(jìn)一步探究Elatoside C發(fā)揮上述保護(hù)作用的作用機(jī)制，以期為開發(fā)Elatoside C治療心血管疾病提供實(shí)驗(yàn)資料和理論依據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明公開了 Elatoside C在制備用于心肌保護(hù)作用的藥物中的應(yīng)用；
[0007]更具體地，本發(fā)明公開了 Elatoside C在制備用于缺血性心臟病保護(hù)作用藥物中的應(yīng)用；
[0008]本發(fā)明公開了 Elatoside C對(duì)缺血再灌誘導(dǎo)的離體心臟的保護(hù)作用的藥物中的應(yīng)用；
[0009]本發(fā)明公開了 Elatoside C對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2損傷的保護(hù)作用的藥物中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明所述的上述應(yīng)用，所述的Elatoside C為藥物組合物，由Elatoside C與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑制成藥物組合物。
[0011]本發(fā)明所述Elatoside C用于抗缺血性心臟病保護(hù)作用藥物為紅車軸草總黃酮的藥物組合物，所述藥物組合物最小單元所含活性成分Elatoside C的量為2.5_100mg。
[0012]本發(fā)明所述的Elatoside C藥物組合物為臨床上任何可接受的劑型形式，包括口服及腸胃外給藥形式的各種劑型。用于口服時(shí)，可以是片劑、膠囊、軟膠囊、口服液、糖漿、顆粒、滴丸、口崩片、緩釋片、緩釋膠囊、控釋片、控釋膠囊；用于腸胃外給藥途徑時(shí)，可以是水針、凍干粉針、無菌粉針、輸液。本發(fā)明藥物組合物優(yōu)選片劑和水針劑型。
[0013]上述藥物組合物，所述藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑可選自適用于口服制劑的藥用賦形劑，包括填充劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑、助溶劑、表面活性劑、吸附載體等。
[0014]上述藥物組合物，所述藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑可選自適用于注射劑的藥用賦形劑，包括溶劑、抗氧劑、助溶劑、吸附劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、PH調(diào)節(jié)劑。
[0015]藥物組合物最小單元是指一片，一顆膠囊，一袋顆?；蛞恢ё⑸鋭┑?。
[0016]本發(fā)明劑型可使用藥物制劑工藝學(xué)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的慣常使用的任何方法產(chǎn)生并且對(duì)此沒有特別限制。
[0017]例如，本發(fā)明片劑可通過使用本領(lǐng)域公知的合適的方法粒化、干燥和篩分主要藥劑和賦形劑、粘合劑等等，向所得混合物中加入潤(rùn)滑劑等等然后混合并形成片劑。造?？赏ㄟ^本領(lǐng)域公知的任何合適的方法進(jìn)行，例如濕法造粒、干法造粒或加熱造粒。合適的非限制性實(shí)例包括使用高速攪拌造粒機(jī)、流動(dòng)造粒干燥機(jī)、擠壓造粒機(jī)或滾筒壓緊器進(jìn)行這些造粒方法。此外，例如干燥和篩分的方法可以根據(jù)進(jìn)行造粒的需要進(jìn)行。主要藥劑、賦形劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑等等的混合物還可直接形成片劑。
[0018]如果需要薄膜包衣，可以使用本領(lǐng)域已知的任何薄膜包衣裝置，并且作為薄膜包衣基質(zhì)，合適的實(shí)例包括糖衣基、親水膜包衣基、腸溶薄膜包衣基和緩釋薄膜包衣基。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1 Elatoside C對(duì)大鼠離體心臟再灌注后心臟收縮功能的影響。如圖所示，與I/R組相比，Elatoside C各劑量組能不同程度地改善再灌注后的心臟收縮功能相關(guān)指標(biāo)(LVSP, HR, ±dp/dtmax)。
[0020]圖2 Elatoside C對(duì)大鼠離體心臟LDH含量的影響。如圖所示，與對(duì)照組相比，缺血再灌組心肌冠脈流出液中LDH的含量明顯增加。與I/R組相比，Elatoside C 50、10、2nmol/L預(yù)處理組LDH的漏出明顯減少，具有劑量依賴關(guān)系。
[0021 ] 圖3 Elatoside C對(duì)H202誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。如圖所示，Elatoside C對(duì)H202誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的量效關(guān)系。Elatoside C對(duì)H202誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的量效關(guān)系結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組差異具有顯著性；與模型組相比，Elatoside C預(yù)孵育12h時(shí)，Elatoside C組及槲皮素20ug/ml組差異具有顯著性。
[0022]圖4 Elatoside C對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用的量效關(guān)系。如圖所示，與對(duì)照組相比，缺氧復(fù)氧損傷組可顯著降低細(xì)胞存活率，具有顯著性差異；與模型組相比，Elatoside C(12.5、25、50ug/ml)孵育4_24h均可抑制缺氧復(fù)氧導(dǎo)致的細(xì)胞存活率的降低，差異具有顯著性。
[0023]圖5流式檢測(cè)Elatoside C對(duì)缺氧復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位的影響。如圖所示，缺氧復(fù)氧損傷組引起線粒體膜電位的下降，表現(xiàn)為熒光信號(hào)由右上向左下的偏移。而Elatoside C顯著減輕缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的線粒體膜電位的下降。
