用于檢測(cè)高危型hpv的方法、寡核苷酸和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種檢測(cè)18種常見(jiàn)的高危型HPV 的方法、寡核巧酸和試劑盒，采用巧光PCR技術(shù)，對(duì)臨床樣品中可能存在的HPV16、18、31、33、 35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82進(jìn)行初步檢測(cè)和型別鑒定。
【背景技術(shù)】
[0002] 人乳頭瘤病毒化Uman papillomavirus，HPV)是一類可感染人表皮和粘膜鱗狀上 皮的小DNA病毒，能夠引發(fā)尖銳濕痛和宮頸癌等疾病。人類是HPV的唯一宿主。HPV基因組為 雙鏈環(huán)狀DNA，長(zhǎng)約7900對(duì)堿基(bp)，含8個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frames,ORFs)，由3 個(gè)基因區(qū)組成，包括早期區(qū)化區(qū)）、晚期區(qū)化區(qū)）W及非編碼區(qū)或上游調(diào)控區(qū)。E區(qū)按順序可 分為66、67、61、62、63、64和65共7個(gè)基因，其中66和67是冊(cè)￥的主要致癌基因，與冊(cè)￥的細(xì)胞 轉(zhuǎn)化功能和致癌性相關(guān)。L區(qū)主要有Ll和L2兩個(gè)基因。
[0003] 目前科學(xué)家們已發(fā)現(xiàn)120種W上的HPV亞型。不同的HPV亞型感染導(dǎo)致不同病變，根 據(jù)其是否可W引起癌癥，HPV亞型可分為：高危型HPV，與宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN 1/ II/III)的發(fā)生相關(guān)，常見(jiàn)的有冊(cè)￥16、18、31、33、35、45、51、52、56、58、29、68等亞型；低危型 HPV，一般與尖銳濕痛或低度鱗狀上皮內(nèi)病變相關(guān)，極少引起浸潤(rùn)癌，常見(jiàn)的有如HPV6、11、 42、43、44等亞型。關(guān)于高危型HPV與低危型HPV的劃分，國(guó)際上許多機(jī)構(gòu)都給出了參考建議， 依據(jù)W冊(cè)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC)及其他國(guó)際組織的研究成果，將HPV16、18、31、33、35、39、 45、51、52、56、58、59和68共13種亞型列為高危冊(cè)￥，并將冊(cè)￥26、53、66、73和82共5種亞型列 為中等風(fēng)險(xiǎn)HPV。在實(shí)際檢測(cè)時(shí)，常常將中等風(fēng)險(xiǎn)HPV亞型也歸于高危型HPV。
[0004] 80 %的女性一生中都會(huì)感染HPV病毒，通常病毒在6~8個(gè)月內(nèi)會(huì)自然清除，僅25 % 會(huì)發(fā)生癌前病變。高危型HPV的反復(fù)或持續(xù)感染被視為幾乎所有宮頸癌發(fā)生的必要條件?，F(xiàn) 有研究結(jié)果顯示，宮頸病變程度越重，高危型HPV感染率越高;在CINI、CINII和CINIII患者 中，高危型HPV感染率分別為30%、55%和65%，而99.8% W上的宮頸癌患者體內(nèi)能檢測(cè)到 高危型HPV感染，HPV陰性者幾乎不會(huì)發(fā)生宮頸癌。在運(yùn)些高危型HPV中，最為常見(jiàn)的是 冊(cè)V16,其次為冊(cè)V18,運(yùn)兩種高危型冊(cè)V亞型的感染率最高，可達(dá)70% ;若再加上冊(cè)V45和 HPV31，運(yùn)4種高危型HPV的感染率可達(dá)80%左右。我國(guó)一項(xiàng)橫跨7個(gè)宮頸癌發(fā)病率不同地區(qū) 的19家醫(yī)院、共納入1244個(gè)病例的中國(guó)宮頸癌相關(guān)高危型HPV亞型分布（W醫(yī)院為基礎(chǔ)的） 多中屯、研究證實(shí)，中國(guó)不同區(qū)域的宮頸癌及宮頸高度病變都是W感染HPV16/18為主，大約 85%的宮頸癌確診病例屬于運(yùn)兩種亞型，且HPV16/18的感染率和致癌率都明顯高于其他高 危型HPV(Chen W et al.Human papillomavirus type-distribution in cervical cancer in China:the importance of HPV 16and 18.Cancer Causes and Control, 2009,20:1705-1713)。
