用于檢測藍舌病毒、牛病毒性腹瀉病毒和口蹄疫病毒的GeXP多重快速檢測用引物和檢測方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物技術(shù)應用領域，尤其是用于=種進境奶牛病毒病的同時檢測與鑒 定。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫（Foot and Mouth Disease，F(xiàn)MD)、牛病毒性腹瀉（Bovine Viral Diarrhea, BVD)和藍舌病(Bluetongue，BT)是國家規(guī)定的進境奶牛需要隔離檢疫的巧巾病毒 性疾病。近幾年，隨著國民對優(yōu)質(zhì)奶制品需求的提升，進境奶牛數(shù)量逐年攀升，給奶牛進境 口岸動物疫病檢測實驗室?guī)硪欢ǖ墓ぷ鲏毫徒?jīng)費負擔。因此，建立一種可W同時鑒別 診斷多種奶牛疫病的高通量快速檢測方法對減輕奶牛進境口岸檢測實驗室工作負擔、降低 檢測經(jīng)費及開展進境奶牛攜帶疫病的流行病學調(diào)查具有重要意義。
[0003] 目前，針對進境奶牛的多種病毒性疾病，口岸動物檢疫實驗室普遍應用病毒分離、 血清學方法和分子生物學方法進行檢測。病毒分離培養(yǎng)是診斷的金標準，但存在測周期長、 操作繁瑣等問題;病毒中和試驗需要特異性的標準血清或病毒毒株，在實際應用中具有一 定的局限性;進口的酶聯(lián)免疫試劑盒普遍價格昂貴;普通PCR、巧光定量PCR等分子生物學方 法皆為針對單一病毒檢測，無法滿足多種病原混合感染鑒別診斷的檢測需求。多重PCR技術(shù) 已經(jīng)應用于多種病原的鑒別診斷，但由于擴增偏愛性問題無法實現(xiàn)真正意義上的高通量檢 測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 近幾年由于進口奶牛數(shù)量的逐年增多，承擔進境奶牛疫病檢測任務的動物檢疫工 作人員亟需一種靈敏度高、特異性好的檢測方法W滿足降低外來動物疫病傳入風險和實現(xiàn) 快速通關(guān)的工作需求。目前，大多口岸動檢實驗室所應用的血清學(酶聯(lián)免疫法)實驗，每種 檢測試劑盒只能檢驗單一動物疫病，無法鑒別多種動物疫病的混合感染，并且進口檢測試 劑盒昂貴的價格而給檢測實驗室?guī)砗艽蟮慕?jīng)濟壓力。因此，建立一種高通量、快速、特異 性好的檢測方法對于降低動物疫病傳入風險，加速進境動物通關(guān)，促進貿(mào)易便利化W及降 低動物疫病檢測成本均有重要的意義。
[0005] GeXP多重基因表達分析系統(tǒng)將多重PCR技術(shù)和毛細管電泳技術(shù)結(jié)合起來，不僅具 有多重PCR擴增高通量檢測的優(yōu)點，而且具有毛細管電泳靈敏性高的特點。GeXP的技術(shù)特點 是在特異性引物的5'端加入通用引物序列，組成特異性嵌合引物。在PCR反應過程中，特異 性嵌合引物先分別與對應的模板結(jié)合，保證后續(xù)擴增的特異性，經(jīng)過多個循環(huán)W后，由通用 引物主導后續(xù)的擴增，運樣可W減少同一反應體系中不同引物之間的干擾，實現(xiàn)每對引物 擴增效率趨于一致，從而有效解決了常規(guī)多重PCR技術(shù)的擴增偏愛性問題。
[0006] 本研究根據(jù)3種進境奶牛檢疫性病毒的基因保守序列，分別設計了多對特異性引 物和通用引物，優(yōu)化反應條件，通過對單一病毒模板、混合病毒模板的檢測驗證了 GeXP多重 RT-PCR體系中每對引物擴增的特異性和準確性，建立了同時檢測巧中奶牛病毒病的GeXP高 通量方法，檢測靈敏度至少可達IO2拷貝/yL。該方法可為進境奶牛病毒病的分子診斷及境 外奶牛疫病的流行病學調(diào)查提供技術(shù)支持。今后，還需要大量的陽性樣本或病毒毒株對本 方法做進一步的驗證和優(yōu)化。
【附圖說明】
[0007] 圖1-圖4 GeXP多重RT-PCR特異性驗證結(jié)果（圖1，BTV;圖2，BVDV;圖3，F(xiàn)MDV;圖4， 50bp-800bp Marker)，圖中Y軸為相對巧光單位，表示擴增產(chǎn)物的巧光強度，X軸為毛細管電 泳過程中擴增產(chǎn)物的大小。
[000引圖5-圖10 GeXP多重RT-PCR對巧巾病毒模板的靈敏度結(jié)果（圖5, IO6Copies/化；圖 6，105。0口163/化；圖7，104。0口163/化；圖8，103。0口163/化；圖9，102。0口163/化；圖10,506口-SOObp Marker)。
