一種人體血清Aβ的定量檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人體血清Aβ的定量檢測方法，依次包括如下步驟：a)采用試劑盒預先配置鋪有抗Aβ肽結(jié)構(gòu)N-端選擇性氨基酸序列的特異的小鼠單克隆抗體與控溫和定速離心處理過的血漿樣本中Aβ進行捕獲性免疫反應，得反應復合物；b)所述反應復合物與抗Aβ特定氨基酸序列的兔抗人的Aβ抗體進行二次抗原－抗體反應，得反應結(jié)合物；c）所述反應結(jié)合物經(jīng)帶有酶底物的兔抗鼠的多克隆抗體進行顯色反應后，由分光光度儀進行定量測定。本發(fā)明方法提高了Aβ檢測靈敏度，簡化樣本處理以及操作程序，可供醫(yī)院臨床老年性癡呆病的實驗診斷、對攜帶癡呆遺傳史或癡呆危險基因人群,以及可疑隱匿患者進行疾病的篩查以及臨床新藥療效觀察/判定以及大專院校實驗研究。
【專利說明】一種人體血清Aβ的定量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測方法，特別涉及一種人體血清A β的定量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]Αβ (Amyloid peptide簡稱Αβ )是淀粉樣前體蛋白經(jīng)蛋白酶水解而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。在正常腦細胞內(nèi)有較少量的本底水平。但在病理條件下包括遺傳淀粉樣前體蛋白和水解酶基因突變以及環(huán)境污染或化學致癌物的作用可引起Αβ產(chǎn)物增加而導致Αβ的增高。Αβ增高和聚集在腦內(nèi)形成老年斑，最終破壞腦記憶功能導致失智或老年性癡呆。因此Αβ作為老年學癡呆病的生物標記物是目前致力于開發(fā)的唯一檢測方法。
[0003]由于Αβ是目前老年性癡呆病的關(guān)鍵致病因子和能反映病理發(fā)展過程的重要標志，國內(nèi)外多年來一直致力于研究有效的Αβ檢測方法和開發(fā)檢測試劑盒，國內(nèi)市場目前基本上是引進國際市場現(xiàn)有的Αβ檢測試劑盒進行檢測，近年來美國出售的Αβ檢測試劑盒靈敏度較低，檢測靈敏度的標準范圍不適應亞洲人群，而且不能滿足Αβ水平在疾病早期小幅升高的要求；目前日本市場出售的檢測試劑盒靈敏度較高，但其價格不僅十分昂貴而且要求復雜的樣本處理和特殊的檢測技能；此外歐洲市場出售的Αβ檢測試劑盒介于美國和日本，但存在著特異性不足，不夠穩(wěn)定和檢測誤差較大的弊病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種人體血清Αβ的定量檢測方法，能夠結(jié)合亞洲人群的生物特性，提高A β檢測靈敏度，簡化樣本處理及操作程序。
[0005]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題而采用的技術(shù)方案是提供一種人體血清Αβ的定量檢測方法，依次包括如下步驟:a)采用試劑盒預先配置鋪有抗A β肽結(jié)構(gòu)N-端選擇性氨基酸序列的特異的小鼠單克隆抗體與控溫和定速離心處理過的血漿樣本中Αβ進行捕獲性免疫反應，得反應復合物；b)所述反應復合物與抗Αβ特定氨基酸序列的兔抗人的Aβ抗體進行二次抗原一抗體反應，得反應結(jié)合物；c)所述反應結(jié)合物經(jīng)帶有酶底物的兔抗鼠的多克隆抗體進行顯色反應后，由分光光度儀進行定量測定。