[0024]圖6 Elatoside C對(duì)缺氧復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體ROS的影響。如圖所示，與正常對(duì)照組相比，Elatoside C處理可以降低缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的ROS釋放，而缺氧復(fù)氧組可以提高ROS水平。
[0025]圖7 Elatoside C對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。如圖所示，與空白對(duì)照組相比，模型組顯著上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，降低Bcl-2/Bax的比例，促進(jìn)凋亡；而給予Elatoside C孵育后，可顯著抑制缺氧復(fù)氧引起的Bax表達(dá)的上調(diào)及Bcl-2表達(dá)的下調(diào)，從而抑制凋亡。

【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步限制。
[0027]實(shí)施例1 Elatoside C對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
[0028]實(shí)施例1.1 Elatoside C對(duì)大鼠離體心臟收縮功能檢測(cè)
[0029]使用大鼠心臟，將心臟主動(dòng)脈與心臟灌流裝置(Langendorff)相連接，進(jìn)行逆向灌流。同時(shí)記錄心率，左室收縮壓(LVSP)以及左室內(nèi)壓力的變化率最大值(土dp/dtmax)。采用Global缺血30min再灌注60min的I/R模型。實(shí)驗(yàn)分組:60只大鼠隨機(jī)分為5組，正常對(duì)照組(Control)、缺血/再灌注損傷組(I/R)、Elatoside C 50、10、2nmol/L預(yù)處理15min 組。
[0030]結(jié)果如圖1所示，Elatoside C能改善再灌注后的心臟收縮功能。
[0031]實(shí)施例1.2 Elatoside C對(duì)大鼠離體心臟LDH含量的影響
[0032]實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，接取灌流液按試劑盒說明書檢測(cè)各組LDH含量。
[0033]結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組相比，缺血再灌組心肌冠脈流出液中LDH的含量明顯增力口。與I/R組相比，Elatoside C 50、10、2nmol/L預(yù)處理組LDH的漏出明顯減少，具有劑量依賴關(guān)系。
[0034]實(shí)施例2 =Elatoside C對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用
[0035]實(shí)施例2.1 Elatoside C對(duì)H202誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
[0036]實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組、H2O2損傷組、Elatoside C預(yù)處理組(0.75-12.5、ug/ml) ,MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。正常對(duì)照組(control)每孔給予10ul無血清DMEM培養(yǎng)液；H202損傷組(model)每孔給予10ul終濃度為150uM的H2O2,作用6h ；Elatoside C處理組(12.5、25、50ug/ml)預(yù)孵育4_12h后，吸棄含藥培養(yǎng)液，加入10ul無血清培養(yǎng)液配制的終濃度為150uM的H2O2作用6h。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率。
[0037]如圖3所示，Elatoside C對(duì)H202誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的量效關(guān)系。Elatoside C對(duì)H202誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用的量效關(guān)系結(jié)果顯示，與對(duì)照組相t匕，模型組差異具有顯著性；與模型組相比，Elatoside C預(yù)孵育12h時(shí)，Elatoside C組及槲皮素20ug/ml組差異具有顯著性。
[0038]實(shí)施例2.2 Elatoside C對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用的時(shí)效關(guān)系研究
[0039]實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組,缺氧復(fù)氧損傷組，Elatoside C(12.5、25、50ug/ml)五組分別在復(fù)氧時(shí)孵育2-24h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。
[0040]如圖4所示，與對(duì)照組相比，缺氧復(fù)氧損傷組可顯著降低細(xì)胞存活率，具有顯著性差異；與模型組相比，Elatoside C(12.5、25、50ug/ml)孵育4_24h均可抑制缺氧復(fù)氧導(dǎo)致的細(xì)胞存活率的降低，差異具有顯著性。
[0041]實(shí)施例2.3 Elatoside C對(duì)缺氧復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位的影響(JC_1染色)