[0005] 此外，已有研究表明感染HPV16/18的女性，不論是近期還是遠(yuǎn)期，進(jìn)展為高度宮頸 病變的風(fēng)險(xiǎn)都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它高危型HPV?；诖耍?013年美國(guó)陰道鏡檢查與宮頸病理學(xué)會(huì) (ASCCP)特別提出要對(duì)細(xì)胞學(xué)ASC-US(即通過(guò)宮頸液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞學(xué)上無(wú) 明確意義的非典型鱗狀細(xì)胞的改變）陰性、HPV陽(yáng)性的30歲W上女性進(jìn)行HPV16/18基因分型 檢測(cè)。由于不同HPV亞型的致病性及預(yù)后的差異，對(duì)HPV16/18進(jìn)行分型，將有助于更好地對(duì) 高風(fēng)險(xiǎn)人群進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層管理，及時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞學(xué)正常結(jié)果中患CIN的高危人群，W及ASC-US 陽(yáng)性結(jié)果中需要更密切隨訪的人群。
[0006] 宮頸癌早期癥狀并不明顯，發(fā)展過(guò)程中存在較長(zhǎng)的、可逆轉(zhuǎn)的癌前病變期。從一般 的宮頸癌前病變發(fā)展為宮頸癌大約需要10年時(shí)間。如能在癌前病變階段進(jìn)行醫(yī)學(xué)干預(yù)，宮 頸癌治愈率可達(dá)98%。因此，對(duì)高危型HPV進(jìn)行篩查仍是目前預(yù)防宮頸癌的關(guān)鍵。
[0007] 目前常見(jiàn)的高危型HPV檢測(cè)方法有巧光PCR法、雜交捕獲法和PCR-反向點(diǎn)雜交法 等。雜交捕獲法的缺點(diǎn)是無(wú)內(nèi)標(biāo)，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)（一般需要5-6小時(shí)），靈敏度低（3.5 X 105copies/ml)，操作復(fù)雜，檢測(cè)基因型偏少，假陽(yáng)性率較高。PCR-反向雜交法雖然能夠檢測(cè) 比較多的HPV亞型，但是其缺點(diǎn)是檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)(至少需要4小時(shí)），檢測(cè)成本高，檢測(cè)靈敏度低 (10 4copies/ml)，操作復(fù)雜，不能滿足臨床高通量篩查的需要。
[0008] 巧光PCR法具有較高的靈敏度和特異性，而且能對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)在線檢測(cè)，能 夠大幅度地降低檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)還避免殘留污染的發(fā)生。常見(jiàn)的巧光PCR法有SYBR Green I 染料法，雙探針雜交法W及化qman探針?lè)ǖ?。其中SYBR Green I由于是非飽和染料，特異性 不如雙探針雜交法W及化qman探針?lè)?，必須通過(guò)觀察溶解曲線來(lái)判斷其特異性;而雙探針 法雜交法成本又較為昂貴。