[0006]進一步地，所述步驟a)中的試劑盒包括盒體、盒蓋和固定板，所述盒體內(nèi)置放有十個試劑瓶和一個免疫檢測板，所述十個試劑瓶和免疫檢測板由試劑板分隔固定，所述每個試劑瓶上附設(shè)有說明標簽，所述每個試劑瓶內(nèi)封閉包裝有試劑。
[0007]進一步地，所述試劑盒的盒體和盒蓋由硬紙或塑料板制成，所述試劑板由硬紙或塑料泡沫制成。
[0008]進一步地，所述十個試劑瓶中分別裝有:試劑1:人體Αβ淀粉樣肽；試劑II =NaH2PO4H20.Na2HPO4 緩沖溶液；試劑 III =NaN3.Block Ace.PBS 溶液；試劑 IV:NaH2PO4H2O ^Na2HPO4溶液；試劑V:BSA和Block Ace粉末；試劑V1:兔抗人的Αβ檢測抗體；試劑VI1:清洗免疫反應的平衡液；試劑珊:鼠抗兔的第二抗體；試劑IX =TMB顯色反應溶液；試劑 X:peroxidase 溶液。[0009]進一步地，所述裝有試劑V、試劑IX和試劑X的試劑瓶為棕色，其他試劑瓶為白色。
[0010]進一步地，所述試劑II 中 NaH2PO4H20.Na2HPO4 濃度為 20mM，EDTA 濃度為 2mM，NaCl濃度為 400mM，BSA、CHAPS、Block Ace 和 NaN3 濃度依次為 0.2%、0.05%,0.4% 和 0.05%，溶液pH值為7.0 ;所述試劑III中NaN3和Block Ace重量百分比濃度分別為10%和1%在PBS溶液中，溶液PH值為7.4 ;試劑IV中NaH2PO4H20.Na2HPO4濃度為20mM，EDTA濃度為2mM，NaCl濃度為400mM、BSA濃度為1%，溶液pH值為7.0 ;所述試劑VII為NaCl、KC1、Na2HPO4.7H20和KH2PO4的混合液，pH值為7.4。
[0011]進一步地，所述試劑V中BSA和Block Ace兩種粉末分裝在各自的兩個小管內(nèi)，Block Ace粉末使用用前分別溶解在試劑II和III的溶液中，所述BSA粉末使用前分別溶解在試劑II和IV的溶液中；所述試劑VI使用前溶于試劑IV的溶液中，并稀釋至樣本檢測濃度；所述試劑VII的容量為250ml，使用前用雙蒸水稀釋I倍；所述試劑珊在使用用前在試劑IV的溶液中稀釋至樣本檢測濃度。
[0012]進一步地，在采用所述試劑盒進行Αβ的定量檢測之前先配置如下溶液:1)配制工作濃度的樣本和標準品稀釋液:取出冷藏的試劑II，將10倍的25ml試劑II稀釋至250ml ;取出冷藏的試劑V，自然升至室溫，將其中一小管0.5g BSA和一小管Ig的Block Ace溶入稀釋后的試劑II中；2)配制工作濃度的緩沖基液:取出IOOml的IOxPBS加雙蒸水至1L，檢查pH值；3)配制封閉溶液:從試劑V中取出另一小管Ig的Block Ace粉末溶入試劑II溶到900ml的IxPBS再加IOOml的NaN3配制成IX的Block Ace封閉溶液；4)配制工作濃度的抗體稀釋溶液:取出10X的25ml的試劑IV，加入2475ml雙蒸水配成IX的抗體稀釋溶液，然后再加入另一小管0.5g的BSA粉末溶入到試劑工作濃度的抗體稀釋溶液中。
[0013]進一步地，在配置好工作濃度的溶液后，對人體血清A β進行定量檢測，包括如下步驟:1)取出冷藏鋪有Αβ抗體和塑料蓋膜封閉的免疫檢測板，自然升至室溫；2)準備定量檢測Aβ的標準品:將試劑I的標準品Αβ溶于含有BSA和Block