專利名稱：單克隆抗體的拮抗活性的調(diào)節(jié)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體工程化領(lǐng)域，并且更特別地，涉及篩選抗體和/或調(diào)節(jié)抗體的激動(dòng)/拮抗活性的方法。更特別地，本發(fā)明涉及通過遺傳工程化調(diào)節(jié)單克隆抗體或其二價(jià)功能化片段或衍生物的拮抗活性的方法。本發(fā)明還涉及用于這種調(diào)節(jié)方法的多肽和所獲得的抗體。
背景技術(shù)：
術(shù)語“一種抗體”、“多種抗體”或“免疫球蛋白”以最寬意思互換使用，并且包括單克隆抗體(例如，全長或完整的單克隆抗體)、多克隆抗體、多價(jià)抗體或多特異性抗體(例如，雙特異性抗體，只要它們呈現(xiàn)出所需的生物活性)。更特別地，這樣的分子由糖蛋白組成，所述糖蛋白包含通過二硫鍵鏈間連接的至少兩個(gè)重(H)鏈和兩個(gè)輕(L)鏈。每個(gè)重鏈由重鏈可變區(qū)(或結(jié)構(gòu)域)(在此縮寫為HCVR 或VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域CHI、CH2和CH3組成。每個(gè)輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在此縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL組成。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分成超可變性區(qū)，稱為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)，穿插有具更保守的區(qū)域，稱為框架區(qū)(FR)。每個(gè)VH和VL由三個(gè)CDR和四個(gè)FR組成，以以下順序從氨基端排列至羧基端FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和典型補(bǔ)體系統(tǒng)的第一成分(Clq)。免疫球蛋白的重鏈可以分成三個(gè)功能區(qū)Fd區(qū)、鉸鏈區(qū)、Fc區(qū)(可結(jié)晶片段)，其通過柔性鉸鏈區(qū)來連接。Fd區(qū)包含VH和CHl結(jié)構(gòu)域，并且結(jié)合輕鏈，形成Fab-抗原結(jié)合片段。Fc片段負(fù)責(zé)免疫球蛋白效應(yīng)物功能，其包括，例如，補(bǔ)體固定和結(jié)合至效應(yīng)物細(xì)胞的同源Fc受體。在IgG、IgA和IgD免疫球蛋白類別中發(fā)現(xiàn)的鉸鏈區(qū)作為柔性間隔物，使Fab 部分在相對(duì)于Fc區(qū)的空間中自由移動(dòng)。與恒定區(qū)相反，鉸鏈結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上是多變的，在免疫球蛋白類別和亞類中的序列和長度都有變化。根據(jù)結(jié)晶研究，免疫球蛋白鉸鏈區(qū)可以在結(jié)構(gòu)和功能上進(jìn)一步細(xì)分成三個(gè)區(qū)上鉸鏈、核心和下鉸鏈(Shin等，Immunological Reviews 130:87,1992)。上鉸鏈包括從CHl 羧基端至限制運(yùn)動(dòng)的鉸鏈中第一個(gè)殘基的氨基酸，通常為兩個(gè)重鏈之間形成鏈間二硫鍵的第一個(gè)半胱氨酸殘基。上鉸鏈區(qū)的長度與抗體的片段柔性相關(guān)。核心鉸鏈區(qū)含有重鏈間二硫橋鍵。下鉸鏈區(qū)連接CH2結(jié)構(gòu)域的氨基端，并包括CH2結(jié)構(gòu)域中的殘基。人IgGl的核心鉸鏈區(qū)含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，其通過二硫鍵形成二聚化時(shí)，形成環(huán)八肽，認(rèn)為這作為樞軸，由此給予柔性。由免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽序列的結(jié)構(gòu)和柔性產(chǎn)生的構(gòu)象變化可能影響抗體Fc部分的效應(yīng)物功能。通常，對(duì)于鼠來源的單克隆抗體或其功能性片段的制備，可能參考特別在手冊(cè)“抗體，，中描述的技術(shù)(Harlow 禾口 Lane，Antibodies :A Laboratory Manual (抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY,pp. 726,1988)或 Kohler和Milstein所述的從雜交瘤的制備技術(shù)(Nature, 256 =495-497,1975) 然后，例如，單克隆抗體可以在親和性柱上純化，在柱上之前已經(jīng)固定了目標(biāo)受體或其含有所述單克隆抗體特異性識(shí)別的表位的片段之一。更特別地，所述單克隆抗體可以通過蛋白A和/或G的色譜來純化，接著進(jìn)行或不進(jìn)行針對(duì)消除殘余蛋白污染物以及DNA和LPS的離子交換色譜，本質(zhì)上接著進(jìn)行或不進(jìn)行kpharose凝膠上的排阻色譜，以消除由于二聚體或其他多聚體的存在引起的潛在聚集物。