[0009] 目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上，已有不少?gòu)S家開(kāi)發(fā)出基于巧光PCR法檢測(cè)高危型HPV的產(chǎn)品，且 大多是同時(shí)檢測(cè)13、14或15種高危型HPV的，只有少數(shù)廠家利用巧光PCR法開(kāi)發(fā)出同時(shí)檢測(cè) 常見(jiàn)的 18 種高危型冊(cè)八冊(cè)￥16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和 82)的產(chǎn)品，然而，在運(yùn)些產(chǎn)品中，有的是針對(duì)每種高危型HPV設(shè)計(jì)一對(duì)型特異性引物和一條 型特異性探針，運(yùn)會(huì)急劇增加檢測(cè)成本，同時(shí)運(yùn)么多探針的存在也會(huì)顯著增加背景巧光信 號(hào);有的還是進(jìn)行多管檢測(cè)，運(yùn)會(huì)顯著增加樣品和檢測(cè)試劑的用量，增加檢測(cè)成本，且也不 能對(duì)HPV16和HPV18進(jìn)行分型；更有甚者，針對(duì)不同高危型HPV設(shè)計(jì)出的引物和/或探針局限 在同一個(gè)基因區(qū)域上，堿基序列差別太小，會(huì)導(dǎo)致交叉性的擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生假陽(yáng)性，不能準(zhǔn) 確地區(qū)分其具體型別。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)高危型HPV(尤其是常見(jiàn)的18 種高危型HPV，即冊(cè)￥16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82)的方 法、寡核巧酸和試劑盒，所述方法、寡核巧酸和試劑盒所設(shè)及的引物和探針是通過(guò)構(gòu)建高危 型HPV的進(jìn)化樹(shù)，基于運(yùn)些高危型HPV在進(jìn)化樹(shù)上的親緣性，讓一些高危型HPV共用上游或下 游引物和探針，在保證檢測(cè)準(zhǔn)確性、靈敏度和特異性的同時(shí)，顯著增加檢測(cè)通量，并極大地 降低檢測(cè)成本。
[0011] 本發(fā)明中的引物和/或探針的堿基序列若含有字母"Y"、"S"、"R"或，則表明該 引物和/或探針為簡(jiǎn)并引物或簡(jiǎn)并探針，其中Y代表C或T，S代表G或C，R代表A或G，M代表A或 C。
[0012] 本發(fā)明提供用于巧光PCR檢測(cè)高危型HPV的寡核巧酸，所述寡核巧酸包括：（1)用于 檢測(cè)HPV16的引物和探針，其堿基序列分別為SEQ ID NO: 1~3; (2)用于檢測(cè)HPV18的引物和 探針，其堿基序列分別為SEQ ID N0:4~6。
[0013] 進(jìn)一步地，所述寡核巧酸還包括(3)和(4)中的至少一種：（3)用于檢測(cè)HPV31的引 物和探針，其堿基序列分別為SEQ ID NO: 7、9和14; (4)用于檢測(cè)HPV45的引物和探針，其堿 基序列分別為沈Q ID NO: 15、16和19。
[0014] 進(jìn)一步地，所述寡核巧酸還包括(5)~（16)中的至少一種：（5)用于檢測(cè)HPV35的引 物和探針，其堿基序列分別為SEQ ID N0:8、9和14; (6)用于檢測(cè)HPV33的引物和探針，其堿 基序列分別為SEQ ID NO: 10、13和14; (7)用于檢測(cè)HPV52的引物和探針，其堿基序列分別為 SEQ ID NO: 11、13和14; (8)用于檢測(cè)HPV58的引物和探針，其堿基序列分別為SEQ ID NO: 12 ~14; (9)用于檢測(cè)HPV59的引物和探針，其堿基序列分別為SEQ ID NO: 17~19; (10)用于檢 測(cè)HPV39和HPV68的引物和探針，其堿基序列分別為SEQ ID ^:20~22;(11)用于檢測(cè)冊(cè)￥53 的引物和探針，其堿基序列分別為SEQ ID N0:23、24和28;(12)用于檢測(cè)冊(cè)￥56的引物和探 針，其堿基序列分別為SEQ ID NO: 25、26和28;(13)用于檢測(cè)HPV66的引物和探針，其堿基序 列分別為SEQ ID N0:25、27和28;(14)用于檢測(cè)冊(cè)￥26的引物和探針，其堿基序列分別為56〇 10^