【具體實施方式】
[0009] GeXP啟動試劑盒、DNA size standard Kit、分離緩沖液、上樣緩沖液購自美國貝 克曼公司，一步法RT-PCR試劑盒、RNA提取試劑盒、基因純化試劑盒購自德國QIAGEN公司，T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、Spe I限制性核酸內(nèi)切酶和RNA酶抑制劑均購自大連寶生物公司，pGEX-T 載體購自Promega公司。
[0010] 參考文獻選擇各病毒基因保守區(qū)并從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載巧巾病毒的基因序列， 通過DNASTAR軟件分析序列同源性，并用GeXP e卻ress Profiler工具設計多重特異性引 物。在正、反向特異性引物5'端分別連接一段非同源性序列作為通用引物(Tag),組成特異 性嵌合引物。引物由Invitrogen公司合成，HPLC純化。
巧5標 5'端 端用 cyS標記；
[0017]沈Q ID N0:6-FMDV4:5'-GTACGACTCACTATAGGGACCAGTCCCCTTCTCAGATC-3';
[001 引 SEQ ID 備:7-通用引物1:5'-466164〔4口'41464414-3'5'端用0巧標記；
[0019] 沈9 10備:8-通用引物2:5'-614〔64(：1'〔4口'4146664-3';
[0020] 滅活的BT、BVDV、FMDV毒株均為本實驗室保存。病毒RNA的提取使用QIAGEN公司RNA 提取試劑盒，洗脫體積為40yL，于-80°C保存。
[0021] W不含通用引物的特異性引物分別擴增含有目的基因區(qū)域的病毒RNA，擴增后的 PCR產(chǎn)物連接到pGEX-T載體進行單克隆構(gòu)建質(zhì)粒，提取克隆質(zhì)粒，Spe I酶切線性化，并用基 因純化試劑盒對線性化后質(zhì)粒進行純化，用T7轉(zhuǎn)錄試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄，利用紫外分光光 度計測量RNA濃度并計算各病毒RNA的拷貝數(shù)。
[0022] 將通用引物稀釋至工作濃度lOwnol/L，特異性引物稀釋至工作濃度1皿ol/L。提取 巧中病毒RNA作為模板，按照一步法RT-PCR試劑盒配制反應體系：10 X RT-PCR緩沖液2.扣L， dNTP預混液化L，RT-PCR化巧me Mix化L，RNA酶抑制劑0.化L，上下游嵌合引物（1皿ol/L) 各取化L，上下游通用引物（10皿ol/L)各取化L，模板RNA化L，用不含核酸酶的水補足25化。 經(jīng)過條件優(yōu)化后，最終確定反應條件為:45°C30min，94°C 15min逆轉(zhuǎn)錄;然后:94°C30s，55°C 303,721：303，10個循環(huán)；941：303,651：303,721：303，10個循環(huán)；941：303,501：303,721： 30s，20個循環(huán);72°C IOmin，1個循環(huán)。反應產(chǎn)物進行GeXP system毛細管電泳分析。
[0023] 將各病毒對應的嵌合引物分別取等量進行混合，配制成多重混合引物，使各引物 濃度為10皿ol/L，并在反應體系中的終濃度為50nmol/L，反應體系中其它成分同單重RT-PCR，取巧中病毒滅活樣本核酸驗證多重RT-PCR檢測體系中各引物的特異性。
[0024] 將體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA梯度稀釋至105、104、10 3、102、1〇1拷貝/化，各取化L作為模板， 檢測多重體系的靈敏度。
[0025] 根據(jù)多引物單模板靈敏度試驗結(jié)果調(diào)整各對引物濃度。將巧中病毒體外轉(zhuǎn)錄RNA等 濃度混合并梯度稀釋為1〇6、1〇 5、1〇4、1〇3、1〇2拷貝/化作為模擬混合樣品，其余反應條件不 變，進行多引物多模板靈敏度分析。實驗非同日重復=次，記錄檢測結(jié)果并計算各基因檢測 的變異系數(shù)CV。
【具體實施方式】
[0026]
[0027] 實施例1引物驗證