在甚至更優(yōu)選的方式中，同時(shí)或連續(xù)使用這些技術(shù)的全部。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的抗體的功能性片段，特別用來表示抗體片段，如Fv、SCFv(SC表示單鏈)、Fab、F(ab，)2、Fab\ scFv-Fc片段或二抗，或其半衰期已經(jīng)通過化學(xué)修飾提高的任何片段，化學(xué)修飾如添加聚(烷撐)甘醇，如聚(乙烯)甘醇(“PEG化”)(稱為Fv-PEG、 scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab，)2_PEG 或 Fab，-PEG 的 PEG 化片段)(“PEG” 表示聚(乙烯)甘醇)，或通過將具有原始抗體的至少一個(gè)特征性CDR的所述片段摻入脂質(zhì)體中。優(yōu)選，這些功能性片段將是？^80 1 313、？(313，)2、F(ab，)、scFv-Fc型或二抗的片段，其通常具有與產(chǎn)生其的抗體相同的結(jié)合特異性。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的抗體片段可以通過如酶消化的方法，如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶，和/或通過化學(xué)還原的二硫橋鍵的分裂， 從如上所述的抗體獲得。在另一種方式中，本發(fā)明中包含的抗體片段可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員同樣公知的遺傳重組技術(shù)來獲得，或者通過肽合成獲得，例如通過自動(dòng)化肽合成儀，如 Applera等公司供應(yīng)的那些。如在此所用的術(shù)語“拮抗劑”指的是能夠抑制目標(biāo)分子(如胞外或跨膜受體)的一種或多種生物活性的分子。拮抗劑可以通過干擾受體與配體的結(jié)合和反之，通過降低受體磷酸化和/或通過使已經(jīng)由配體激活的細(xì)胞喪失能力或殺滅這些細(xì)胞來起作用。拮抗劑可以完全阻止受體-配體相互作用或可以本質(zhì)上通過競爭、構(gòu)象變化、脫落或下調(diào)降低這種相互作用。通過拮抗劑產(chǎn)生的所有這樣的干擾點(diǎn)將認(rèn)為是本發(fā)明目的的等價(jià)物。如在此所用的術(shù)語“激動(dòng)劑”指的是能夠激活目標(biāo)分子的一種或多種生物活性的任何化合物，包括蛋白、多肽、肽、抗體、抗體片段、偶聯(lián)物、大分子、小分子。在治療抗體的研究中，常常期望具有可能作為拮抗劑的抗體。拮抗劑抗體的典型實(shí)例是赫塞汀、帕妥珠單抗、愛必妥、抗-VEGFR或抗-IGF-IR抗體。作為特定實(shí)例，可以提及由Genentech產(chǎn)生的抗-c-Met 5D5抗體[W096/38557]， 其在各種模型中單獨(dú)加入時(shí)，表現(xiàn)為有效的激動(dòng)劑。為了解決這個(gè)技術(shù)問題，該抗體必須工程化成Fab片段或單價(jià)抗體(一臂5M)，以具有拮抗活性。因此，這樣的抗體不能認(rèn)為是抗體，而是片段，并且沒有呈現(xiàn)出由于“全抗體”形式產(chǎn)生的所有優(yōu)點(diǎn)(無效應(yīng)物功能、降低的清除和半衰期[比傳統(tǒng)二價(jià)抗體快2倍，如20thE0RTC-NCI-AACR學(xué)術(shù)討論會(huì)，Geneva, 2008 年10月21-24日，Poster411中所述的])。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到效應(yīng)物功能包括，例如，Clq結(jié)合；補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體-依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)；嗜菌作用；和細(xì)胞表面受體 (例如，B細(xì)胞受體；BCR)的下調(diào)和通過結(jié)合清道夫受體結(jié)合配體(Fcfoi)延長半衰期，如， 例如，1988年4月14日授權(quán)的U. S.專利No. 5，739，277中所述的。