Ace的樣本和標準品稀釋液中；并將溶解液依次稀釋至標準曲線的梯度濃度；3)準備待測樣本:將待測血液樣本在控溫和定速離心后取出上清液，進行蛋白定量；4)用工作濃度的樣本和標準品稀釋液將收集的待測樣本中的蛋白濃度統(tǒng)一稀釋至一致濃度所需量；5)揭開免疫檢測板的封閉膜，將工作濃度的樣本和標準品稀釋液加入免疫檢測板上的96孔反應小槽內(nèi)；將々3不同稀釋濃度的標準品依次加入相應的小孔后，再將一致濃度蛋白濃度的待測樣本加入檢測反應小槽內(nèi)；6)封閉96孔免疫檢測板，將免疫檢測板在定速震蕩儀室溫孵育1-3小時或4度無震蕩12-36小時；7)用工作濃度的緩沖基液清洗反應小槽三次；8)加封閉溶液在定速震蕩儀室溫孵育1-3小時或4度無震蕩12-36小時；9)取出冷藏的試劑VI，自然升至室溫；工作濃度的抗體稀釋溶液將其稀釋至IOml ;10)加稀釋的Αβ檢測抗體進反應小槽，在定速震蕩儀室溫孵育1-3小時或4度無震蕩12-36小時；11)用工作濃度的緩沖基液清洗反應小槽四次；
12)取出冷藏的試劑珊的鼠抗兔的第二抗體，自然升至室溫；用工作濃度的抗體稀釋溶液將其稀釋；13)加稀釋的A β檢測抗體進反應小槽在定速震蕩儀室溫孵育0.5-1.5小時；14)用工作濃度的緩沖基液清洗反應小槽三次；15)取出冷藏的的試劑IX和X，加溫至37度；取試劑IX和試劑X均勻混合；加混合液至每個反應小槽內(nèi)；根據(jù)顯色從淺至深藍色時，加入試劑IX，停止顯色反應；將檢測板置入分光光度計在450nm檢測反應溶液的OD值；根據(jù)OD值和Αβ的標準曲線確定樣本中Αβ的含量。
[0014]進一步地,所述步驟I)中定量測定標準曲線的梯度濃度為500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml>15.63pg/ml、7.86pg/ml、0pg/mlo
[0015]本發(fā)明對比現(xiàn)有技術(shù)有如下的有益效果:本發(fā)明提供的人體血清Αβ的定量檢測方法，通過采用試劑盒預先配置鋪有抗A β肽結(jié)構(gòu)N-端選擇性氨基酸序列的特異的小鼠單克隆抗體與血漿樣本中Αβ進行捕獲性免疫反應，然后與抗Aβ特定氨基酸序列的兔抗人的Αβ抗體進行二次抗原一抗體反應，經(jīng)帶有酶底物的兔抗鼠的多克隆抗體進行顯色反應后，由分光光度儀進行定量測定；該方法結(jié)合亞洲人群的生物特性，提高了 Αβ檢測靈敏度，簡化樣本處理以及操作程序或提供外包服務(wù)來彌補國外現(xiàn)存試劑盒進行檢測的缺點和不足，可供醫(yī)院臨床老年性癡呆病的實驗診斷、對攜帶癡呆遺傳史或癡呆危險基因人群，以及可疑隱匿患者進行疾病的篩查以及臨床新藥療效觀察/判定以及大專院校實驗研究，操作者只要按照試劑盒說明書在使用時完成最后步驟的試劑配置，按設(shè)計的操作步驟實施將能檢測包括血液，腦脊液，細胞培養(yǎng)液和腦組織提取液。簡化了多種實驗檢測中的繁瑣步驟，因此縮短了實驗檢測周期，節(jié)約財力物力和試驗操作的時間，滿足檢測流程的簡單化和檢測結(jié)果的準確性。
【具體實施方式】
[0016]本發(fā)明提供的人體血清Αβ的定量檢測方法，依次包括如下步驟:
[0017]步驟S1:采用試劑盒預先配置鋪有抗A β肽結(jié)構(gòu)N-端選擇性氨基酸序列的特異的小鼠單克隆抗體與控溫和定速離心處理過的血漿樣本中Aβ進行捕獲性免疫反應，得反應復合物；
[0018]步驟S2:所述反應復合物與抗A β特定氨基酸序列的兔抗人的A β抗體進行二次抗原一抗體反應，得反應結(jié)合物；
[0019]步驟S3:所述反應結(jié)合物經(jīng)帶有酶底物的兔抗鼠的多克隆抗體進行顯色反應后，由分光光度儀進行定量測定。
[0020]步驟SI中的試劑盒包括盒體、盒蓋和固定板，所述盒體內(nèi)置放有十個試劑瓶和一個免疫檢測板，其中十個試劑瓶和96孔免疫檢測板由試劑板分隔固定，所述每個試劑瓶上附設(shè)有說明標簽，所述每個試劑瓶內(nèi)封閉包裝有試劑。較佳地，所述試劑盒的盒體和盒蓋由硬紙或塑料板制成，所述試劑板由硬紙或塑料泡沫制成。
