專利名稱：具有經(jīng)修飾的erns 蛋白的牛病毒性腹瀉病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的嵌合瘟病毒及其在免疫原性組合物和疫苗中的用途。本發(fā)明還涉及用于治療或預(yù)防牛病毒性腹瀉病毒感染的傳播的方法和試劑盒。本發(fā)明還涉及嵌合瘟病毒在用于區(qū)分經(jīng)接種的動物和經(jīng)野生型病毒感染的動物的方法和試劑盒中的用途。
背景技術(shù)：
已經(jīng)從飼養(yǎng)的和野生的數(shù)種動物物種中分離了瘟病毒，包括牛病毒性腹瀉病毒 (BVD病毒或BVDV)。鑒定的BVDV的宿主包括水牛、羚羊、馴鹿和多種鹿的物種，并且在長頸鹿和叉角羚中已經(jīng)鑒定了獨(dú)特的瘟病毒的種。BVDV是黃病毒科的小RNA病毒。其與其它的瘟病毒(其是綿羊中的邊界病和豬中的豬瘟(classical swine fever)的誘因劑)密切相關(guān)。最近，鑒定出一種被稱作Bimgowarmah瘟病毒的不同的瘟病毒，其是澳大利亞豬崽胎兒感染的致病劑。由BVDV引起的疾病、尤其是牛中的疾病十分廣泛，可以帶來經(jīng)濟(jì)上的破壞。牛中的BVDV感染可以引起育種上的問題，并且可以導(dǎo)致流產(chǎn)或早產(chǎn)。BVDV能夠穿過孕牛的胎盤，并且可以持續(xù)感染(PI)小牛，使之對該病毒免疫耐受并且此后終其一生持續(xù)病毒血癥。被感染的牛還可可表現(xiàn)出“粘膜病”，該病的特征在于體溫升高、腹瀉、咳嗽和消化系統(tǒng)粘膜的潰瘍。這些持續(xù)感染的動物在牧群中提供了導(dǎo)致進(jìn)一步爆發(fā)粘膜病的病毒的傳播源，并且極易感染引起腸病或肺炎的微生物。BVDV被分成兩種生物型?！癱p"生物型的BVDV在培養(yǎng)的細(xì)胞中誘導(dǎo)引起細(xì)胞病變的效應(yīng)，而非細(xì)胞病變性或"ncp"生物型的病毒則不誘導(dǎo)此效應(yīng)。此外，識別了兩種主要的基因型(1型和2型)，已經(jīng)證明二者都引起多種臨床上的癥狀。BVDV病毒粒子的直徑為40-60nm。BVDV的核衣殼由單個RNA分子和衣殼蛋白 C組成。核衣殼由脂膜包圍，脂膜上錨定有兩種糖蛋白El和E2。第3種糖蛋白Ems與被膜松散地結(jié)合。BVDV基因組的長度是大約12.51Λ，其包含位于5'和3'非翻譯區(qū) (NTR)之間的單個開放閱讀框。從該開放閱讀框翻譯出大約438kD的多聚蛋白，并且該多聚蛋白由細(xì)胞和病毒蛋白酶加工成至少11個病毒結(jié)構(gòu)性和非結(jié)構(gòu)性(NS)蛋白(Tautz， et al.，J. Virol.71 :5415-5422(1997) ；Xu, et al.，J. Virol.71 :5312-5322(1997)； Elbers, et al.，J. Virol. 70 :4131-4135(1996)；和 Wiskerchen，et al.，Virology 184 ；341-；350(1991))。BVDV 的基因組順序是 p20/Npr。、pl4/C、gp48/Erns、gp25/El、gp53/E2、p54/ NS2、p80/NS3、pl0/NS4A、p32/NS4B、p58/NS5A 和 p75/NS5B。三種被膜蛋白 gp48/Erns、gp25/ El和gp53/E2是高度糖基化的。Ems(以前被稱作EO或gp48)形成通過二硫鍵共價連接的同二聚體。疏水性膜錨定區(qū)的缺失說明Ems與被膜松散地結(jié)合。Ems在感染的牛中誘導(dǎo)高抗體滴度，但是抗血清具有有限的病毒中和活性。目前可獲得的BVDV疫苗有包含化學(xué)滅活的野生型病毒的疫苗。這些疫苗通常需要多劑給藥，并且產(chǎn)生短期的免疫應(yīng)答；另外，它們不提供針對病毒的胎兒傳播的保護(hù)。在綿羊中，已經(jīng)報道了基于純化的E2蛋白的亞單位疫苗。雖然該疫苗似乎保護(hù)胎兒免受感染，但是保護(hù)僅限于病毒的同源株，并且抗體滴度與保護(hù)之間沒有關(guān)聯(lián)。已經(jīng)使用通過在牛或豬細(xì)胞中重復(fù)傳代或者通過化學(xué)誘導(dǎo)賦予病毒溫度敏感性表型的突變而減毒的病毒生產(chǎn)出了改良式活(ML) BVDV疫苗。已經(jīng)證明單劑MLV BVDV疫苗足以提供抗感染的保護(hù)，并且接種的牛中的免疫力的持續(xù)時間可以延伸數(shù)年。此外，已經(jīng)報道了使用MLV疫苗的交叉保護(hù)(Martin等人，見“Proceedings of the Conference of Research Workers in Animal Diseases”，75 :183 (1994))。然而，現(xiàn)有的 MLV 疫苗不能區(qū)分經(jīng)接種的和天然感染的動物。因此，顯然需要用于控制BVDV傳播的新的疫苗。此類疫苗在將來的國家性或區(qū)域性BVDV清除工程中將是無價的，并且還可以與其它的牛疫苗組合，其代表了工業(yè)上的實(shí)質(zhì)性進(jìn)步。用于控制和監(jiān)視BVDV傳播的更加有效的疫苗是“標(biāo)記的”疫苗。此類疫苗可以包含不存在于野生型病毒中的另外的抗原決定簇，或者缺少存在于野生型病毒中的抗原決定簇。就前者而言，經(jīng)接種的動物產(chǎn)生針對“標(biāo)志物”免疫原性決定簇的免疫應(yīng)答，而未經(jīng)接種的動物則不產(chǎn)生。通過使用針對該標(biāo)志物決定簇的免疫學(xué)檢驗(yàn)，可以通過是否存在針對該標(biāo)志物決定簇的抗體來區(qū)分經(jīng)接種的動物和未經(jīng)接種的天然感染的動物。在后一個策略的情況下，由于決定簇不存在于標(biāo)記的疫苗中，所以，感染野生型病毒的動物產(chǎn)生針對標(biāo)志物決定簇的免疫應(yīng)答，而未感染的經(jīng)疫苗接種的動物則不產(chǎn)生。通過使用針對標(biāo)志物決定簇的免疫學(xué)檢驗(yàn)，可以將感染的動物與經(jīng)接種的未感染的動物區(qū)分開。在兩種情況下，通過剔除被感染的動物，牧群可以隨著時間變成無BVDV的牧群。除了去除BVDV疾病的威脅這個益處之外，牧群無BVDV的證明具有直接的自由貿(mào)易的經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了嵌合瘟病毒，其中所述嵌合瘟病毒包含不表達(dá)其同源Ems蛋白的牛病毒性腹瀉病毒，并且其中所述嵌合瘟病毒表達(dá)源自另一種瘟病毒的異源Ems蛋白，或所述異源Ems蛋白的天然、合成的或遺傳變體。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上所述的嵌合瘟病毒，其中所述嵌合瘟病毒的異源Ems蛋白或所述異源Ems蛋白的天然、合成的或遺傳變體源自選自馴鹿瘟病毒、長頸鹿瘟病毒和叉角羚瘟病毒的瘟病毒。在不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上所述的嵌合瘟病毒，其中所述嵌合瘟病毒的異源Ems蛋白具有至少一種不存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中的Ems表位。在單獨(dú)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上所述的嵌合瘟病毒，其中所述嵌合瘟病毒的異源Ems蛋白缺失至少一種存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中的Ems表位。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上所述的嵌合瘟病毒的培養(yǎng)物。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含如上所述的嵌合瘟病毒的細(xì)胞系或宿主細(xì)胞。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼如上所述的嵌合瘟病毒的多核苷酸分子。在不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含如上所述的嵌合瘟病毒和獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體的免疫原性組合物。