本發(fā)明的一個(gè)創(chuàng)造性方面是解決這樣的技術(shù)問題，即，提高抗體的拮抗活性，同時(shí)保持“全二價(jià)”形式。在此必須提及本發(fā)明可以用于調(diào)節(jié)人抗體的激動(dòng)/拮抗活性，人抗體是通過如下方法獲得的通過免疫“人小鼠”獲得(遺傳修飾的產(chǎn)生人免疫球蛋白的小鼠)或使用噬菌體展示技術(shù)從選定的ScFV、Fab或任何其他等價(jià)片段構(gòu)建完整的抗體。在鼠抗體的嵌合和/或人源化的過程中可能會(huì)遇到另一個(gè)傳統(tǒng)的技術(shù)問題。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，如果鼠抗體的嵌合和/或人源化過程在理論上是非常容易的，但不是這么容易控制這樣的鼠抗體的嵌合和/或人源化，以至不失去全部或部分的初始特性。嵌合或人源化抗體可能失去一部分的ADCC、CDC、拮抗/激動(dòng)、結(jié)合、(TBC)…活性。更特別地，本發(fā)明涉及嵌合和/或人源化處理后，鼠抗體的激動(dòng)/拮抗活性的改變。作為特定的實(shí)例，在人IgGl形式嵌合時(shí)，表現(xiàn)為有效拮抗鼠抗體的一組抗-cMet 抗體(下文中描述為224G11、2274H1和11E1)變成部分激動(dòng)劑。這種從有效拮抗劑至部分激動(dòng)劑的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致在異種移植模型中體內(nèi)活性的完全丟失。本發(fā)明打算解決這些問題，并且更特別地涉及提高針對(duì)特定目標(biāo)分子的單克隆抗體或其二價(jià)功能性片段或衍生物的拮抗活性的方法，所述抗體能夠抑制所述目標(biāo)分子的一種或多種生物活性，其中所述方法包括鉸鏈區(qū)重新構(gòu)建的階段，該階段由通過至少一個(gè)氨基酸的刪除、添加或置換來修飾所述鉸鏈區(qū)的氨基酸序列組成。清楚表述“提高拮抗活性”必須以其最寬的意思來解釋，即，按照所需的結(jié)果。機(jī)械地，可以通過抗體的內(nèi)在拮抗活性的提高和/或抗體的內(nèi)在激動(dòng)活性的降低來獲得這樣的結(jié)果。更特別地，定量藥理學(xué)中術(shù)語的基礎(chǔ)定義是基于國際藥理學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPHAR)對(duì)受體命名給出的最新推薦(參見，Neubig等，2003)。術(shù)語“激動(dòng)劑”表示結(jié)合受體并改變受體狀態(tài)而導(dǎo)致刺激或提高的生物應(yīng)答的配體(任何類型的分子)。激動(dòng)劑可以作為完全激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑-完全激動(dòng)劑當(dāng)激動(dòng)劑誘導(dǎo)的受體刺激到達(dá)系統(tǒng)的最大應(yīng)答能力時(shí)，那么將產(chǎn)生系統(tǒng)最大應(yīng)答并是該系統(tǒng)中的完全激動(dòng)劑。幾種激動(dòng)劑可以引發(fā)相同的最大應(yīng)答，它們?nèi)渴窃搶?shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的完全激動(dòng)劑。-部分激動(dòng)劑在給定的組織中，在特定的條件下，不能與完全激動(dòng)劑通過相同系統(tǒng)中的相同受體作用引發(fā)相同大的效果的分子(即使在高濃度下應(yīng)用，使得所有受體應(yīng)當(dāng)被占據(jù)時(shí))。部分激動(dòng)劑通常還是部分拮抗劑，因?yàn)樵谕耆?dòng)劑的共同存在下，它們使所述完全激動(dòng)劑的最大應(yīng)答降至其自身最大應(yīng)答。這種完全vs.部分激動(dòng)劑的指定是系統(tǒng)依賴性的，并且對(duì)于一種系統(tǒng)或測量的完全激動(dòng)劑在另一種系統(tǒng)或測量中可能是部分激動(dòng)劑。術(shù)語“拮抗劑”表示降低另一種藥物(通常是激動(dòng)劑)的作用的分子。許多拮抗劑作用于和激動(dòng)劑相同的受體大分子。-在拮抗劑和激動(dòng)劑共同存在下的系統(tǒng)的應(yīng)答對(duì)應(yīng)于系統(tǒng)的基礎(chǔ)(沒有任何配體)活性的情況中，拮抗效率可以是完全拮抗。-由拮抗劑和激動(dòng)劑共同存在引發(fā)的最大抑制高于系統(tǒng)的基礎(chǔ)活性時(shí)(即使以高濃度應(yīng)用，使得所有受體應(yīng)當(dāng)被拮抗劑占據(jù)時(shí))，拮抗劑可以作為部分拮抗劑。
-當(dāng)激動(dòng)劑和拮抗劑的結(jié)合互相排斥時(shí)，拮抗是競爭性的。這可能是因?yàn)榧?dòng)劑和拮抗劑競爭相同的結(jié)合位點(diǎn)或結(jié)合重疊的鄰近位點(diǎn)。第三個(gè)可能性是涉及不同的位點(diǎn)，但它們以激動(dòng)劑和拮抗劑分子不能同時(shí)被結(jié)合的方式影響受體大分子。-當(dāng)激動(dòng)劑和拮抗劑可以同時(shí)結(jié)合受體時(shí)，觀察到非競爭性拮抗；拮抗劑結(jié)合降低或阻止了激動(dòng)劑的作用，對(duì)激動(dòng)劑的結(jié)合具有或不具有任何作用。傳統(tǒng)上可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來進(jìn)行刪除、添加或置換。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用幾種方法來產(chǎn)生給定DNA序列中的添加、刪除或插入。 