[0021]十個試劑瓶具體構(gòu)成如下:
[0022]試劑瓶1:白色塑料瓶，瓶內(nèi)封閉包裝著精確稱量的人Αβ淀粉樣肽(Αβ40和42)標準品，其凈重為Iug/管；用于標準曲線的繪制。此為試劑I。
[0023]試劑瓶2:白色塑料瓶，瓶內(nèi)裝有按固定重量和配比的NaH2PO4H20.Na2HPO4緩沖溶液，用于樣本和標準品的溶解和稀釋，其中NaH2PO4H20.Na2HPO4為20mM，EDTA濃度為2mM，NaCl 濃度為 400mM，BSA、CHAPS、Block Ace 和 NaN3 濃度依次為 0.2%、0.05%,0.4% 和 0.05%,溶液pH值為7.0,容量為25ml (10X);此為試劑II。
[0024]試劑瓶3:白色塑料瓶，瓶內(nèi)裝有按固定重量和配比的NaN3.Block Ace.PBS溶液，其中NaN3和Block Ace重量百分比濃度分別為10%和1%在PBS溶液中，溶液pH值為
7.4，用于降低非特異性A β檢測信號；此為試劑III。[0025]試劑瓶4:白色塑料瓶，瓶內(nèi)裝有按固定重量和配比的NaH2PO4H2O -Na2HPO4的溶液。其中 NaH2PO4H20.Na2HPO4 為 20mM，EDTA 濃度為 2mM，NaCl 濃度為 400mM、BSA 濃度為 1%，溶液pH為7.0，25ml (IOX)，用于A β檢測抗體濃度的配置；此為試劑IV。
[0026]試劑瓶5:棕色塑料瓶，瓶內(nèi)封閉包裝著準確重量的BSA和Block Ace粉末，兩種粉末分裝在各自的兩個小管內(nèi)，Block Ace每管凈重為lg，臨用前分別溶解在試劑II和III的溶液中，BSA每管凈重為0.5g，用于提高檢測信號分辨率，使用前分別溶解在試劑II和IV的溶液中，此為試劑V。
[0027]試劑瓶6:白色塑料瓶，瓶內(nèi)封閉包裝著精確含量的兔抗人Αβ淀粉樣肽抗體25ul，用于樣本的二次抗原一抗體反應以增加檢測的靈敏度，使用前溶于試劑IV的溶液中，稀釋至合適的樣本檢測濃度；此為試劑VI。
[0028]試劑瓶7:白色塑料瓶，瓶內(nèi)裝有按固定重量和配比清洗免疫反應的平衡液(IOxPBS)即 NaCl, KC1、Na2HPO4.7H20、KH2PO4, pH 值為 7.4，250ml，使用前將用雙蒸水稀釋至IX (I倍)，此為試劑IX。
[0029]試劑瓶8:白色塑料瓶，瓶內(nèi)封閉包裝著精確含量的鼠抗兔的第二抗體25ul，用于放大檢測的A β信號，使用前在試劑IV的溶液中稀釋至合適的樣本檢測濃度；此為試劑珊。
[0030]試劑瓶9:棕色塑料瓶，瓶內(nèi)封閉包裝氧化還原反應的TMB溶液，可使第二抗體發(fā)生酶聯(lián)反應，TMB溶液為25ml ;此為試劑IX。
[0031]試劑瓶10:棕色塑料瓶,瓶內(nèi)封閉包裝氧化還原反應的peroxidase (氧化酶)溶液，與TMB溶液反應可根據(jù)反應物呈現(xiàn)的顯色程度量化樣本抗原含量的測定，此為試劑X。
[0032]在采用試劑盒進行人體血清A β的定量檢測之前先配置如下工作濃度溶液:
[0033]1.配制工作濃度的樣本和標準品稀釋液:取出冷藏的試劑II，將10倍的25ml試劑II稀釋至250ml (IX);取出冷藏的試劑V，自然升至室溫，將其中一小管0.5g BSA和一小管Ig的Block Ace溶入稀釋后的試劑II中。
[0034]2.配制工作濃度的緩沖基液；取出IOOml的IOxPBS加雙蒸水至1L，檢查pH值。
[0035]3.配制封閉溶液:從試劑V中取出另一小管Ig的Block Ace粉末溶入試劑II溶到900ml的IxPBS再加IOOml的NaN3配制成IX的Block Ace封閉溶液。