在單獨(dú)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上所述的免疫原性組合物，其中所述獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體是佐劑。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上所述的免疫原性組合物，其中所述嵌合瘟病毒是活的減毒的。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上所述的免疫原性組合物，其中所述嵌合瘟病毒是滅活的。在不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上所述的免疫原性組合物，其進(jìn)一步包含用于治療或預(yù)防動物中的一種或多種另外的致病微生物傳播的一種或多種另外的抗原。在單獨(dú)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含編碼如上所述的嵌合瘟病毒的多核苷酸分子和獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體的免疫原性組合物。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含如上所述的嵌合瘟病毒和獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體的疫苗。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上所述的疫苗，其中所述獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體是佐劑。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上所述的疫苗，其中所述嵌合瘟病毒是活的減毒的。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上所述的疫苗，其中所述嵌合瘟病毒是滅活的。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上所述的疫苗，其進(jìn)一步包含用于治療或預(yù)防動物中的一種或多種另外的致病微生物的傳播的一種或多種另外的抗原。在單獨(dú)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含編碼如上所述的嵌合瘟病毒的多核苷酸分子和獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體的疫苗。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含，在至少一個容器中，含有如上所述的嵌合瘟病毒的疫苗。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防牛病毒性腹瀉病毒感染的傳播的方法，其中向動物施用包含如上所述的嵌合瘟病毒的疫苗。在不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了接種動物的方法，其中向所述動物施用DIVA 瘟病毒疫苗，其中所述DIVA瘟病毒疫苗包含如上所述的嵌合瘟病毒，并且其中所述嵌合瘟病毒具有至少一種不存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中的Ems表位。在單獨(dú)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了接種動物的方法，其中向所述動物施用DIVA 瘟病毒疫苗，其中所述DIVA疫苗包含如上所述的嵌合瘟病毒，并且其中所述嵌合瘟病毒缺失至少一種存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中的Ems表位。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了區(qū)分接種了包含如上所述的嵌合瘟病毒的疫苗的動物與感染了野生型牛病毒性腹瀉病毒的動物的方法，其中接種所述疫苗的動物產(chǎn)生抗體，所述抗體抗至少一種存在于所述疫苗的嵌合瘟病毒中但不存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中的Ems表位，所述方法包括以下步驟a)從動物獲取血清樣品；b)就所述抗體的存在或不存在測定所述樣品；c)將具有所述抗體的動物鑒定為已經(jīng)過所述疫苗接種；和d)將不含所述抗體的動物鑒定為已被野生型BVDV感染。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了區(qū)分感染了野生型牛病毒性腹瀉病毒的動物和接種了包含如上所述的嵌合瘟病毒的疫苗的動物的方法，其中感染了野生型牛病毒性腹瀉病毒的動物產(chǎn)生抗體，所述抗體抗至少一種存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中但不存在于所述疫苗的嵌合瘟病毒中的Ems表位，所述方法包括以下步驟a)從動物獲取血清樣品；b)就所述抗體的存在或不存在測定所述樣品；c)將具有所述抗體的動物鑒定為已被野生型BVDV感染；和d)將不含所述抗體的動物鑒定為已經(jīng)過所述疫苗接種。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于區(qū)分接種了包含如上所述的嵌合瘟病毒的疫苗的動物與感染了野生型牛病毒性腹瀉病毒的動物的診斷試劑盒，所述試劑盒包含能夠檢測針對至少一種存在于所述疫苗的嵌合瘟病毒中但不存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中的Ems表位的抗體的試劑。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于區(qū)分感染了野生型牛病毒性腹瀉病毒的動物和接種了包含如上所述的嵌合瘟病毒的疫苗的動物的診斷試劑盒，所述試劑盒包含能夠檢測針對至少一種存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中但不存在于所述疫苗的嵌合瘟病毒中的Ems表位的抗體的試劑。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了識別存在于如上所述的嵌合瘟病毒中但不存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中的Ems表位的抗體。在不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了識別存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中但不存在于如上所述的嵌合瘟病毒中的表位的抗體。在另一個實(shí)施方案中，如本文描述的嵌合瘟病毒用于制備用于預(yù)防或治療BVDV 引起的感染的藥物。發(fā)明詳述以下定義適用于本發(fā)明的實(shí)施方案的描述中所用的術(shù)語。以下定義取代通過引用方式并入本文的每篇單獨(dú)的參考文獻(xiàn)中包含的任何矛盾的定義。除非本文另有指明，否則本發(fā)明中使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語將具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有需要，否則單數(shù)的術(shù)語應(yīng)該包括復(fù)數(shù)，并且復(fù)數(shù)的術(shù)語應(yīng)該包括單數(shù)。本文使用的術(shù)語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以類似于天然存在的氨基酸的方式發(fā)揮功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及后來經(jīng)過修飾的那些氨基酸，例如，羥基脯氨酸、羧基谷氨酸和 0-磷酸絲氨酸。20種常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸例如α 和α-雙取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常規(guī)氨基酸也可以是本發(fā)明的多肽的合適的成分。