專利名稱：抗血管抑素受體人鼠嵌合單克隆抗體制備及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及抗血管抑素受體人鼠嵌合單克隆抗體制備及其應用。
背景技術：
近年發(fā)現(xiàn)，ATP合成酶不僅存在于線粒體內(nèi)膜，在內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞質膜表面也有表達。1995年，Mozer和Pizzo對血管抑素(環(huán)餅域1- 在內(nèi)皮細胞表面的結合位點進行了鑒定。通過對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)膜組分進行配體雜交，成功分離了與血管抑素結合的，大小約^kD的蛋白。通過對蛋白進行氨基末端測序、肽指紋圖譜及免疫學分析表明，抗腫瘤血管新生藥血管抑素在該細胞表面的受體為人FlFO-ATP合成酶的α/β亞基 (基因名分別為ΑΤΡ5Α1和ΑΤΡ5Β)。這一受體在細胞表面的存在通過流式細胞術和免疫熒光分析得到了證實。另外，血管抑素能與重組ΑΤΡ5Α1結合，抗ΑΤΡ5Α1的抗體能將血管抑素的抗細胞增殖效果抑制掉90 %。綜上所述，細胞表面的ΑΤΡ5Α1/ΑΤΡ5Β是血管抑素在內(nèi)皮細胞表面的受體，血管抑素可能通過與ΑΤΡ5Α1/ΑΤΡ5Β亞基的結合，抑制內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，從而抑制血管新生。傳統(tǒng)認為，人FlFO-ATP合成酶僅存在于細胞線粒體內(nèi)膜，但Mozer的發(fā)現(xiàn)表明其在內(nèi)皮細胞表面也有定位。在Mozer的研究公開前，關于FlFO-ATP合成酶在細胞膜表面定位的報道僅有一例，是定位于腫瘤細胞系Α549的表面。在Mozer的研究公開后，血管抑素與細胞表面ATP合成酶的結合，又被其它的研究團體在不同的腫瘤細胞類型證實。在除內(nèi)皮細胞外的許多其它類型細胞，包括腫瘤細胞、上皮細胞、成纖維細胞、肝細胞都發(fā)現(xiàn)了定位于細胞膜表面的FlFO-ATP合成酶，這些類型的細胞都具有較強的增殖力，而在紅細胞中未發(fā)現(xiàn)。這提示FlFO-ATP合成酶也許能作為腫瘤標志物來檢測，對腫瘤的早期診斷和預后具有重大的意義。在Das和Mozer提出哺乳動物細胞存在將某些線粒體蛋白定位于胞膜表面的現(xiàn)象后，涌現(xiàn)出大量有關線粒體基質蛋白定位于胞膜的報道，而這些蛋白在其異常定位上往往也是有某種功能的，如蛋白Ρ32，又名gClq，是補體蛋白Clq的受體，提示定位于胞膜表面的 FlFO-ATP合成酶也在行使某種特殊的功能。在Mozer的研究中，膜表面的FlFO-ATP合成酶作為血管抑素抑制增殖的靶點而被發(fā)現(xiàn)，隨后發(fā)現(xiàn)的具有膜表達人FlFO-ATP合成酶的細胞都屬于增殖力較強的類型，提示膜表達的人FlFO-ATP合成酶可能具有促增殖作用，不僅是腫瘤的標志，還可能是癌變的促因。如果能成功驗證膜表達的人FlFO-ATP合成酶對腫瘤的促進作用，將使其腫瘤靶標的地位進一步鞏固，并可針對其促增殖功能設計相應的藥物進行抑制，以期特異高效地治療腫瘤。Chi等用純化的E. coli Fl-ATP合成酶免疫小鼠，得到21株單克隆抗體(mAb)，其中只有一株mAb是針對催化亞基ATP5B的，其余20株均是針對非催化亞基ATP5A1的，而只有針對β亞基的那株mAb具有抑制Fl-ATP合成酶活性的作用。而Mozer之前的研究報道， 血管抑素在HUVEC表面的受體由ATP5A1和ATP5B共同構成，故本研究著重對ATP5A1亞基的腫瘤相關性進行，并針對ATP5B亞基制備mAb并進行人源化，以期開發(fā)相應的抗體藥物。19世紀末，人們用癌細胞免疫動物產(chǎn)生抗血清來治療癌癥。然而，由于抗血清是多克隆抗體，其中含有眾多分別針對不同抗原的抗體，缺乏特異性，故用其治療癌癥不可能取得確切的療效。20世紀后期，Georges Kohler和Cesar Milstein用細胞雜交技術使經(jīng)綿羊紅細胞(SRBC)免疫的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合(圖1-1)，建立了世界上首株B細胞雜交瘤細胞株，該細胞株能長期、穩(wěn)定地分泌特異、均質的抗SRBC的單克隆抗體(monoclonal antibody,mAb)0這一技術獲得1984年的諾貝爾生理醫(yī)學獎。mAb對抗原的高特異性使定向攻擊腫瘤細胞成為可能。之后的數(shù)十年里，mAb在疾病診斷領域成為常規(guī)試劑，而在治療領域對其的研究也迅速升溫。在20世紀末期，由于目前技術的局限，制備的多為鼠雜交瘤，產(chǎn)生的mAb就多為鼠源性，在人體中極易產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)反應，使mAb用于治療的研究受到限制，進入了低谷階段。于是，研究者把基因工程技術引入單抗研究，探索通過基因操作的手段將鼠源mAb 嵌合或人源化。