[0036]4.配制工作濃度的抗體稀釋溶液:取出10X的25ml的試劑IV，加入2475ml雙蒸水配成IX的抗體稀釋溶液，然后再加入另一小管0.5g的BSA粉末溶入到試劑工作濃度的抗體稀釋溶液中。
[0037]在配置好工作濃度的溶液后，對人體血清A β進行定量檢測，具體包括如下步驟:
[0038]1.取出冷藏鋪有Αβ抗體和塑料蓋膜封閉的免疫檢測板，自然升至室溫。
[0039]2.準備定量檢測Αβ的標準品:定量測定標準曲線的梯度濃度為500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.63pg/ml、7.86pg/ml、0pg/ml。將試劑 I的標準品A β溶于200ul含有BSA和Block Ace的樣本和標準品稀釋液中，將溶解液加入1.8ml配成1000pg/ml母液,取出Iml母液加Iml稀釋液至500pg/ml,然后將250ul的500pg/ml加等量的稀釋液依次稀釋至標準曲線的梯度濃度。
[0040]3.準備待測樣本:將待測血液樣本在控溫和定速離心后取出上清液，進行蛋白定量;
[0041]4.用工作濃度的樣本和標準品稀釋液將收集的待測樣本中的蛋白濃度統(tǒng)一調(diào)整(稀釋)至一致濃度所需量；
[0042]5.揭開免疫檢測板的封閉膜，將25ul工作濃度的樣本和標準品稀釋液加入免疫檢測板的96孔反應槽內(nèi)。將Αβ不同稀釋濃度的標準品IOOul依次加入相應的反應槽后，再將IOOul —致濃度蛋白濃度的待測樣本加入檢測反應小槽內(nèi)；
[0043]6.封閉96孔免疫檢測板，將免疫檢測板在定速震蕩儀室溫孵育2小時或在4度無震蕩過夜；
[0044]7.用工作濃度的緩沖基液清洗反應小槽三次；
[0045]8.加IOOul封閉溶液在定速震蕩儀室溫孵育2小時或在4度無震蕩過夜；
[0046]9.取出冷藏的試劑Α/ΚΑβ檢測抗體)，自然升至室溫。工作濃度的抗體稀釋溶液將其稀釋至IOml ；
[0047]10.加IOOul稀釋的A β檢測抗體進反應小槽，在定速震蕩儀室溫孵育2小時或在4度無震蕩過夜；
[0048]11.用工作濃度的緩沖基液清洗反應小槽四次；
[0049]12.取出冷藏的VDI抗體(鼠抗兔的第二抗體)，自然升至室溫，工作濃度的抗體稀釋溶液將其稀釋至IOml ；
[0050]13.加IOOul稀釋的Αβ檢測抗體進反應小槽在定速震蕩儀室溫孵育I小時；
[0051]14.用工作濃度的緩沖基液清洗反應小槽三次；
[0052]15.取出冷藏的的試劑IX和X，水浴加溫至37度，取5.5ml試劑IX和5.5ml試劑X均勻混合，加IOOul至每個反應小孔內(nèi)；根據(jù)顯色從淺至深藍色時，加入試劑IX，停止顯色反應；將檢測板置入分光光度計在450nm檢測反應溶液的OD值；根據(jù)OD值和A β的標準曲線定量樣本中的Αβ的水平。
[0053]綜上，本發(fā)明提供的人體血清Αβ的定量檢測方法，通過采用試劑盒預先配置鋪有抗Αβ肽結(jié)構(gòu)N-端選擇性氨基酸序列的特異的小鼠單克隆抗體與血漿樣本中Αβ進行捕獲性免疫反應，然后與抗A β特定氨基酸序列的兔抗人的Aβ抗體進行二次抗原一抗體反應，經(jīng)帶有酶底物的兔抗鼠的多克隆抗體進行顯色反應后，由分光光度儀進行定量測定；該方法結(jié)合亞洲人群的生物特性，提高了 Αβ檢測靈敏度，簡化樣本處理以及操作程序或提供外包服務(wù)來彌補國外現(xiàn)存試劑盒進行檢測的缺點和不足，可供醫(yī)院臨床老年性癡呆病的實驗診斷、對攜帶癡呆遺傳史或癡呆危險基因人群，以及可疑隱匿患者進行疾病的篩查以及臨床新藥療效觀察/判定以及大專院校實驗研究，操作者只要按照試劑盒說明書在使用時完成最后步驟的試劑配置，按設(shè)計的操作步驟實施將能檢測包括血液，腦脊液，細胞培養(yǎng)液和腦組織提取液。簡化了多種實驗檢測中的繁瑣步驟，因此縮短了實驗檢測周期，節(jié)約財力物力和試驗操作的時間，滿足檢測流程的簡單化和檢測結(jié)果的準確性。