非常規(guī)氨基酸的實(shí)例包括4-羥基脯氨酸、Y -羧基谷氨酸、ε -N, N, N-三甲基賴氨酸、ε -N-乙酰賴氨酸、0-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、O-N-甲基精氨酸和其它類似的氨基酸和亞氨基酸。氨基酸類似物是指與天然存在的氨基酸具有相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即， 具有與氫、羧基、氨基和R基團(tuán)結(jié)合的碳原子。示例性的氨基酸類似物包括例如，高絲氨酸、 正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜和甲硫氨酸甲基锍。此類類似物具有修飾的R基團(tuán)(例如正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但是保留與天然存在的氨基酸基本上相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指具有不同于氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)、但是以類似于天然存在的氨基酸的方式發(fā)揮作用的化合物。本文中可以通過公知的三字符或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會推薦的單字符來指稱氨基酸。本文使用的術(shù)語“動物”意在包括易于感染BVDV的任意動物，包括但不限于下列物種牛、綿羊、山羊和豬，包括飼養(yǎng)的和野生的。本文使用的術(shù)語“抗體”是指能夠通過識別表位的方式結(jié)合抗原的免疫球蛋白分子。抗體可以是多克隆混合物或單克隆的?？贵w可以是來自天然來源的或來自重組來源的完整免疫球蛋白，或者可以是完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)性部分?？贵w可以以多種形式存在，包括例如，F(xiàn)v、Fab'、F(ab' )2以及單鏈形式。本文使用的術(shù)語“抗原”是指包含一個或多個表位(線性的、構(gòu)象型的或二者)的分子，當(dāng)暴露于受試者后，其將誘導(dǎo)特異于該抗原的免疫應(yīng)答。術(shù)語“抗原”可以指減毒的、 滅活的或改良的活的細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲或其它微生物。本文使用的術(shù)語“抗原”還可以指亞單位抗原，其與抗原在天然狀態(tài)下結(jié)合的完整生物體分開且分離。術(shù)語“抗原”還可以指抗體，例如抗獨(dú)特型抗體或其片段，以及可以模擬抗原或抗原決定簇(表位)的合成的肽模擬位。術(shù)語“抗原”還可以指在體內(nèi)表達(dá)抗原或抗原決定簇的寡核苷酸或多核苷酸，例如用于DNA免疫應(yīng)用。本文使用的術(shù)語“BVDV”、"BVDV分離株”或“BVDV株”是指牛病毒性腹瀉病毒，包括但不限于I型和II型，其由病毒基因組、相關(guān)蛋白和其它化學(xué)成分(例如脂質(zhì))組成。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種I型和I I型牛病毒性腹瀉病毒，并且它們可以從例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC )獲得。牛病毒性腹瀉病毒具有RNA形式的基因組。RNA可以被逆轉(zhuǎn)錄成DNA以用于克隆。因此，本文中提及核酸和牛病毒性腹瀉病毒序列時，其包括病毒RNA 序列和源自病毒RNA序列的DNA序列。本文使用的術(shù)語“細(xì)胞系”或“宿主細(xì)胞”意思是其中可以復(fù)制和/或維持病毒的原核或真核細(xì)胞。本文使用的術(shù)語“嵌合的”或“嵌合體”意思是包含源自一種以上的祖先的遺傳或物理成分的微生物，例如病毒。本文使用的術(shù)語“培養(yǎng)物”意思是在不存在其它物種或類型的情況下生長的細(xì)胞或微生物的群體。本文使用的術(shù)語“DIVA”意思是能夠區(qū)分感染的與接種的動物的疫苗?！氨砦弧笔桥cT細(xì)胞受體或特異性抗體結(jié)合的抗原的特定位點(diǎn)，通常包含大約3個氨基酸殘基至大約20個氨基酸殘基。本文使用的術(shù)語“異源的”意思是源自不同的物種或株。本文使用的術(shù)語“同源的”意思是源自相同的物種或株。本文使用的術(shù)語“免疫原性組合物”意思是，當(dāng)單獨(dú)或與藥學(xué)上可接受的載體一起向動物施用時，產(chǎn)生免疫應(yīng)答(即具有免疫原性活性)的組合物。所述免疫應(yīng)答可以是主要由細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，或主要由輔助T細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答，其繼而激活B細(xì)胞，引起抗體的產(chǎn)生。
本文使用的術(shù)語“病原體”或“致病微生物”意思是能夠在其宿主動物中誘導(dǎo)或引起疾病、生病或異常狀態(tài)的微生物，例如病毒、細(xì)菌、真菌、原生動物或寄生蟲。本文使用的術(shù)語“瘟病毒”意思是來自黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬 (Pestiviru)的RNA病毒。瘟病毒包括但不限于BVDV (1型和2型)、豬瘟病毒(CSFV)和邊界病病毒(BDV)，以及從例如以下物種中分離的瘟病毒野豬、水牛、大羚羊(eland)、野牛、羊駝、pudu、邦戈羚羊(bongo)、各種鹿、長頸鹿、馴鹿、巖羚羊和叉角羚(Vilcek和Nettleton ； Vet Microbiol. 116 :1-12(2006))。本文使用的術(shù)語“多核苷酸分子”意思是由共價鍵合成鏈的核苷酸單體組成的有機(jī)聚合物分子。DNA(脫氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是具有獨(dú)特的生物學(xué)功能的多核苷酸的實(shí)例。本文使用的術(shù)語“預(yù)防(prevent)”、“預(yù)防(preventing) ”或“預(yù)防(prevention)，， 等意思是抑制微生物的復(fù)制、抑制微生物的傳播或抑制微生物在其宿主中進(jìn)行自我建立。 本文使用的這些術(shù)語等還可以意指抑制或阻斷一種或多種感染跡象或癥狀。本文使用的術(shù)語“治療有效量”意思是足以在施用了其的受試者中引發(fā)免疫應(yīng)答的微生物或亞單位抗原或多肽或多核苷酸分子或其組合的量。免疫應(yīng)答可以包括但不限于細(xì)胞和/或體液免疫的誘導(dǎo)。本文使用的術(shù)語“治療(treat) ”、“治療(treating) ”或“治療(treatment) ”等意思是減少或消除微生物的感染。本文使用的這些術(shù)語等還可以意指減少微生物的復(fù)制，減少微生物的傳播，或降低微生物在其宿主中自我建立的能力。本文使用的這些術(shù)語等還可以意指減少、緩解或消除一種或多種微生物感染跡象或癥狀，或加速從微生物感染的復(fù)原。本文使用的術(shù)語“疫苗”和“疫苗組合物”意思是預(yù)防或減少感染，或預(yù)防或減少感染的一種或多種跡象或癥狀的組合物。疫苗組合物抗病原體的保護(hù)性效應(yīng)通常是通過誘導(dǎo)受試者中的免疫應(yīng)答(其可以是細(xì)胞介導(dǎo)的或體液免疫應(yīng)答或二者的組合)來實(shí)現(xiàn)的。 一般而言，感染發(fā)生率的消除或降低、跡象或癥狀的緩解或微生物從感染的受試者的加速清除是疫苗組合物的保護(hù)性效應(yīng)的指征。本發(fā)明的疫苗組合物提供了抗BVDV引起的感染的保護(hù)性效應(yīng)。本文使用的術(shù)語“變體”是指給定的蛋白和/或基因序列的衍生物，其中衍生的序列與給定的序列是基本上相同的，但是具有突變的差異。所述差異可以是天然發(fā)生的，或通過合成或遺傳產(chǎn)生的。