[0028] 單重RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)GeXP系統(tǒng)毛細管電泳分析，各目的基因擴增片段大小分別為 BTV: 306~310bp，BVDV: 347~352bp，F(xiàn)MDV: 365~370bp，擴增片段大小與設計相符。
[0029] 實施例2多重檢測體系建立及單模板特異性驗證結(jié)果
[0030] 多引物檢測體系中，每個反應只擴增出單一病毒模板的特異片段，無交叉反應，提 示此方法特異性強，可根據(jù)擴增片段大小鑒別區(qū)分各病毒，結(jié)果見圖1。
[0031 ]實施例3多重檢測體系單模板靈敏度試驗結(jié)果
[0032] 利用克隆質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，各種病毒的檢測下限分別為:FMDV為10拷貝Ai L ,BVDV 為 100 拷貝 AiL。
[0033] 實施例4多重檢測體系多模板靈敏度結(jié)果
[0034] 優(yōu)化反應條件后，多重檢測體系可在106、105、10 4、103、IO2拷貝AiL水平同時檢測3 種病毒RNA的模擬混合模板，結(jié)果見圖2。實驗非同日S次重復，在IO4拷貝AiL時，各病毒基 因變異系數(shù)介于1.2%~7.6%之間。
【主權(quán)項】
1. 一種同時檢測口蹄疫（Foot and Mouth Disease，F(xiàn)MD)、牛病毒性腹瀉（Bovine Viral Diarrhea，BVD)、藍舌病(Bluetongue，BT)的引物組合:其特征在于特異性引物和通 用引物序列如SEQ NO: 1至8所不。2. 權(quán)利要求1所述的引物組合在制備口蹄疫(Foot and Mouth Disease，F(xiàn)MD)、牛病毒 性腹瀉（Bovine Viral Diarrhea，BVD)、藍舌病(Bluetongue，BT)診斷試劑中的應用。3. 一種同時檢測口蹄疫（Foot and Mouth Di sease，F(xiàn)MD)、牛病毒性腹瀉（Bovine Viral Diarrhea，BVD)、藍舌病(Bluetongue，BT)的試劑盒，其特征在于其特異性引物和通 用引物序列分別為:SEQ N0:l-8所示的引物;GeXP啟動試劑盒、分離緩沖液、上樣緩沖液，一 步法RT-PCR試劑、RNA提取試劑、基因純化試劑； 將通用引物稀釋至工作濃度ΙΟμ mol/L，特異性引物稀釋至工作濃度lymol/L，提取3種 病毒RNA作為模板，按照一步法RT-PCR試劑盒配制反應體系：10 X RT-PCR緩沖液2.5yL，dNTP 預混液2yL，RT-PCR Enzyme Mix lyL，RNA酶抑制劑O.lyL，上下游嵌合引物（Ιμπιο?/L)各取1 yL，上下游通用引物（lOymol/L)各取lyL，模板RNA 2yL，用不含核酸酶的水補足25yL;經(jīng)過 條件優(yōu)化后，最終確定反應條件為:45°C 30min，94°C 15min逆轉(zhuǎn)錄;然后:94°C 30s，55°C 30s， 72。〇308，10個循環(huán)；941€308,651€308,72 1€308，10個循環(huán)；941€308,501€308,72 1€308,20 個循環(huán);72°C lOmin，1個循環(huán)，反應產(chǎn)物進行GeXP system毛細管電泳分析。
【專利摘要】用于檢測藍舌病毒、牛病毒性腹瀉病毒和口蹄疫病毒的GeXP多重快速檢測用引物和檢測方法，本發(fā)明擬建立基于GeXP多重基因表達遺傳分析系統(tǒng)的多種奶牛疫病檢測方法，解決多種奶牛疫病檢測時血清學方法靈敏度低，常規(guī)PCR只能針對單一病原體檢測，基因芯片方法成本較高等問題，構(gòu)建3種奶牛疫病DNA陽性樣本標準質(zhì)粒；以質(zhì)粒DNA的10倍連續(xù)稀釋參考品為檢測對象，靈敏度為檢測至10-100拷貝；與其他奶牛疫病無交叉反應，無假陰性；檢測實際樣本600份，滿足大量奶牛多種疫病的監(jiān)控篩查要求。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68, C12Q1/70, C12R1/93
【公開號】CN105603120
【申請?zhí)枴緾N201510784508
【發(fā)明人】王乃福, 王萬騫, 吳冬雪, 黃晨, 陳小金, 劉洋, 董志珍, 趙祥平
【申請人】天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2015年11月17日