最早報道的基因工程抗體是莫里森(Morrison)等研制的人-鼠嵌合抗體， 該技術對抗體的臨床應用影響深刻。嵌合抗體是通過基因工程將鼠源單抗可變區(qū)和人抗體恒定區(qū)拼接的抗體，相對于其它人源化抗體的優(yōu)點在于其技術路線簡單；抗體完整性好，體內(nèi)潴留期長。利妥昔單抗(rituximab)于1997年獲得FDA批準，是全球第一個上市的抗腫瘤mAb藥物，用于治療CD20陽性的B淋巴細胞性非霍奇金淋巴瘤，該抗體就是一個嵌合抗體。第一個用于臨床的嵌合抗體是阿來組單抗(alemtuzumab)，用于治療非何杰金氏淋巴瘤和類風濕性關節(jié)炎。曲妥珠單抗(trastuzumab)于1998年獲批，是一種可以抑制HER-2/neu 陽性乳腺癌的mAb藥物，該抗體是一個人源化抗體。吉妥單抗(gemtuzumab ozogamicin) 于2000年獲批，用于治療CD33陽性的急性復發(fā)性髓性白血病，該抗體也是一個人源化抗體。近年來，先后獲批用于治療腫瘤的抗體藥物還有90Y-ibritumomab、131I-tositumomab、 cetuximab和bevacizumab等，其中嵌合或人源化的抗體所占的比例逐年提升，全人抗體已成為治療類抗體在抗體類型上必然趨勢。目前已有超過20種嵌合抗體已進入臨床試驗階段，還有為數(shù)眾多的嵌合或人源化抗體處于臨床前研究中。嵌合抗體可變區(qū)基因的克隆，通常是參考Kabat數(shù)據(jù)庫中的抗體序列，針對抗體可變區(qū)的保守區(qū)域設計若干套通用引物，采用RT-PCR法從雜交瘤細胞株的mRNA擴增可變區(qū)基因，該方法簡單實用。通常5’端通用弓I物設計在第一骨架區(qū)或前導肽區(qū)；3，端通用弓丨物設計在恒定區(qū)或J鏈區(qū)。嵌合抗體恒定區(qū)由抗體亞型決定，不同的亞型具有不同的免疫效應，故可根據(jù)需要的免疫效應選擇不同的亞型恒定區(qū)進行擴增。IgGl適于介導抗體依賴的細胞毒作用 (ADCC)和補體依賴的細胞毒作用(CDC)，而IgG2和IgG4則適于激活或阻斷某一受體。抗體的恒定區(qū)不僅能提供效應功能，還能通過于組織細胞表面的IgGFc受體Fc y Rn結合，免受蛋白酶類降解，在體內(nèi)保持較長半衰期(20多天)。嵌合抗體的重輕鏈表達單位可串聯(lián)于一個表達載體上，也可分別構建于兩個載體上共轉染，有文獻報道，串聯(lián)表達載體的轉化子中產(chǎn)生抗體的克隆的比例，顯著高于共轉染表達載體。目前用于增加目的基因擴增的篩選標志主要有二氫葉酸還原酶(DHFR)和谷氨酰胺合成酶(GS)兩種。而用于臨床治療用抗體表達的系統(tǒng)主要是CHO細胞系統(tǒng)，該系統(tǒng)能為嵌合抗體的恒定區(qū)提供有效的糖基化。文獻報道，通過選擇有效的表達載體和篩選系統(tǒng)， 抗體表達量可提高到300-900mg/L。嵌合抗體技術與其它人源化技術比，具有構建周期短，不易引起親和力降低等優(yōu)勢，因而本研究在進行人源化改造時優(yōu)先考慮嵌合抗體的技術路線。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種抗血管抑素受體人源化嵌合抗體，以及編碼該抗體的 DNA序列，構建了含該DNA序列的真核細胞表達載體，篩選并保存了穩(wěn)定高表達該抗體的宿主細胞株，建立純化該抗體的工藝方法。并公開了上述抗體與同類產(chǎn)品的比較的檢測結果。本發(fā)明第一方面公開了一種抗血管抑素受體人鼠嵌合單克隆抗體，包括抗體輕鏈元件和抗體重鏈元件，其輕鏈氨基酸序列為SEQ ID NO :1或其保守型變異序列，其重鏈氨基酸序列為SEQ ID NO :2或其保守型變異序列，重鏈和輕鏈通過二硫鍵連接。本發(fā)明第二方面公開了一種分離的DNA分子，編碼前述抗血管抑素受體人鼠嵌合單克隆抗體的重鏈和/或輕鏈的可變區(qū)或全長氨基酸。本發(fā)明第三方面公開了一種載體，含有前述分離的DNA分子。本發(fā)明中的表達載體指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。具體的，所述載體可為pCI-neo寸。本發(fā)明第四方面公開了一種宿主細胞，它含有前述載體。本發(fā)明中的宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CH0，或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。較佳的，該宿主細胞是CHO細胞，保存號為20089278。本發(fā)明第五方面，公開了前述抗血管抑素受體人鼠嵌合單克隆抗體的制備方法， 為在表達所述抗體的條件下，培養(yǎng)前述宿主細胞，從而表達出所述的抗體，和純化分離所述的抗體。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法〔如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理〔鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC〕和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。本發(fā)明從單克隆培養(yǎng)的細胞株中篩選獲取目的抗體的基因序列，用以構建真核表達載體，表達后即可重建抗體的活性，獲得抗血管抑素受體人鼠嵌合單克隆抗體。本發(fā)明第六方面，公開了上述抗血管抑素受體人鼠嵌合單克隆抗體在制備抗腫瘤類藥物上的用途。