本文使用的術(shù)語“獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體”是指這樣的物質(zhì)，其在合理的醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)，適合用于與動物的組織接觸而無過度毒性、刺激性、變應(yīng)性應(yīng)答等，具有合理的收益/風(fēng)險比，對于其預(yù)期的用途是有效的。提供了以下描述以輔助本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。即使如此，該描述不應(yīng)被解釋為過度限制本發(fā)明，因?yàn)楸绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員可以不脫離本發(fā)明的精神或范圍而對本文討論的實(shí)施方案作出修改和改變。病毒、免疫原性組合物和疫苗本發(fā)明提供了包含一種或多種嵌合瘟病毒的免疫原性組合物和疫苗，其中所述嵌合瘟病毒包含不表達(dá)其同源Ems蛋白的牛病毒性腹瀉病毒，并且其中所述嵌合瘟病毒表達(dá)源自另一種瘟病毒的異源Ems蛋白，或所述異源Ems蛋白的天然、合成的或遺傳變體。所述嵌合瘟病毒可以選自但不限于BVDV/馴鹿瘟病毒、BVDV/長頸鹿瘟病毒和BVDV/叉角羚瘟病毒的瘟病毒嵌合體。在一個實(shí)施方案中，BVDV/長頸鹿嵌合瘟病毒是保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC ) (10801 University Boulevard, Manassas, VA20110-2209, USA)的 UC 25547 株，其ATCC 保藏號為PTA-9938。在一個實(shí)施方案中，BVDV/叉角羚嵌合瘟病毒是保藏于 ATCC 的UC 25548株，其ATCC 保藏號為PTA-9939。在一個實(shí)施方案中，BVDV/馴鹿嵌合瘟病毒是保藏于ATCC 的UC 25549株，其ATCC 保藏號為PTA-9940。本發(fā)明的嵌合瘟病毒可以在細(xì)胞、細(xì)胞系和宿主細(xì)胞中繁殖。所述細(xì)胞、細(xì)胞系和宿主細(xì)胞可以是例如但不限于哺乳動物細(xì)胞和非哺乳動物細(xì)胞，包括昆蟲和植物細(xì)胞?？捎糜诜敝潮景l(fā)明的嵌合瘟病毒的細(xì)胞、細(xì)胞系和宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易獲知和獲得的。本發(fā)明的嵌合瘟病毒可以在用于免疫原性組合物或疫苗中之前進(jìn)行減毒或滅活。 減毒和滅活的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。用于減毒的方法包括但不限于，在合適的細(xì)胞系中在細(xì)胞培養(yǎng)物中連續(xù)傳代、紫外線輻射和化學(xué)誘變。用于滅活的方法包括但不限于， 用福爾馬林、β丙內(nèi)酯(BPL)或二乙烯亞胺(BEI)處理，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法。使用福爾馬林的滅活可以這樣進(jìn)行將病毒懸浮液與37%的甲醛混合以達(dá)到 0.05%的最終甲醛濃度。通過恒定攪拌將病毒-甲醛混合物在室溫混合大約M小時。然后，通過在合適的細(xì)胞系上測定生長來檢測滅活的病毒混合物中的殘余活病毒。使用BEI的滅活可以這樣進(jìn)行將本發(fā)明的病毒懸浮液與0. IM BEI (在0. 175Ν NaOH中的2-溴-乙胺)混合以達(dá)到ImM的最終BEI濃度。通過恒定攪拌將病毒-BEI混合物在室溫混合大約48小時，然后加入1. OM硫代硫酸鈉至0. ImM的終濃度。再混合2個小時。通過在合適的細(xì)胞系上測定生長來檢測滅活的病毒混合物中的殘余活病毒。本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗可以包括一種或多種獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體。本文使用的“獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體”包括任意和所有溶劑、分散介質(zhì)、包被物、佐劑、穩(wěn)定劑、 稀釋劑、防腐劑、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲劑、吸收延遲劑等等。稀釋劑可以包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等滲劑可以包括，尤其是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖等。穩(wěn)定劑包括，尤其是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的白蛋白等。防腐劑包括， 尤其是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的硫柳汞等。佐劑包括但不限于，尤其是如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，RIBI佐劑系統(tǒng)(Ribi he.)、明礬、氫氧化鋁凝膠、水包油乳液、油包水乳液例如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta Ga·)、SAF-M(Chiron, Emeryville Calif·)、 AMPHIGEN 佐劑、皂甙、Quil A、QS-21 (Cambridge Biotech Inc. , Cambridge Mass·)、 GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc.，Birmingham, AL)或其它的皂甙級份，單磷酰脂質(zhì)Α、阿夫立定脂質(zhì)-胺佐劑、來自大腸桿菌的熱不穩(wěn)定性腸毒素(重組的或其它的)、霍亂毒素或胞壁酰二肽等。用于本發(fā)明的情形中的佐劑和添加劑的量和濃度可以由技術(shù)人員容易地確定。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含大約50 μ g至大約2000 μ g佐劑的免疫原性組合物和疫苗。在另一個實(shí)施方案中，包括的佐劑的量是大約100μ g至大約1500μ g， 或大約250 μ g至大約1000 μ g，或大約350 μ g至大約750 μ go在另一個實(shí)施方案中，包括的佐劑的量是大約500μ g/2ml劑量的免疫原性組合物或疫苗。免疫原性組合物和疫苗還可以包含抗生素。此類抗生素包括但不限于下列類別的抗生素氨基葡萄糖苷、碳青霉烯類、頭孢菌素、糖肽類、大環(huán)內(nèi)酯類、青霉素、多肽、喹諾酮類、磺胺類和四環(huán)素。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含大約lyg/ml至大約60yg/ml 抗生素的免疫原性組合物和疫苗。在另一個實(shí)施方案中，免疫原性組合物和疫苗包含大約 5 μ g/ml至大約55 μ g/ml抗生素，或大約10 μ g/ml至大約50 μ g/ml抗生素，或大約15 μ g/ ml至大約45 μ g/ml抗生素，或大約20 μ g/ml至大約40 μ g/ml抗生素，或大約25 μ g/ml至大約35 μ g/ml抗生素。在另一個實(shí)施方案中，免疫原性組合物和疫苗包含少于大約30 μ g/ ml的抗生素。本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗還可以包含一種或多種其它的免疫刺激劑，例如，白介素、干擾素或其它細(xì)胞因子，其適宜的量可以由技術(shù)人員確定。本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗可以包含編碼嵌合瘟病毒的一種或多種多核苷酸分子。免疫原性組合物或疫苗中可以使用編碼嵌合瘟病毒的全部基因組或一個或多個開放閱讀框的DNA或RNA分子?？梢栽诓淮嬖谄渌噭┑那闆r下施用所述DNA或RNA分子， 或者，可以與促進(jìn)細(xì)胞攝取的試劑(例如脂質(zhì)體或陽離子脂質(zhì))一起施用DNA或RNA分子。 免疫原性組合物或疫苗中的總的多核苷酸一般是大約0. 1 μ g/ml至大約5. Omg/ml。在另一個實(shí)施方案中，免疫原性組合物或疫苗中的總的多核苷酸是大約1 μ g/ml至大約4. Omg/ ml，或大約10 μ g/ml至大約3. Omg/ml，或大約100 μ g/ml至大約2. Omg/ml。