[0054]雖然本發(fā)明已以較佳實施例揭示如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當可作些許的修改和完善，因此本發(fā)明的保護范圍當以權(quán)利要求書所界定的為準。
【權(quán)利要求】
1.一種人體血清Αβ的定量檢測方法，其特征在于，依次包括如下步驟: a)采用試劑盒預先配置鋪有抗Aβ肽結(jié)構(gòu)N-端選擇性氨基酸序列的特異的小鼠單克隆抗體與控溫和定速離心處理過的血漿樣本中A β進行捕獲性免疫反應，得反應復合物； b)所述反應復合物與抗Aβ特定氨基酸序列的兔抗人的A β抗體進行二次抗原一抗體反應，得反應結(jié)合物； c)所述反應結(jié)合物經(jīng)帶有酶底物的兔抗鼠的多克隆抗體進行顯色反應后，由分光光度儀進行定量測定。
2.如權(quán)利要求1所述的人體血清Aβ的定量檢測方法，其特征在于，所述步驟a)中的試劑盒包括盒體、盒蓋和固定板，所述盒體內(nèi)置放有十個試劑瓶和一個免疫檢測板，所述十個試劑瓶和免疫檢測板由試劑板分隔固定，所述每個試劑瓶上附設(shè)有說明標簽，所述每個試劑瓶內(nèi)封閉包裝有試劑。
3.如權(quán)利要求2所述的人體血清Aβ的定量檢測方法，其特征在于，所述試劑盒的盒體和盒蓋由硬紙或塑料板制成，所述試劑板由硬紙或塑料泡沫制成。
4.如權(quán)利要求2所述的人體血清Aβ的定量檢測方法，其特征在于，所述十個試劑瓶中分別裝有:試劑1:人體Αβ淀粉樣肽；試劑II =NaH2PO4H20.Na2HPO4緩沖溶液；試劑III:NaN3.Block Ace.PBS 溶液;試劑IV =NaH2PO4H20.Na2HPO4 溶液;試劑 V:BSA 和 Block Ace粉末；試劑V1:兔抗人的Αβ檢測抗體；試劑Vn:清洗免疫反應的平衡液；試劑珊:鼠抗兔的第二抗體；試劑IX:ΤΜΒ顯色反應溶液；試劑X:peroxidase溶液。
5.如權(quán)利要求4所述的人體血清Aβ的定量檢測方法，其特征在于，所述裝有試劑V、試劑IX和試劑X的試劑瓶為棕色，其他試劑瓶為白色。
6.如權(quán)利要求4所述的·人體血清Αβ的定量檢測方法，其特征在于，所述試劑II中NaH2PO4H20.Na2HPO4 濃度為 20mM，EDTA 濃度為 2mM，NaCl 濃度為 400mM，BSA、CHAPS、BlockAce和NaN3濃度依次為0.2%、0.05%,0.4%和0.05%,溶液pH值為7.0 ;所述試劑III中NaN3和Block Ace重量百分比濃度分別為10%和1%在PBS溶液中，溶液pH值為7.4 ;試劑IV中NaH2PO4H20.Na2HPO4 濃度為 20mM，EDTA 濃度為 2mM，NaCl 濃度為 400mM、BSA 濃度為 1%，溶液pH值為7.0 ;所述試劑VII為NaCl、KCl、Na2HPO4.7Η20和KH2PO4的混合液，pH值為7.4。
7.如權(quán)利要求6所述的人體血清Aβ的定量檢測方法，其特征在于，所述試劑V中BSA和Block Ace兩種粉末分裝在各自的兩個小管內(nèi)，Block Ace粉末使用用前分別溶解在試劑II和III的溶液中，所述BSA粉末使用前分別溶解在試劑II和IV的溶液中；所述試劑VI使用前溶于試劑IV的溶液中，并稀釋至樣本檢測濃度；所述試劑VII的容量為250ml，使用前用雙蒸水稀釋I倍；所述試劑珊在使用用前在試劑IV的溶液中稀釋至樣本檢測濃度。