本發(fā)明第七方面，公開了一種藥物組合物，包括治療有效量的前述抗血管抑素受體人鼠嵌合單克隆抗體。本發(fā)明的單克隆抗體可以通過本領域任何已知的方式配制藥物組合物來使用。這種組合物包含活性成分，加上一種或多種藥物可接受的載體、稀釋劑、填充劑、結合劑及其它賦形劑，這依賴于給藥方式及所設計的劑量形式。本領域枝術人員已知的治療惰性的無機或有機的載體包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蠟、脂肪、多羚基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，諸如此類，各種防腐劑、潤滑劑、分散劑、矯味齊 。保濕剮、抗氧化劑、甜味劑、著色劑、穩(wěn)定劑、鹽、緩沖液諸如此類也可加入其中，這些物質根據(jù)需要用于幫助配方的穩(wěn)定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情況下產(chǎn)生可接受的口感或氣味，在這種組合物中可以使用抑制劑可是其原始化合物本身的形式，或任選地使用其藥物學可接受的鹽的形式，本發(fā)明的單克隆抗體可以單獨給藥，或以各種組合給藥，以及與其它治療藥劑一起結合形式給藥。如此配制的組合物根據(jù)需要可選擇本領域技術人員已知的任何適當?shù)姆绞桨岩种苿┻M行給藥。本發(fā)明還進一步對抗血管抑素受體單克隆抗體通過體外活性測定和動物實驗研究了該抗體在動物體內(nèi)的治療有效性。本發(fā)明提供的抗血管抑素受體的單克隆抗體為嵌合抗體，在保持其抗血管抑素受體活性的同時，使之更適合體內(nèi)應用。該單抗具有與腫瘤細胞膜表面天然抗原結合活性，并可明顯抑制腫瘤細胞膜表面ATP合成，對抗腫瘤治療有重要的意義。


圖1 實施例3對Α549細胞M小時抑制增殖作用試驗結果圖2 實施例3對Α549細胞48小時抑制增殖作用試驗結果圖3 實施例3對Α549細胞48小時抑制增殖作用試驗結果圖4 實施例3對Α549細胞72小時抑制增殖作用試驗結果圖5 實施例3對95-D細胞48小時抑制作用試驗結果圖6 實施例3本發(fā)明抗體對Α549細胞抑制ATP酶合成活性試驗結果圖7 實施例3本發(fā)明抗體對95-D細胞抑制ATP酶合成活性試驗結果
具體實施例方式下面結合實施例進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如分子克隆試驗手冊中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配制。實施例1嵌合抗體的制備以經(jīng)人ATP合成酶抗原免疫的小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞常規(guī)融合獲得雜交瘤細胞株，從中篩選出一株陽性克隆雜交瘤細胞株7Ε10。取陽性克隆雜交瘤7Ε10細胞株5000-10000個細胞，用Trizol (Invitrogen公司產(chǎn)品)分離總RNA，使用反轉錄酶(Invitrogen公司產(chǎn)品)以獲取cDNA。上述操在均按照廠家說明書進行。用下述引物和條件進行PCR，所用擴增酶為KOD plus (Τ0Υ0Β0)確保擴增過程中減少可能的突變。
6
抗體Fab區(qū)的擴增引物為4組，分別為mouse IgG_5，/mouse IgG1-3‘, mouseIgG-5‘ /mouse IgG2a-3‘, mouse IgG-5' /mouse IgG3-3', (LCi+LC2+LC3+LC4+LC5+LC6+LC7)/mouse kappa-3，，延伸時間 lmin。PCR 產(chǎn)物電泳回收， 并克隆至載體PMD19-T測序。根據(jù)Fab區(qū)測序結果設計引物，擴增可變區(qū)，并克隆至載體 PMD19-T 測序。PCR 條件a)反應體系的組成cDNAIuldNTP0. 5ulMgcl222ulBuffer2ulPrimer F0. 5ulPrimer R0. 5ulKODpIus0. 5ulH2O13ul20ul上機反應
94 °C 5min
94 °C 15sec-
50 °C 30sec40 cycle
72 °C lmin 72 °C IOmin--
4 °C...表1嵌合抗體相關引物設計擴增鼠重 mouse IgG-5，AGGTCCARCTKCTCGAGTCWGG(RA/G, KG/'T, WA/T) (SEQ ID N0:6)
鏈 Fab 區(qū) mouse IgGl-3'AGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAAT (SEQ ID NO:7)