使用核酸(DNA 或mRNA)的疫苗和接種程序在本領(lǐng)域已有廣泛描述，例如美國專利5，703，055、美國專利 5，580，859、美國專利5，589，466，這些文獻(xiàn)全部通過引用方式并入本文。本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗還可以包含另外的BVDV抗原，例如在美國專利 6，060，457、美國專利6，015，795、美國專利6，001，613和美國專利5，593，873中描述的那些，這些文獻(xiàn)全部通過引用方式并入本文。除了一種或多種嵌合瘟病毒以外，免疫原性組合物和疫苗還可以包含其它抗原。 抗原可以是微生物的滅活的完整或部分制備物的形式，或者可以是通過基因工程技術(shù)或化學(xué)合成獲得的抗原性分子的形式。適合用于本發(fā)明的其它抗原包括但不限于，源自下列致病細(xì)菌的抗原，例如睡眠嗜血桿菌(Haemophilus somnus)、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)、支氣管敗血性博代氏桿菌(Bordetella bronchis印tica)、炭疽芽胞桿菌 (Bacillus anthracis)、胸膜月市炎放線桿菌(Actinobacillus ρ 1 europneumonie)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、曼氏溶血桿菌(Mannhemia haemolytica)、 牛支原體(Mycoplasma bovis)、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)、畐Ij結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium paratuberculosis)、 菌屬(Clostridial spp.)、季L 房 1連 求菌 (Streptococcus uberis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、豬紅斑丹毒絲菌 (Erysipelothrix rhusopa thiae)、^原體屬(Chlamydia spp.)、布魯氏菌屬(Brucella spp·)、弧菌屬(Vibrio spp.)、傷寒腸道沙門氏菌(Salmonella enterica serovars)禾口細(xì)螺旋體屬(Leptospira spp)。抗原還可以源自致病真菌例如念珠菌屬(Candida)，原生動物例如小球隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)、犬新孢子蟲(Neospora canium)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)、艾美耳球蟲屬(Eimeria spp·)、巴貝西蟲屬(Babesia spp·)、 賈第鞭毛蟲屬(Giardia spp.)，或寄生蟲例如奧斯特線蟲屬(Ostertagia)、古柏線蟲屬
11(Cooperia)、血矛線蟲屬(Haemonchus)和片形吸蟲屬(Fasciola)。另外的抗原包括致病性病毒，例如，牛冠狀病毒、牛皰疹病毒_1，3，6、牛副流感病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛白血性增生病毒、牛瘟病毒、口蹄疫病毒、狂犬病病毒和流感病毒。給藥的形式、劑量、涂徑可以向動物施用本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗以誘導(dǎo)有效的針對BVDV的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明提供了通過向動物施用治療有效量的本文描述的本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗來刺激針對BVDV的有效的免疫應(yīng)答的方法。取決于給藥途徑，本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗可以制成多種形式。例如，免疫原性組合物和疫苗可以制成適合于注射用途的無菌水溶液或分散液的形式，或者使用冷凍-干燥技術(shù)制成凍干形式。凍干的免疫原性組合物和疫苗通常維持在大約4°C，可以在穩(wěn)定化溶液例如鹽水或和HEPES(含有或不含佐劑)中重構(gòu)。免疫原性組合物和疫苗還可以制成懸浮液或乳液的形式。本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗包含治療有效量的一種或多種如上所述的嵌合瘟病毒。純化的病毒可直接用于免疫原性組合物或疫苗，或者可以進(jìn)一步進(jìn)行減毒或滅活。 免疫原性組合物或疫苗通常包含大約1XIO2至大約1 X IO12個病毒顆粒，或大約1 X IO3至大約1 X IO11個病毒顆粒，或大約1 X IO4至大約1 X 101°個病毒顆粒，或大約1 X IO5至大約 1 X IO9個病毒顆粒，或大約1 X IO6至大約1 X IO8個病毒顆粒。免疫原性組合物或疫苗中的有效提供保護(hù)性效應(yīng)的病毒的精確量可由技術(shù)人員測定。免疫原性組合物和疫苗一般包含體積是大約0. 5ml至大約5ml的獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體。在另一個實(shí)施方案中，載體的體積是大約Iml至大約^il，或大約2ml至大約:3ml。 在另一個實(shí)施方案中，載體的體積是大約Iml或大約anl，或大約5ml。適合用于免疫原性組合物和疫苗的獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體可以是任意的上文描述的那些。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定病毒是否需要在施用之前進(jìn)行減毒或滅活。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，可以將嵌合瘟病毒直接施用至動物，不進(jìn)行另外的減毒。病毒的治療上有效的量可以根據(jù)所用的特定病毒、動物的狀況和/或感染的程度而變化，并且可以由技術(shù)人員確定。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以向動物施用單一劑量，或者可替代地，可以按照大約2至大約10周的間隔進(jìn)行2次或更多次接種?？赡苄枰訌?qiáng)免疫方案，并且可以調(diào)整劑量方案以提供最佳免疫。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定最佳的給藥方案。免疫原性組合物和疫苗可以直接施用進(jìn)入血流、進(jìn)入肌肉或者進(jìn)入內(nèi)部器官。用于腸胃外給藥的合適方式包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、尿道內(nèi)、胸骨內(nèi)、顱內(nèi)、肌內(nèi)和皮下。用于腸胃外給藥的合適裝置包括針(包括微針)注射器、無針注射器和輸注技術(shù)。腸胃外制劑通常是水溶液，其可以含有賦形劑，例如鹽、碳水化合物和緩沖劑(優(yōu)選達(dá)到以下PH 大約3至大約9，或大約4至大約8，或大約5至大約7. 5，或大約6至大約 7. 5，或大約7至大約7. 5)，但是，對于一些應(yīng)用，可以更適宜地將其配制成無菌的非水性溶液，或配制為干燥形式，以與合適的介質(zhì)例如無菌的無熱原的水一起使用?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)藥物技術(shù)容易地進(jìn)行無菌條件下的腸胃外制劑的制備(例如通過凍干法進(jìn)行)。