可以提及但無限制，用胰腺DNA酶I部分消化DNA，用限制酶部分消化DNA，基于連接物的插入突變體，使用BAL31核酶、DNA酶I或核酸外切酶III的刪除突變體的嵌套集合。這些方法在實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中有廣泛描述，如Molecular Cloning, A laboratory manual (分子克隆， 實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis)。幾種基于PCR的方法也可以用來產(chǎn)生DNA 分子中的刪除、插入或定點(diǎn)誘變，如重疊延伸PCR(Wurch等，1998)，但不限于這一種。為了進(jìn)行定點(diǎn)誘變，可以使用幾種其他技術(shù)，例如，但不限于這幾種，可以提及基于單或雙引物方法的基于寡核苷酸的誘變，基于尿嘧啶結(jié)合的Kunkel方法(Kimkel，1985)。這些方法在實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中有廣泛描述，如Molecular Cloning, A laboratory manual (分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis)。作為添加的非限制性實(shí)例，可以提及鉸鏈區(qū)中或鄰近的脯氨酸添加。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述修飾選自i)所述鉸鏈區(qū)氨基酸序列的至少一個(gè)氨基酸的刪除；和/或ii)將至少一個(gè)二硫橋鍵添加至所述鉸鏈區(qū)中。為了闡明本發(fā)明，將首先詳述第一個(gè)方面(i)，第二個(gè)方面(ii)將在之后詳述。必須理解這個(gè)順序只是由于本發(fā)明的書寫，并且如下文中顯而易見的，這兩個(gè)方面是同等重要的。在特定的實(shí)施方案中，修飾鉸鏈區(qū)氨基酸序列的方式將由所述鉸鏈區(qū)氨基酸序列的至多2、3或4個(gè)氨基酸刪除組成。本發(fā)明的特定方面在于所述單克隆抗體是二價(jià)抗體。實(shí)際上，如以下所看到的，可以通過修飾所述抗體的結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)抗體的激動(dòng)/拮抗活性。第一次，發(fā)明人報(bào)道了調(diào)節(jié)這種激動(dòng)/拮抗活性同時(shí)保持抗體二價(jià)形式的獨(dú)創(chuàng)方式，目標(biāo)在于良好特性(如長的半衰期或效應(yīng)物功能)的保持。在此還可以提及，如果現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報(bào)道了為了提高效應(yīng)物功能的單克隆抗體鉸鏈區(qū)的修飾，但相反從未報(bào)道過鉸鏈區(qū)中這樣的修飾的興趣在于單克隆抗體的激動(dòng)/拮抗活性調(diào)節(jié)。這明顯是本發(fā)明的主題，這對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)是新的和創(chuàng)造性的。作為根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)方面，單克隆抗體是嵌合抗體?！扒逗稀笨贵w用來表示含有源自給定物種抗體的天然可變(輕鏈和重鏈)區(qū)并結(jié)合與所述給定物種(例如，鼠、馬、兔子、狗、牛、雞等)異源物種的抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)的抗體。可以通過使用遺傳重組技術(shù)來制備根據(jù)本發(fā)明的嵌合類型的抗體或其片段。例如，可以通過克隆含有啟動(dòng)子和編碼非人(尤其是鼠)可變區(qū)的序列、根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體和編碼人抗體恒定區(qū)的序列的重組DNA來生產(chǎn)嵌合抗體。通過這樣的重組基因編碼的本發(fā)明的嵌合抗體將是，例如，鼠-人嵌合體，通過源自鼠DNA的可變區(qū)來決定該抗體的特異性，并且通過源自人DNA的恒定區(qū)來決定其同種型。對(duì)于嵌合抗體制備的方法，例如，可以參考文獻(xiàn) Verhoeyn 等(BioEssays，8 :74，1988) ,Morrison 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :6851-6855,1984)或 US 專利 No. 4，816，567。作為根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)方面，單克隆抗體是人源化抗體。“人源化抗體”用來表示其含有源自非人來源抗體的CDR區(qū)的抗體，抗體分子的其他部分源自一個(gè)(或幾個(gè))人抗體或種系序列。