mouse IgG2a-3''GTTCTGACTAGTGGGCACTCTGGGCTC (SEQ ID NO:8)
mouse IgG3-3'GGGGGTACTAGTCTTGGGTATTCTAGGCTC (SEQ ID NO:9)
擴增鼠輕 LClCCAGTTCCGAGCTCGTTGTGACTCAGGAATCT (SEQ ID NO: 10)
鏈 Fab 區(qū) LC2CCAGTTCCGAGCTCGTGTTGACGCAGCCGCCC (SEQ ID NO:11)
LC3CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA (SEQ ID NO:12)
LC4CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA (SEQ ID NO:13)
LC5CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA (SEQ ID NO:14)
l,C6CCAGATGTGAGCTCGTCATGACCCAGTCTCCA (SEQ TD NO: IS)
LC7CCAGTTCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCA (SEQ ID NO:16)
mouse kappa-3，GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA (SEQ ID NO:17)
輕鏈鼠信 7F10LP1a.t|GCTAGC|GCCGCCACCATGGACATGCGGGTT (SF.Q TD NO: 18)
號肽、可變 7E10L P2:AGCTCGCACCGTGCTCCGCGCAGCCA (SEQ ID NO: 19)
區(qū)與人恒 7E10L P3:TGCGCGGAGCACGGTGCGAGCTCGTGAT (SEQ ID KO:20)
定區(qū)拼接 7E10L P4:GCCACCGTACGGGTGCAGAAATAAATTCCCAGAT (SEQ ID NO:21)
7E10L P5ATCTGGGAATTTATTTCTGCACCCGTACGGTGGC (SEQ ID N0:22)
7E10L P6:tc|AAGCTTACGCGT|cTAACACTCTCCC (SEQ ID N0:23)
重鏈鼠信 71ilOLHI)l:at|GAATTC|GCCGCCACCATGGAGTTCGGAC:r (SEQ ID NO: 24)
號肽、可變 7E10LH P2:TGACTCGAGCAGCTGGACCTCACACTGCACACCCTTCAGGAT (SEQ ID NO:25)
R 與人恒 7E10LII P3:ATCCTGAAGGGTGTGCAGTGTGAGGTCCAGCTGCTCGAGTCA (SEQ ID N0:26)
定區(qū)拼接 7E10LH P4:CCTTGGTGGAGGCACTTGCACAGTAATAGACTGCA (SEQ ID NO:27)
7E10LII P5:TGCAGTCTATTACTGTGCAAGTGCCTCCACCAAGG (SEQ ID NO:28)
7E10LH P6:at|GCGGCCGC[rCATTTACCCGGAGACA (SEQ ID N0:29)雜交瘤細胞信號肽區(qū)擴增根據(jù)對重、輕鏈Fab區(qū)序列分析結果設計引物，應用cRACE法擴增雜交瘤細胞的信
號肽區(qū)。PCR產(chǎn)物電泳回收，并克隆至載體PMD19-T獲得pMD19-7E10L及pMD19_7E10H，測
序。人IgGl重、輕鏈恒定區(qū)擴增人IgGl重、輕鏈恒定區(qū)基因進行PCR擴增，并克隆至載體PMD19-T測序。拼接構建嵌合重鏈和嵌合輕鏈基因分別利用7E10LP1-P6的這組引物及7E10LHP1-P6這組引物，以7E10反轉錄所獲
得的cDNA為模板，使用拼接PCR(S0E-PCI )將7E10的信號肽區(qū)、可變區(qū)、人IgGl的重、輕鏈
恒定區(qū)進行拼接獲得嵌合重鏈和嵌合輕鏈基因。將兩者的PCR產(chǎn)物電泳回收，并克隆至載
SEQ ID NO 1嵌合輕鏈序列NheI 位點 +Kozak 序歹 1丨 + 信號肽 +FRl+ |CDRl| +FR2+ |CDR2| +FR3+CL+MluI核苷酸序歹Ij(SEQ ID NO 3)GCTAGCGCCGCCACCATGGACATGCGGGTTCCAGCCCAGCTTCTCGGACTTCTGCTGTTGTGGCTGCGC GGAGCACGGTGCGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCT TGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCT CCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACA GATTTCACACTCAAGATCAACAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTTCTGCACCCGTACGGTGGCTGCACCA TCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTC TATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAG CAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGACGCGT AAGCTT氨基酸序列(SEQID NO 1)MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCELVMTQTPLSLPVSL⑶QASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQ SPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGIYFCTRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC. 2 24aaSEQ ID NO 2 嵌合重鏈重鏈EcoRI—NotIEcoRI 位點 +Kozak 序列 + 信號肽 +FRl+ |CDRl| +FR2+ |CDR2| +FR3+CH+NotI核苷酸序列(SEQID NO :4)GAATTCGCCGCCACCATGGAGTTCGGACTCAGTTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGTGTGCAG TGTGAGGTCCAGCTGCTCGAGTCAGGACCTGAGCTGGTGAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGACTTCT GGATTCACATTCACTGACTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATT
9TATCCTTACAATGGTGCTACTGGCTACAACCAGAACTTCAAGAACAAGGCCACATTGACTGTAGACAGTTCCTCCAGT ACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGTGCCTCCACCAAGGGC CCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC TACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGC AACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGC CCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG ATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAG AGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGC AAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC CACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGCGGCCGC氨基酸序列(SEQID NO 2)EFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLLESGPELVKPGASVKISCKTSGFTFTDY匪HWVKQSHGKSLEWIGYI YPYNGATGYNQNFKNKATLTVDSSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDff
LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.448aa在測序獲得重、輕鏈可變區(qū)序列后，可以通過全合成或者拼接PCR的方法來獲得含有重、輕鏈可變區(qū)的序列的嵌合重鏈和嵌合輕鏈基因，此技術為本技術領域的技術人員所熟知。嵌合抗體的真核表達載體pCI-7E10H、pCI_7E10L、pCI_7E10LH的構建用NheI和MluI分別酶切嵌合輕鏈克隆載體pMD_7E10L及表達載體pCI-neo，電泳回收后，T4連接酶16°C連接池。連接產(chǎn)物轉化T0P10感受態(tài)細菌。重組質粒經(jīng)PCR和酶切鑒定后，篩選出陽性克隆PCI-7E10L。用EcoRI和NotI分別酶切嵌合重鏈克隆載體pMD_7E10H及表達載體pCI-neo，電泳回收后，T4連接酶16°C連接池。連接產(chǎn)物轉化TOPlO感受態(tài)細菌。重組質粒經(jīng)PCR和酶切鑒定后，篩選出陽性克隆PCI-7E10H。