可以通過使用技術(shù)人員已知的合適的配制技術(shù)來增加用于制備腸胃外溶液的化合物的溶解性，例如摻入增強(qiáng)溶解性的試劑，例如緩沖劑、鹽、表面活性劑、脂質(zhì)體、環(huán)式糊用于腸胃外給藥的制劑可以配制為即釋和/或改釋。改釋制劑包括延釋、緩釋、脈沖釋、控釋、靶向釋放和程序化釋放。因此，本發(fā)明的化合物可以配制為固體、半固體或觸變式液體，以作為植入庫來施用，其提供活性化合物的改釋。此類制劑的實(shí)例包括藥物包被的支架和聚(dl乳酸-乙醇酸)共聚物(PGLA)微球體。還可以將本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗局部施用至皮膚或粘膜，S卩，經(jīng)皮或透皮施用。用于此目的的典型制劑包括凝膠、水凝膠、洗液、溶液、霜、膏、撲粉劑、敷料、泡沫、 膜、皮膚貼、糯米紙劑、植入物、海綿、纖維、繃帶和微乳劑。還可以使用脂質(zhì)體。典型的載體包括醇、水、礦物油、液體凡士林、白凡士林、甘油、聚乙二醇和丙二醇?？梢該饺霛B透增強(qiáng)劑。參見，例如 Finnin 和 Morgan，J. Pharm Sci,88(10) :955-958 (1999)。其它的局部施用方式包括通過電穿孔法、電離子透入法、音頻透入法、超聲透入法以及微針或無針(例如Powder ject 、Bio ject 等)注射進(jìn)行的遞送。用于局部給藥的制劑可以配制為即釋和/或改釋。改釋制劑包括延釋、緩釋、脈沖釋、控釋、靶向釋放和程序化釋放。還可以通過鼻內(nèi)或通過吸入來施用免疫原性組合物和疫苗，其通常是來自干粉吸入器的干粉形式(單獨(dú)的或作為混合物，例如，與乳糖干燥混合，或作為混合成分顆粒，例如與磷脂例如磷脂酰膽堿混合)，或作為來自加壓容器、泵、噴霧器、霧化器(優(yōu)選使用電流體動力學(xué)來提供精細(xì)薄霧的霧化器)或噴灑器的氣霧劑噴霧，可以使用或不使用合適的助推劑，例如1，1，1，2-四氟乙烷或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷。對于鼻內(nèi)施用，粉末可以包含生物粘附性試劑，例如殼聚糖或環(huán)式糊精。加壓容器、泵、噴霧器、霧化器或噴灑器含有本發(fā)明的化合物的溶液或懸浮液，其包含例如乙醇、含水乙醇或用于分散、溶解或延緩活性物釋放的合適的替代性試劑、助推劑作為溶劑和任選的表面活性劑，例如山梨糖醇酐三油酸酯、油酸或寡聚乳酸。在用于干粉或懸浮液制劑之前，一般將藥物產(chǎn)品微粉化至適于通過吸入方式遞送的大小(通常小于大約5微米)。這可以通過任意合適的粉碎方法來實(shí)現(xiàn)，例如，螺旋噴射研磨、流床噴射研磨、超臨界流體加工以形成納米顆粒、高壓勻化或噴霧干燥。用于吸入器或吹入器的膠囊(例如從明膠或羥丙甲基纖維素制備)、罩板包裝和藥筒可以配制為包含本發(fā)明的化合物、合適的粉末基質(zhì)例如乳糖或淀粉和性能修飾劑例如 1-亮氨酸、甘露醇或硬脂酸鎂的粉末混合物。乳糖可以是無水或一水合物的形式。其它合適的賦形劑包括葡聚糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨醇、木糖醇、果糖、蔗糖和海藻糖。用于霧化器(其使用電流體動力學(xué)來產(chǎn)生精細(xì)的薄霧)的合適的溶液制劑可以包含大約ι μ g至大約20mg本發(fā)明的化合物/啟動，啟動體積可以是大約1 μ 1至大約 100 μ 1。在另一個實(shí)施方案中，每次啟動的化合物的量可以是大約IOOyg至大約15mg，或大約500 μ g至大約10mg，或大約Img至大約10mg，或大約2. 5 μ g至大約5mg。在另一個實(shí)施方案中，啟動體積可以是大約5 μ 1至大約75 μ 1，或大約10 μ 1至大約50 μ 1，或大約 15 μ 1至大約25 μ 1。典型的制劑可以包含本發(fā)明的化合物、丙二醇、無菌水、乙醇和氯化鈉?？捎糜谔娲嫉膫溥x溶劑包括甘油和聚乙二醇。
用于吸入/鼻內(nèi)給藥的制劑可以配制為即釋和/或改釋，使用例如PGLA。改釋制劑包括延釋、緩釋、脈沖釋、控釋、靶向釋放和程序化釋放。在干粉吸入器和氣霧劑的情況下，一般通過遞送計(jì)量數(shù)量的閥門來確定劑量單元。根據(jù)本發(fā)明的單元通常安排為施用計(jì)量劑量或“puff”，其包含大約IOng至大約100 μ g 的本發(fā)明的化合物。在另一個實(shí)施方案中，以計(jì)量劑量施用的化合物的量是大約50ng至大約75 μ g，或大約IOOng至大約50 μ g，或大約500ng至大約25 μ g，或大約750ng至大約 10 μ g，或大約1“8至大約5118。每日的總劑量通常是大約1 μ g至大約lOOmg，這可以通過單劑施用，或者，更通常地作為一天內(nèi)的分開的劑量施用。在另一個實(shí)施方案中，每日的總劑量可以是大約50 μ g至大約75mg，或大約100 μ g至大約50mg，或大約500 μ g至大約 25mg,或大約750 μ g至大約10mg，或大約Img至大約5mg。本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗還可以口服或經(jīng)口給藥，即通過口或經(jīng)由口進(jìn)入受試者體內(nèi)，包括吞咽或通過口粘膜運(yùn)輸(例如舌下或口腔吸收)或二者皆有?？梢韵蛞庥诜蚪?jīng)口給藥的本發(fā)明的制劑中加入合適的香味劑例如薄荷醇和左薄荷腦，或甜味劑例如糖精或糖精鈉。本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗可以經(jīng)直腸或陰道施用，例如以栓劑、陰道藥栓或灌腸劑的形式?？煽捎褪莻鹘y(tǒng)的栓劑基質(zhì)，但是可以視需要使用各種替代物。用于直腸 /陰道給藥的制劑可以配制為即釋和/或改釋。改釋制劑包括延釋、緩釋、脈沖釋、控釋、靶向釋放和程序化釋放。本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗還可以直接向眼或耳施用，通常是等滲的pH經(jīng)調(diào)節(jié)的無菌鹽水中的微粉化懸浮液或溶液的滴液的形式。適合于眼和耳給藥的其它制劑包括膏、生物可降解的(例如可吸收的凝膠海綿、膠原)和非生物可降解的(例如硅酮)植入物、糯米紙劑、鏡片和顆粒或囊泡系統(tǒng)，例如非離子型表面活性劑脂質(zhì)體(niosomes)或脂質(zhì)體?？梢該饺刖酆衔铮缃宦?lián)的聚丙烯酸、聚乙烯醇、透明質(zhì)酸、纖維質(zhì)聚合物例如羥丙甲基纖維素、羥乙基纖維素或甲基纖維素或異聚糖聚合物，例如gelan gum ；并一起摻入防腐劑，例如苯扎氯胺。還可以通過電離子透入法遞送此類制劑。用于眼/耳給藥的制劑可以配制為即釋和/或改釋。改釋制劑包括延釋、緩釋、脈沖釋、控釋、靶向釋放和程序化釋放。本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗可用于制備用于治療或預(yù)防動物中的牛病毒性腹瀉病毒感染的傳播的藥物。本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗可用于制備用于向動物施用的藥物，其中所述藥物是包含嵌合瘟病毒的DIVA瘟病毒疫苗，所述嵌合瘟病毒包含不表達(dá)其同源Ems蛋白的牛病毒性腹瀉病毒，并且其中所述嵌合瘟病毒表達(dá)源自另一種瘟病毒的異源Ems蛋白，或所述異源Ems蛋白的天然、合成的或遺傳變體。在一個實(shí)施方案中，所述嵌合瘟病毒具有至少一種不存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中的Ems表位。在另一個實(shí)施方案中，所述嵌合瘟病毒缺失至少一種存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中的Ems表位。檢測、診斷方法本發(fā)明提供了確定存在于動物受試者中的瘟病毒的來源的方法。使用DIVA疫苗進(jìn)行的接種提供了用于確定存在于動物受試者中的瘟病毒的來源的方法，其中所述DIVA疫苗能夠區(qū)分感染的與接種的動物。這種區(qū)分可以通過多種診斷方法中的任一種來實(shí)現(xiàn)，包括但不限于，ELISA, Western印跡和PCR。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易獲知并知曉這些和其它方法。本發(fā)明的嵌合瘟病毒可區(qū)別于野生型BVDV株，所述區(qū)別在于它們的基因組組成和表達(dá)的蛋白。此類區(qū)別允許區(qū)分接種的和感染的動物。例如，可以確定在某些實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中測試為BVDV陽性的動物是攜帶野生型BVDV株還是攜帶通過以前的接種而獲得的本發(fā)明的嵌合瘟病毒?？