8.如權(quán)利要求7所述的人體血清Αβ的定量檢測方法，其特征在于，在采用所述試劑盒進行Αβ的定量檢測之前先配置如下溶液: 1)配制工作濃度的樣本和標準品稀釋液:取出冷藏的試劑II，將10倍的25ml試劑II稀釋至250ml ;取出冷藏的試劑V，自然升至室溫，將其中一小管0.5gBSA和一小管Ig的Block Ace溶入稀釋后的試劑II中； 2)配制工作濃度的緩沖基液:取出100ml的IOxPBS加雙蒸水至1L，檢查pH值； 3)配制封閉溶液:從試劑V中取出另一小管Ig的BlockAce粉末溶入試劑II溶到900ml的IxPBS再加100ml的NaN3配制成IX的Block Ace封閉溶液；4)配制工作濃度的抗體稀釋溶液:取出IOX的25ml的試劑IV，加入2475ml雙蒸水配成IX的抗體稀釋溶液，然后再加入另一小管0.5g的BSA粉末溶入到試劑工作濃度的抗體稀釋溶液中。
9.如權(quán)利要求8所述的人體血清Αβ的定量檢測方法，其特征在于，在配置好工作濃度的溶液后，對人體血清Αβ進行定量檢測，包括如下步驟: 1)取出冷藏鋪有Αβ抗體和塑料蓋膜封閉的免疫檢測板，自然升至室溫； 2)準備定量檢測Aβ的標準品:將試劑I的標準品A β溶于含有BSA和BlockAce的樣本和標準品稀釋液中；并將溶解液依次稀釋至標準曲線的梯度濃度； 3)準備待測樣本:將待測血液樣本在控溫和定速離心后取出上清液，進行蛋白定量； 4)用工作濃度的樣本和標準品稀釋液將收集的待測樣本中的蛋白濃度統(tǒng)一稀釋至一致濃度所需量； 5)揭開免疫檢測板的封閉膜，將工作濃度的樣本和標準品稀釋液加入免疫檢測板上的，96孔反應小槽內(nèi)；將々3不同稀釋濃度的標準品依次加入相應的小孔后，再將一致濃度蛋白濃度的待測樣本加入檢測反應小槽內(nèi)； 6)封閉96孔免疫檢測板，將免疫檢測板在定速震蕩儀室溫孵育1-3小時或4度無震蕩，12-36小時； 7)用工作濃度的緩沖基液清洗反應小槽三次； 8)加封閉溶液在定速震蕩儀室溫孵育1-3小時或4度無震蕩12-36小時； 9)取出冷藏的試劑VI， 自然升至室溫；工作濃度的抗體稀釋溶液將其稀釋至IOml； 10)加稀釋的Aβ檢測抗體進反應小槽，在定速震蕩儀室溫孵育1-3小時或4度無震蕩，12-36小時； 11)用工作濃度的緩沖基液清洗反應小槽四次； 12)取出冷藏的試劑珊的鼠抗兔的第二抗體，自然升至室溫；用工作濃度的抗體稀釋溶液將其稀釋； 13)加稀釋的Aβ檢測抗體進反應小槽在定速震蕩儀室溫孵育0.5-1.5小時； 14)用工作濃度的緩沖基液清洗反應小槽三次； 15)取出冷藏的的試劑IX和X，加溫至37度；取試劑IX和試劑X均勻混合；加混合液至每個反應小槽內(nèi)；根據(jù)顯色從淺至深藍色時，加入試劑IX，停止顯色反應；將檢測板置入分光光度計在450nm檢測反應溶液的OD值；根據(jù)OD值和A β的標準曲線確定樣本中A β的含量。
10.如權(quán)利要求9所述的人體血清Αβ的定量檢測方法，其特征在于，所述步驟I)中定量測定標準曲線的梯度濃度為 500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、，15.63pg/ml、7.86pg/ml、0pg/mlo
【文檔編號】G01N21/78GK103852579SQ201210516697
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月5日
【發(fā)明者】姚鈞 申請人:姚鈞