同時構建嵌合表達載體，將polyA和CMV克隆至pMD_19T載體，兩端分別添加 MluI和NotI酶切位點，在CMV序列之后、NotI酶切位點之前添加EcoRI位點，用EcoRI 和NotI酶切嵌合重鏈克隆載體pMD-7E10H，將重鏈片段切下，電泳回收目的片段。同時， EcoRI和NotI酶切pMD-polyA-CMV，T4連接酶16°C連接2h。連接產(chǎn)物轉化TOPlO感受態(tài)細菌。重組質粒經(jīng)PCR和酶切鑒定后，篩選出陽性克隆pMD-polyA-CMV-7E10H。pCI-neo、 pMD-polyA-CMV-7E10H 用 MluI 和 NotI 雙酶切，電泳回收 pCI-neo 和 polyA-CMV-7E10H 片段，T4連接酶16°C連接池。連接產(chǎn)物轉化T0P10感受態(tài)細菌。重組質粒經(jīng)PCR和酶切鑒定后，篩選出陽性克隆pCI-polyA-CMV-7E10H。用NheI和MluI雙酶切pMD_7E10L、 pCI-polyA-CMV-7E10H,電泳回收酶切產(chǎn)物，T4連接酶16°C連接2h。連接產(chǎn)物轉化T0P10 感受態(tài)細菌。重組質粒經(jīng)PCR和酶切鑒定后，篩選出陽性克隆pCI-7E10LH。表達載體 PCI-7E10LH中NheI位點與NotI位點之間的全長序列如下全長序列SEQ ID NO 5NheI 位點 +Kozak 序歹丨J + 信號肽 +FRl+ ^DRl| +FR2+ |CDR2| +FR3+CL+MluI +Po 1 γΑ+Pcmv+ EcoRI 位點 +Kozak 序列 + 信號肽 +FRl+ |CDRl| +FR2+ |CDR2| +FR3+CH+NotIGCTAGCGCCGCCACCATGGACATGCGGGTTCCAGCCCAGCTTCTCGGACTTCTGCTGTTGTGGCTGCGC GGAGCACGGTGCGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCT TGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCT CCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACA GATTTCACACTCAAGATCAACAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTTCTGCACCCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTC TATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAG CAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (輕鏈全長)ACGCGT (MluI 位點)ttccctttagtgagggttaatgcttcgagcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccac aactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctg
C 3.3. 3.3.3. C 3.agttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggagatgtgggaggttttttaaag caagtaaaacctctacaaatgtggtaaaatccgataagg(PolyA)tcaatattggccattagccatattattcattggttatatagcataaatcaatattggctattggccatt gcatacgttgtatctatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaatatgaccgccatgttggcattgatt attgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataact tacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagt aacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagt gtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgac cttacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagta caccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgtt ttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactgcgatcgcccgccccgttgacgcaaatgggcggt aggcgtgtaCRRtRRRaRRtctatataaRcaRaRctCRtttaRtRaaccRtcaRatcactaRaaRctttattRCRRta gtttatcacagttaaattgctaacgcagtcagtgcttctgacacaacagtctcgaacttaagctgcagtgactctctt aaggtagcc