梢允褂枚喾N測定法來進(jìn)行所述確定。例如，可以從測試為BVDV陽性的動物分離病毒，并可以使用基于核酸的測定法來確定嵌合瘟病毒基因組的存在(其指示以前的接種)?；诤怂岬臏y定法包括Southern或Northern印跡分析、PCR和測序?？商娲?，可以使用基于蛋白的測定法。在基于蛋白的測定法中，可以從測試為BVDV陽性的動物分離懷疑被感染的細(xì)胞或組織。可以從此類細(xì)胞或組織中制備細(xì)胞提取物，并可以進(jìn)行例如Western 印跡，其中使用針對能夠區(qū)分性地鑒別存在之前接種的嵌合瘟病毒還是野生型BVDV的病毒蛋白的合適的抗體?？梢酝ㄟ^使用多種技術(shù)來評估在動物中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的程度和性質(zhì)。例如，可以從接種的動物中收集血清，并測定是否存在特異于嵌合病毒的抗體，例如，在常規(guī)的的病毒中和測定中進(jìn)行測定?？梢酝ㄟ^測定例如T細(xì)胞增殖測定來進(jìn)行淋巴組織中響應(yīng)性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的檢測，以指征細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。相關(guān)的技術(shù)在本領(lǐng)域中有詳盡的描述，例如 Coligan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc. (1994)。試劑盒由于可能需要聯(lián)合另外的化合物來施用免疫原性組合物或疫苗，例如為了治療特定疾病或病況的目的，所以，本發(fā)明的范圍包括免疫原性組合物或疫苗可以方便地包括于或組合于試劑盒的形式中，所述試劑盒適合于組合物的施用或聯(lián)合施用。因此，本發(fā)明的試劑盒可以包含一種或多種分開的藥物組合物，其中至少一種是根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗，以及用于分開盛放所述組合物的器具，例如，容器、 分割瓶或分割的鋁箔袋。此類試劑盒的實(shí)例是注射器和針等等。本發(fā)明的試劑盒特別適合于施用不同的劑型(例如，口服或腸胃外)，適合于以不同的給藥間隔施用分開的組合物， 或適合于滴定針對彼此的分開的組合物。為了輔助施用本發(fā)明的組合物，試劑盒通常包含施用說明書。本發(fā)明的另一種試劑盒可以包含用于檢測和區(qū)分BVDV感染的動物和嵌合瘟病毒接種的動物的一種或多種試劑。試劑盒可以包含用于分析樣品中是否含有不存在于免疫原性組合物或疫苗的嵌合瘟病毒中的完整BVDV或BVDV多肽、表位或多核苷酸序列的試劑?？商娲兀景l(fā)明的試劑盒可以包含用于分析樣品中是否含有不存在于野生型BVDV中的嵌合瘟病毒或多肽、表位或多核苷酸序列的試劑?？梢允褂每贵w、PCR、雜交和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它檢測方法來測定病毒、多肽或多核苷酸序列的存在。本發(fā)明的另一種試劑盒可以提供用于檢測針對特定表位的抗體的試劑。表位存在于本發(fā)明的嵌合瘟病毒中而不存在于野生型BVDV中；或者，存在于野生型BVDV中而不存在于本發(fā)明的嵌合瘟病毒中。此類試劑可用于分析樣品中是否存在抗體，并且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易知曉和獲得的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法來測定抗體的存在。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可以包含一組印刷的說明書或標(biāo)簽，以指明該試劑盒可用于檢測和區(qū)分BVDV感染的動物與嵌合瘟病毒接種的動物?？贵w抗體可以是單克隆的，多克隆的或重組的?？梢苑奖愕刂苽溽槍γ庖咴蚱洳糠值目贵w。例如，可以分離基于免疫原的氨基酸序列的合成的肽，或通過克隆技術(shù)重組制備的肽，或天然基因產(chǎn)物和/或其部分，并用作免疫原。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)抗體產(chǎn)生技術(shù)，使用免疫原來產(chǎn)生抗體，所述技術(shù)的一般性描述參見例如Harlow 和 Lane, "Antibodies :A Laboratory Manual，，，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NY, (1988)禾口Borrebaeck,"Antibody Engineering-A Practical Guide，，， W. H. Freeman和Co. (199 。還可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法從抗體中制備抗體片段，包括 Fab、F (ab' )jPFv。在制備抗體時，可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)方法來實(shí)現(xiàn)想要的抗體的篩選。未詳細(xì)描述的技術(shù)一般是遵循Mites，et al. (eds)，“ Basic and Clinical Immunology “(第 8 版)，Appleton 和 Lange，Norwalk, CT(1994)以及 Mishell 和 Shiigi (eds), “ Selected Methods in Cellular Immunology" , W. H. Freeman 和 Co., New York(1980) 0 一般而言，ELISA和Western印跡是優(yōu)選的免疫測定類型。這兩種測定是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。多克隆和單克隆抗體都可用于這些測定?？贵w可以結(jié)合于固體支持物基底上或綴合于可檢測部分，或者既是結(jié)合的又是綴合的，如本領(lǐng)域中所熟知的。 (關(guān)于熒光或酶部分的綴合的一般性討論，見Johnstone和Thorpe，‘‘ Immunochemistry in Practice “ , Blackwell Scientific Publications, Oxford (1982)) 抗體與固體支持物基底的結(jié)合也是本領(lǐng)域熟知的(關(guān)于一般性討論，見Harlow和Lane(1988)和 B0rrebaeck(1992))。用于本發(fā)明的可檢測部分可以包括但不限于，熒光的、金屬的、酶的和放射性的標(biāo)志物，例如生物素、金、鐵蛋白、堿性磷酸酶、b-半乳糖苷酶、過氧化物酶、脲酶、 熒光素、若丹明、氚、14C和碘。通過以下實(shí)施例進(jìn)一步詮釋本發(fā)明，但本發(fā)明不限于此。實(shí)施例1 嵌合瘟病毒的構(gòu)建和血清學(xué)表征大腸桿菌K12 GM2163[F-ara-14, leuB6, thi_l，fhuA31, IacYl，tsx-78，galK2, galT22, supE44, hisG4, rpsL136, (Strr), xyl-5, mtl-1, daml3: : Tn9 (Camr), dcm-6, mcrBl, hsdR2 (rk mk_)，mcrA]含有包含牛病毒性腹瀉病毒株NADL (BVDV-NADL)的全長基因組cDNA 的質(zhì)粒，其獲自 University of Nebraska 的 R. Donis 博士。RD細(xì)胞(用SV40轉(zhuǎn)化的牛睪丸細(xì)胞；獲自R. Donis博士 )維持于OptiMEM中，該培養(yǎng)基中補(bǔ)充了 3%馬血清、非必需氨基酸(NEAA)(在改良的fegle培養(yǎng)基(MEM)中)、 2mM GlutaMax 和 10ug/ml 慶大霉素。BK-6 細(xì)胞獲自 Pfizer Global Manufacturing (PGM)。 細(xì)胞在Dulbecco改良的fegles培養(yǎng)基(DMEM)中生長，該培養(yǎng)基中補(bǔ)充了 5%馬血清或供體牛血清(PGM)、2mM Glutamax和抗生素和抗真菌劑。除了指明的之外，所有的培養(yǎng)基成分購自Invitrogen(Carlskid，CA)。