一種抗牛病毒性腹瀉病毒蛋白E2特異性IgY的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種特異性IgY的制備和應(yīng)用，具體涉及一種抗 牛病毒性腹瀉病毒蛋白E2特異性IgY的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛病毒性腹瀉?。˙ovine viral diarrhea，BVD)，又稱牛病毒性腹瀉.粘膜病 (Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD)是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起牛的多種臨床癥狀如高熱、白細(xì)胞減少、沉郁、下痢、大 量流涎、減奶以至停奶、反芻停止、結(jié)膜炎、口腔粘膜出血并出現(xiàn)潰瘍癥狀等的一種疾病。孕 ?？赡芰鳟a(chǎn)、產(chǎn)死胎和畸形胎等。還可引起牛的免疫耐受與持續(xù)性感染，免疫抑制。
[0003] 該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給世界各國(guó)畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，每年死 于此感染的牛不少于500萬(wàn)頭，同時(shí)由于其持續(xù)感染等造成的間接損失也嚴(yán)重阻礙了畜牧 業(yè)的發(fā)展。
[0004] 目前國(guó)內(nèi)外主要的檢測(cè)方法有：
[0005] PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速高效等特點(diǎn)，已廣泛用于多個(gè)領(lǐng)域。近幾年 來(lái)，又有新的發(fā)展。RT-PCR可以敏感快速地從組織、排泄物、血清、細(xì)胞培養(yǎng)物等檢出BVDV 而且可以區(qū)分豬瘟和羊邊界病毒，利用該方法還可以進(jìn)行BVDV核酸序列的研宄。
[0006] 病毒分離技術(shù)是一種最基本、最準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。常用來(lái)分離BVDV用的細(xì)胞是牛 鼻氣管細(xì)胞（BT)和牛腎細(xì)胞傳代細(xì)胞株（MDBK)。
[0007] 電鏡技術(shù)成為病毒學(xué)研宄、快速診斷不可或缺的手段。這種方法快捷、方便、直觀。 然而電鏡觀察需要高含量的病毒粒子，需要對(duì)病毒進(jìn)行濃縮。
[0008] 抗體的檢測(cè)可以為免疫接種程序的制定和臨床診斷提供依據(jù)。相比其它抗體檢測(cè) 方法，膠體金試紙條和ELISA試劑盒操作簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉，在臨床上被廣泛應(yīng)用，膠體金試 紙條和傳統(tǒng)的HI相比，其敏感性和特異性達(dá)到97. 1 %，76. 6%，而ELISA試劑盒陽(yáng)性檢出率 達(dá)到85 %，和HI符合率達(dá)到80 %。
[0009] IgY技術(shù)，即通過(guò)對(duì)禽類（雞）免疫注射特定抗原，從卵黃中獲得特異性多克隆抗 體。相對(duì)于哺乳動(dòng)物抗體，IgY技術(shù)避免了常規(guī)的動(dòng)物采血，滿足動(dòng)物福利要求，且抗體產(chǎn)量 大，制備相對(duì)簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)明顯，更為重要的是，IgY還具有一系列生物學(xué)與抗體特性與優(yōu) 勢(shì)。近年來(lái)，IgY抗體在醫(yī)藥、生物技術(shù)領(lǐng)域都呈現(xiàn)出良好的發(fā)展勢(shì)頭。IgY已廣泛應(yīng)用于 細(xì)菌、病毒等病原體檢測(cè)，特異性、敏感性較好，同時(shí)能夠降低BVDV治療成本和基于IgY檢 測(cè)試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種抗牛病毒性腹瀉病毒蛋白E2 特異性IgY的制備方法，以便用于BVDV病毒的檢測(cè)與治療。
[0011] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0012] -種抗牛病毒性腹瀉病毒蛋白E2特異性IgY的制備方法，其特征在于，所述方法 包括以下步驟：
[0013] (1)牛病毒性腹瀉病毒E2基因的克隆與序列分析：根據(jù)BVDV-E2基因序列，利用 primer prime5. 0軟件，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，PCR擴(kuò)增BVDV-E2基因（KMObp)，連接至pMD18-T載 體，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，提取質(zhì)粒，酶切分析，陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序。
[0014] (2)Ε2蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化。pMD18-T-E2和pET-32a載體使用BamH I 和Xho I雙酶切，目的片段連接，構(gòu)建pET-32a-E2表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化Bal21 (DE3)pLysS感受 態(tài)細(xì)菌，酶切和PCR鑒定后，優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)濃度和時(shí)間，進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE和Western blot分析，使用Ni+親和層析柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。結(jié)果表明，構(gòu) 建成功pET-32a-E2表達(dá)載體，重組E2蛋白在0. 75mmol/L的IPTG誘導(dǎo)5h，主要以包涵體形 式存在，43ku附近出現(xiàn)片段，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni+柱純化后。Western blot表明重組蛋白具有 良好的反應(yīng)原性。