ttgcagaagttggtcgtgaggcactgggcaggtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagacca atagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactt tgcctttctctccacaggtgtccactcccagttcaattacagctcttaaggctagagtacttaatacgactcactata RRCtaRCCtCRa (Pcmv)GAATTCGCCGCCACCATGGAGTTCGGACTCAGTTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGTGTGCAG TGTGAGGTCCAGCTGCTCGAGTCAGGACCTGAGCTGGTGAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAGACTTCT GGATTCACATTCACTGACTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGATATATT TATCCTTACAATGGTGCTACTGGCTACAACCAGAACTTCAAGAACAAGGCCACATTGACTGTAGACAGTTCCTCCAGT ACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGTGCCTCCACCAAGGGC CCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC TACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA CAGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGC AACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGC CCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG ATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTAC GTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAT GAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAG AGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGC AAGCTCACC
GTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC CACTACACG CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGCGGCCGC (重鏈全長)CH0-DG44細胞培養(yǎng)、轉染與加壓篩選CH0-DG44 細胞采用含 10% FBS,0. 03mmol/L 次黃嘌呤(H)、0. 003mmol/L 胸腺嘧啶脫氧核苷(T)、0. lmmol/L 脯氨酸(Pro)、0. lmmol/L 甘氨酸(Gly)、2mmol/L 谷氨酰胺、100U/ ml青鏈霉素的F12完全培養(yǎng)基在37°C、5%C02培養(yǎng)，常規(guī)按1 4傳代。7E10嵌合表達質粒(pCI-7E10LH)的轉染1)質粒抽提。2)細胞瞬時轉染細胞轉染按LipOfeCtamineTM2000操作說明書進行，以6孔板中的1孔為例，簡要步驟如下向該孔接種4X105細胞，37°C、5% CO2培養(yǎng)1 后換液 1次，12h后開始轉染，貼壁細胞在轉染時的理想?yún)R合度為90-95%。將4μ g質粒DNA和 10 μ lLipofectamine 2000分別用無抗生物、無血清的培養(yǎng)基稀釋至250 μ 1，溫和混勻，室溫靜置15min形成脂質體復合物。用PBS洗滌細胞一次，并加入aiilF12作培養(yǎng)基，再滴入脂質體復合物，將板前后振蕩，溫和混勻。37°C、5% CO2培養(yǎng)Mi后更換5ml含10% FBS的 F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48-7池，之后用不含H、T、Gly的無血清培養(yǎng)基EX-CELL 302培養(yǎng)以篩選dhfr+表型的細胞克隆。將在EX-CELL 302中培養(yǎng)的細胞消化，計數(shù)，按1. 