所有的細(xì)胞維持于37°C，5% CO2的環(huán)境中。特異于BVDV Erns 的單克隆抗體(MAb) I5C5 購自 IDEXX (Westbrook，ME)。針對 BVDV NS3的MAb 20. 10. 6由E. Dubovi博士(Cornell University)惠贈。具有針對邊界病病毒(BDV)Ems 蛋白的特異性的 MAb WS 363、WS 373 和 WS 371 獲自 Veterinary Laboratories Agency (Surrey, UK)。牛血清樣品 #77、#816、#1281 和 #1434 由 Pfizer 內(nèi)部提供。使用重疊PCR方法，通過將BVDV-NADL株的Ems基因替換為長頸鹿的Ems基因 (G-Ems)、馴鹿的Ems基因(R-Ems)或叉角羚的Ems基因(P-Ems)來產(chǎn)生嵌合瘟病毒。使用 PfuUltra II 融合 HS DNA 聚合酶(Stratagene ；La Jolla, CA)或P1 at inum iTaq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen) 用于重疊PCR和用于產(chǎn)生全長病毒DNA的寡核苷酸引物(以及相應(yīng)的SEQ ID NO)列于表1。表1.用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物
權(quán)利要求
1.嵌合瘟病毒，其中所述嵌合瘟病毒包含不表達(dá)其同源Ems蛋白的牛病毒性腹瀉病毒，并且其中所述嵌合瘟病毒表達(dá)源自另一種瘟病毒的異源Ems蛋白，或所述異源Ems蛋白的天然、合成的或遺傳變體。
2.權(quán)利要求1的嵌合瘟病毒，其中所述嵌合瘟病毒的異源Ems蛋白或所述異源Ems蛋白的天然、合成的或遺傳變體源自選自馴鹿瘟病毒、長頸鹿瘟病毒和叉角羚瘟病毒的瘟病毒。
3.權(quán)利要求1的嵌合瘟病毒，其中所述嵌合瘟病毒的異源Ems蛋白具有至少一種不存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中的Ems表位。
4.權(quán)利要求1的嵌合瘟病毒，其中所述嵌合瘟病毒的異源Ems蛋白缺失至少一種存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中的Ems表位。
5.權(quán)利要求1的嵌合瘟病毒的培養(yǎng)物。
6.包含權(quán)利要求1的嵌合瘟病毒的細(xì)胞系或宿主細(xì)胞。
7.編碼權(quán)利要求1的嵌合瘟病毒的多核苷酸分子。
8.包含權(quán)利要求1的嵌合瘟病毒和獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體的免疫原性組合物。
9.權(quán)利要求8的免疫原性組合物，其中所述獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體是佐劑。
10.權(quán)利要求8的免疫原性組合物，其中所述嵌合瘟病毒是活的減毒的。
11.權(quán)利要求8的免疫原性組合物，其中所述嵌合瘟病毒是滅活的。
12.權(quán)利要求8的免疫原性組合物，其進(jìn)一步包含用于治療或預(yù)防牛中的一種或多種另外的致病微生物的傳播的一種或多種另外的抗原。
13.包含權(quán)利要求7的多核苷酸分子和獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體的免疫原性組合物。
14.包含權(quán)利要求1的嵌合瘟病毒和獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體的疫苗。
15.權(quán)利要求14的疫苗，其中所述獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體是佐劑。
16.權(quán)利要求14的疫苗，其中所述嵌合瘟病毒是活的減毒的。
17.權(quán)利要求14的疫苗，其中所述嵌合瘟病毒是滅活的。
18.包含權(quán)利要求7的多核苷酸分子和獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體的疫苗。
19.權(quán)利要求14的疫苗，其進(jìn)一步包含用于治療或預(yù)防牛中的一種或多種另外的致病微生物的傳播的一種或多種另外的抗原。
20.試劑盒，其在至少一個容器中包含權(quán)利要求14的疫苗。
21.治療或預(yù)防牛病毒性腹瀉病毒感染的傳播的方法，其中向動物施用權(quán)利要求14的疫苗。
22.接種動物的方法，其中向所述動物施用DIVA瘟病毒疫苗，其中所述DIVA瘟病毒疫苗包含權(quán)利要求1的嵌合瘟病毒，并且其中所述嵌合瘟病毒具有至少一種不存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中的Ems表位。
23.接種動物的方法，其中向所述動物施用DIVA瘟病毒疫苗，其中所述DIVA疫苗包含權(quán)利要求1的嵌合瘟病毒，并且其中所述嵌合瘟病毒缺失至少一種存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中的Ems表位。
24.區(qū)分接種了權(quán)利要求14的疫苗的動物與感染了野生型牛病毒性腹瀉病毒的動物的方法，其中接種了所述疫苗的動物產(chǎn)生抗體，所述抗體抗至少一種存在于所述疫苗的嵌合瘟病毒中但不存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中的Ems表位，所述方法包括以下步驟a)從動物獲取血清樣品；b)就所述抗體的存在或不存在測定所述樣品；c)將具有所述抗體的動物鑒定為已經(jīng)過所述疫苗接種；和d)將不含所述抗體的動物鑒定為已被野生型BVDV感染。
25.區(qū)分感染了野生型牛病毒性腹瀉病毒的動物和接種了權(quán)利要求14的疫苗的動物的方法，其中感染了野生型牛病毒性腹瀉病毒的動物產(chǎn)生抗體，所述抗體抗至少一種存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中但不存在于所述疫苗的嵌合瘟病毒中的Ems表位，所述方法包括以下步驟a)從動物獲取血清樣品；b)就所述抗體的存在或不存在測定所述樣品；c)將具有所述抗體的動物鑒定為已被野生型BVDV感染；和d)將不含所述抗體的動物鑒定為已經(jīng)過所述疫苗接種。
26.用于區(qū)分接種了包含權(quán)利要求1的嵌合瘟病毒的疫苗的動物與感染了野生型牛病毒性腹瀉病毒的動物的診斷試劑盒，所述試劑盒包含能夠檢測針對至少一種存在于所述疫苗的嵌合瘟病毒中但不存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中的Ems表位的抗體的試劑。
27.用于區(qū)分感染了野生型牛病毒性腹瀉病毒的動物和接種了包含權(quán)利要求1的嵌合瘟病毒的疫苗的動物的診斷試劑盒，所述試劑盒包含能夠檢測針對至少一種存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中但不存在于所述疫苗的嵌合瘟病毒中的Ems表位的抗體的試劑。
28.識別Ems表位的抗體，所述表位存在于權(quán)利要求1的嵌合瘟病毒中但不存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中。
29.識別表位的抗體，所述表位存在于野生型牛病毒性腹瀉病毒中但不存在于權(quán)利要求1的嵌合瘟病毒中。
全文摘要
本發(fā)明涉及可用作免疫原性組合物和疫苗的嵌合瘟病毒，其中所述嵌合瘟病毒包含不表達(dá)其同源Erns蛋白的牛病毒性腹瀉病毒，并且其中所述嵌合瘟病毒表達(dá)源自另一種瘟病毒的異源Erns蛋白，或所述異源Erns蛋白的天然的、合成的或遺傳變體。本文還描述了用于治療或預(yù)防牛病毒性腹瀉病毒感染的傳播的方法和試劑盒，以及用于區(qū)分經(jīng)接種的和野生型感染的動物的方法和試劑盒。
文檔編號C07K16/10GK102239251SQ200980148483
公開日2011年11月9日 申請日期2009年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月3日
發(fā)明者R·G·安肯鮑爾, S-K·W·韋爾奇, Y·羅, Y·袁 申請人:輝瑞大藥廠