[0015] (3)抗E2-IgY抗體的制備。純化的E2蛋白免疫產(chǎn)蛋雞，使用PEG6000提取特異 性IgY抗體，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。間接ELISA測(cè)定免疫后抗E2-IgY抗體效價(jià)，Western blot鑒定所獲抗E2-IgY的特異性。結(jié)果表明，IgY抗體經(jīng)SDS-PAGE分析包含兩條鏈，重鏈 (65ku)和輕鏈（19ku);四免后，抗E2-IgY效價(jià)達(dá)到I : 128000，Western blot表明，所制 備IgY抗體可特異性結(jié)合E2蛋白。
[0016] 所述制備免疫蛋方法如下：向20周齡禽類進(jìn)行初次免疫注射，免疫劑量為 300 μ g/只，初次免疫21天之后，進(jìn)行4次加強(qiáng)免疫，間隔時(shí)間為21天，免疫劑量為250 μ g/ 只，所屬禽類為雞。
[0017] 所述提取IgY的方法如下；
[0018] (1)將所述收集的蛋進(jìn)行卵黃與卵清分離，收集卵黃，將卵黃使用PBS(pH7. 4)按 照體積比1:2進(jìn)行稀釋；
[0019] (2)向稀釋液加入質(zhì)量體積比為3. 5%的PEG-6000,充分?jǐn)嚢?，搖床上室溫作用30 分鐘；
[0020] (3)將混合液離心，收集上清，過(guò)濾，濾液加入質(zhì)量體積比為8. 5%的PEG-6000，充 分?jǐn)嚢瑁瑩u床上室溫作用30分鐘；
[0021] (4)將經(jīng)過(guò)攪拌后的混合液離心，棄去上清液，沉淀使用10毫升的PBS懸浮，加入 質(zhì)量體積比為12%的PEG-6000,充分?jǐn)嚢?，搖床上室溫作用30分鐘，再進(jìn)行離心，獲得沉淀 物；
[0022] (5)將所述沉淀物使用1. 2毫升PBS溶解后，使用透析帶進(jìn)行透析，使用PBS透析 過(guò)夜，獲得IgY，并保存在_20°C備用。
[0023] 本發(fā)明的有益效果：
[0024] (1)本發(fā)明的方法提取的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性；
[0025] (2)本發(fā)明提取的抗E2-IgY抗體可較好地結(jié)合E2蛋白，而與降解片段無(wú)交叉反 應(yīng)；
[0026] (3)提取方法相對(duì)簡(jiǎn)單，抗體產(chǎn)量大，制備成本低。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作詳細(xì)說(shuō)明。
[0028] -種抗牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白IgY的制備方法，所述方法包括以下步驟：
[0029] (1)牛病毒性腹瀉病毒E2基因的克隆與序列分析。根據(jù)GenBank報(bào)道的有關(guān) BVDV-E2基因序列，利用primer prime5. 0軟件，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，PCR擴(kuò)增BVDV-E2基因 (KMObp)，連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，提取質(zhì)粒，酶切 分析，陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序。
[0030] (2)Ε2蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)、純化。pMD18-T-E2和pET-32a載體使用BamHI 和XhoI雙酶切，目的片段連接，構(gòu)建pET-32a-E2表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化Bal21 (DE3)pLysS感受 態(tài)細(xì)菌，酶切和PCR鑒定后，優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)濃度和時(shí)間，進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE和Western blot分析，使用Ni+親和層析柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。結(jié)果表明，構(gòu) 建成功pET-32a-E2表達(dá)載體，重組E2蛋白在0. 75mmol/L的IPTG誘導(dǎo)5h，主要以包涵體形 式存在，在43ku附近出現(xiàn)片段。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni+柱純化后，Western blot表明重組蛋白具 有良好的反應(yīng)原性。
[0031] (3)抗E2-IgY抗體的制備。純化的E2蛋白免疫產(chǎn)蛋雞，使用PEG6000提取特異 性IgY抗體，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。間接ELISA測(cè)定免疫后抗E2-IgY抗體效價(jià)，Western blot鑒定所獲抗E2-IgY的特異性。結(jié)果表明，IgY抗體經(jīng)SDS-PAGE分析包含兩條鏈，重鏈 (65ku)和輕鏈（19ku);四免后，抗E2-IgY效價(jià)達(dá)到I : 128000，Western blot表明，所制 備IgY抗體可特異性結(jié)合E2蛋白。
[0032] 實(shí)施例
[0033] 本實(shí)施例擬對(duì)BVDV-E2結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行克隆，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-E2,表達(dá) 和純化E2蛋白，并將其作為免疫原，免疫產(chǎn)蛋雞，生產(chǎn)抗E2重組蛋白特異性IgY抗體。
[0034] 1、引物設(shè)計(jì)與合成
[0035] 根據(jù)GenBank登記的牛病毒性腹瀉病毒參考株（FJ011098)序列，使用軟件 Primer Prime5. 0設(shè)對(duì)引物，用于擴(kuò)增Ε2基因全長(zhǎng)DNA序列（11040bp)。上游引 物P :5, -ATGGATCCAATATAGACTCGGCG-3，(下劃線處為BamH I酶切位點(diǎn)），下游引物R : 5, -CCGCTCGAGACCATGGTATGTCTA-3，(下劃線處為Xho I酶切位點(diǎn)）。引物由上海生工公司 合成，雙蒸水稀釋為lOpmol/y L，-20°C保存。
[0036] 2、E2基因的PCR擴(kuò)增
[0037] 模板制備：取病毒上清50 yL，沸水煮IOmin