[0042]將H9c2細(xì)胞以I X 105個(gè)/ml的密度置于6孔板中，每孔加2ml，待生長(zhǎng)至單層融合后，分為5組:正常對(duì)照組、缺氧復(fù)氧損傷組、Elatoside C (12.5、25、50ug/ml)孵育4_12h組。實(shí)驗(yàn)終止，胰酶消化收集細(xì)胞。100rpm離心5min。加Iml DMEM培養(yǎng)液洗細(xì)胞一次。重新加入Iml DMEM培養(yǎng)液，細(xì)胞計(jì)數(shù)。按所需量加入JC-1染料(終濃度2 μ M)。37°C避光染色30min。離心(100rpmX 5min)去除多余染料。加入2ml PBS清洗細(xì)胞一次。加入500 μ I PBS，過濾后上機(jī)檢測(cè)。
[0043]如圖5所示，缺氧復(fù)氧損傷組引起線粒體膜電位的下降，表現(xiàn)為熒光信號(hào)由右上向左下的偏移。而Elatoside C顯著減輕缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的線粒體膜電位的下降。
[0044]實(shí)施例2.4 Elatoside C對(duì)缺氧復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體ROS的影響
[0045]細(xì)胞傳代鋪于6孔板中(I X 15個(gè)/ml)，每孔2ml，待生長(zhǎng)至單層融合后，分為5組，各組處理同實(shí)施例2.3。按ROS檢測(cè)試劑盒操作說明書進(jìn)行檢測(cè)。收集各組細(xì)胞用MitoSOX Red (2.5 μ M)在黑暗中37°C孵育20 min。染色后用Hanks清洗一次。熒光通過酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)485nm和發(fā)射波長(zhǎng)530nm下進(jìn)行測(cè)定。
[0046]如圖6所示，與正常對(duì)照組相比，Elatoside C處理可以降低缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的ROS釋放，而缺氧復(fù)氧組可以提高ROS水平。
[0047]實(shí)施例2.5 Western blot檢測(cè)Elatoside C對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
[0048]實(shí)驗(yàn)處理終止，收集細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞2次后裂解細(xì)胞。裂解終止后，將細(xì)胞裂解液在4°C、12 OOOXg離心15min，收集上清液用于蛋白表達(dá)分析。采用BCA蛋白定量法確定蛋白濃度，然后10% SDA-PAGE電泳分離。電泳完畢后，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，用麗春紅染色觀測(cè)蛋白轉(zhuǎn)移是否完全，TBST脫色后用脫脂牛奶室溫封閉2h。分別加入相應(yīng)的一抗抗體(Bcl-2、Bax、β -actin)，4°C孵育過夜。TBST洗滌后，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育lh，TBST洗滌后采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白的變化。
[0049]如圖7所示，與空白對(duì)照組相比，模型組顯著上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，降低Bcl-2/Bax的比例,促進(jìn)凋亡；而給予Elatoside C孵育后，可顯著抑制缺氧復(fù)氧引起的Bax表達(dá)的上調(diào)及Bcl-2表達(dá)的下調(diào)，從而抑制凋亡。
[0050]顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而這些屬于本發(fā)明的精神所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。
【權(quán)利要求】
1.￡1^081(16 0在制備心肌細(xì)胞保護(hù)作用的藥物中的應(yīng)用。
2.￡1^081(16 0在制備用于缺血性心臟病保護(hù)作用藥物中的應(yīng)用。
3.￡1^081(16 0在制備用于缺血再灌誘導(dǎo)心肌組織損傷的保護(hù)作用藥物中的應(yīng)用。
4.￡1^081(16 0在制備用于缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1?4任一所述的應(yīng)用，其中￡131:081(160^21^11:081(16 0的藥物組合物，是由￡131:081(16 0與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中所述藥物組合物最小單元所含活性成分￡1^1:081(16 0 的量為 2.5-100呢。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中所述的￡1^081(16藥物組合物為臨床上任何可接受的劑型形式.8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中所述的劑型形式包括口服及腸胃外給藥形式的各種劑型；用于口服時(shí)，可以是片劑、膠囊、軟膠囊、口服液、糖漿、顆粒、滴丸、口崩片、緩釋片、緩釋膠囊、控釋片、控釋膠囊；用于腸胃外給藥途徑時(shí)，可以是水針、凍干粉針、無菌粉針、輸液。
8.權(quán)利要求書缺8
9.根據(jù)權(quán)要求5所述的應(yīng)用，其中所述的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑可選自適用于口服制劑的藥用賦形劑，包括填充劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑、助溶劑、表面活性劑、吸附載體等；也可選自適用于注射劑的藥用賦形劑，包括溶劑、抗氧劑、助溶劑、吸附劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、四調(diào)節(jié)劑。
【文檔編號(hào)】A61P9/00GK104306387SQ201410504787
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】孫曉波, 孫桂波, 許旭東, 王敏, 張小坡 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所