5個細胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中進行亞克隆，采用羊抗人IgG(H+L)多抗包被的夾心ELISA篩選嵌合抗體高表達的克隆。挑選嵌合抗體表達最高的細胞克隆，按1 5傳代后換含30nmol/L氨甲喋呤(MTX)的 EX-CELL302選擇培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。待細胞適應了 30nmol/L MTX后，如前所述繼續(xù)進行亞克隆，篩選嵌合抗體表達最高的細胞克隆，按同樣方法相繼換含lOOnmol/L MTXU μ mol/L MTX的EX-CELL 302選擇培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，進行亞克隆，待96孔板細胞基本長滿后，換液繼續(xù)培養(yǎng)2d，取上清測定其嵌合抗體含量，以此法篩選嵌合抗體表達最高的細胞克隆。將細胞克隆移至25cm2培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)，待細胞長滿后，換液繼續(xù)培養(yǎng)4天，取上清測定其嵌合抗體含量，并以此次測得的抗體含量值為準，挑選嵌合抗體表達最高的細胞克隆E1，經(jīng)測序鑒定表達嵌合抗體的氨基酸序列符合預期。本發(fā)明構建了抗血管抑素的人鼠嵌合抗體基因，并在CH0-DG44細胞成功表達，表達產(chǎn)物之后簡稱7E10。表達產(chǎn)物保持了親本鼠抗的抗原結合性，同時在恒定區(qū)以人源代替了鼠源，在分泌克隆上清中表達量為40ng/ml。ELISA檢測7E10的表達1)間接ELISA檢測7E10的抗原結合性和人源性，每個樣品都用羊抗人 IgG (H+L) -HRP酶標二抗和羊抗鼠IgG (H+L) -HRP分別進行檢測。2)雙抗體夾心ELISAdSW 10 μ g/ml的羊抗人IgG (H+L)多抗包被酶標板過夜，以羊抗人IgG(H+L)-HRP酶標二抗。以rhATP5B包被酶標板進行間接ELISA實驗，用羊抗人IgG(H+L)-HRP為二抗時， 轉染細胞克隆El培養(yǎng)上清中的7E10既可結合包被的rhATP5B，也可被羊抗人IgG (H+L)識另IJ，呈現(xiàn)陽性反應。用羊抗鼠IgG(H+L)-HRP為二抗時，親本m7E10呈陽性反應，而嵌合抗體 7E10呈陰性反應(結果見表2。這證明7E10含有人抗體的恒定區(qū)片段，并與m7E10 —樣可以結合rhATP5B。表2間接ELISA檢測轉染細胞株嵌合抗體7E10的抗原結合性和人源性A 羊抗人 IgG(H+L) -HRP 為二抗，B 羊抗鼠 IgG(H+L)_HRP 為二抗
權利要求
1.一種抗血管抑素受體人鼠嵌合單克隆抗體，包括抗體輕鏈和抗體重鏈，其抗體輕鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO :1或其保守型變異序列，其抗體重鏈的氨基酸序列為SEQ ID NO 2或其保守型變異序列，重鏈和輕鏈通過二硫鍵連接。
2.一種分離的DNA分子，編碼權利要求1所述抗血管抑素受體人鼠嵌合單克隆抗體的重鏈和/或輕鏈的可變區(qū)或全長氨基酸。
3.一種載體，含有權利要求2所述分離的DNA分子。
4.一種宿主細胞，它含有權利要求3所述載體。
5.如權利要求1所述抗血管抑素受體人鼠嵌合單克隆抗體的制備方法，為在適合表達所述抗體的條件下，培養(yǎng)權利要求4所述宿主細胞，從而表達出所述的單克隆抗體，純化分離出所述的單克隆抗體。
6.如權利要求1所述抗血管抑素受體人鼠嵌合單克隆抗體在制備抗腫瘤類藥物上的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗血管抑素受體人鼠嵌合單克隆抗體，包括抗體輕鏈元件和重鏈元件，重鏈和輕鏈通過二硫鍵連接。本發(fā)明提供的單克隆抗體為嵌合抗體，在保持其抗人ATP合成酶活性的同時，更適合體內(nèi)應用。該抗體對乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用比較明顯，對肺癌A549細胞，肝癌HepG2細胞，前列腺PC-3,HUVEC細胞的增殖均有不同程度的抑制效果，能引起相關細胞的凋亡，并特異結合于腫瘤組織，特異性識別腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞膜。此外，該抗體能抑制腫瘤和內(nèi)皮細胞膜表面ATP合成酶活性，抑制細胞體外血管枝形成，抑制HUVEC細胞和乳腺癌細胞株MDA-MB-231的體外移行，對抗腫瘤治療有重要的意義。
文檔編號C07K16/28GK102464720SQ201010541538
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月12日 優(yōu)先權日2010年11月12日
發(fā)明者倪健, 朱向玲 申請人:蘇州工業(yè)園區(qū)晨健抗體組藥物開發(fā)有限公司