此外，一些骨架(稱為FR)片段的殘基可以進(jìn)行修飾，以保持結(jié)合親和性(Jones等，Nature, 321 =522-525,1986 ；Verhoeyen等， Science, 239 :1534-1536,1988 ；Riechmann 等，Nature，332 :323_327，1988)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)(如，例如，文獻(xiàn)Singer等，J. Immun. 150 2844-2857, 1992 ；Mountain 等，Biotechnol. Genet. Eng. Rev. ，10 :1-142, 1992 ； ■ Bebbington等，Bio/Technology, 10 169-175，1992中所述的那些)，來制備根據(jù)本發(fā)明的人源化抗體或其片段。其他人源化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如，Protein Design Lab (PDL)在專利申請(qǐng) EP0451216、EP0682040、EP0939127、EP0566647 或 US5，530，101，US6, 180，370， US5，585，089 *US5，693，761中所述的“⑶R嫁接”方法。還可以提及以下專利申請(qǐng) US5, 639，641 ；US6, 054，297 ；US5,886，152 和 US5, 877，293。作為根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)方面，單克隆抗體是人抗體。術(shù)語“人抗體”包括具有源自人免疫球蛋白序列的一個(gè)或多個(gè)可變和恒定區(qū)的所有抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所有可變和恒定結(jié)構(gòu)域(或區(qū))源自人免疫球蛋白序列(完全人抗體)。換句話說，包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)(如果存在) 的任何抗體，即，其具有對(duì)應(yīng)于通過人產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列和/或已經(jīng)使用本發(fā)明技術(shù)人員已知的用于制備人抗體的任何技術(shù)制得的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過雜交瘤產(chǎn)生人單克隆抗體，該雜交瘤包括獲自轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物(例如，轉(zhuǎn)基因鼠)的B細(xì)胞，該轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物具有包含融合永生細(xì)胞的人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。作為這種轉(zhuǎn)基因鼠的實(shí)例，可以提及XEN0M0USE ，其是包含人免疫球蛋白基因座大片段并缺乏鼠抗體生成的工程化鼠株系(Green等，1994，Nature Genetics，7 13-21)。 XEN0M0USE 產(chǎn)生全人抗體的成人樣人庫(r印ertoire)，并且產(chǎn)生抗原特異性人單克隆抗體。第二代 XEN0M0USE 含有大約 80% 的人抗體庫(Green&Jakobovits，1998，J. Exp. Med.， 188 :483-495)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他技術(shù)，如噬菌體展示技術(shù)，也可以用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的人抗體。根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于任何類型的包含鉸鏈區(qū)的免疫球蛋白，S卩，IgA、IgD和 IgG0作為實(shí)例，對(duì)于IgA同種型，IgAl的鉸鏈區(qū)包含氨基酸序列 PSTPPTPSPSTPPTPSPS(SEQ ID No. 8)，而 IgA2 的鉸鏈區(qū)包含氨基酸序列 PPPPP(SEQ ID No. 9)。在相似的方式中，IgD的鉸鏈區(qū)包含氨基酸序列SPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP(SEQ ID No. 10)。作為本發(fā)明的特定實(shí)施方案，優(yōu)選使用IgG，包括，例如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。對(duì)應(yīng)于IgG鉸鏈區(qū)的不同同種型的各自的氨基酸序列為對(duì)于IgGl，PKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID No. 11)，對(duì)于IgG2, RKCCVECPPCP (SEQ ID No. 7)，對(duì)于IgG3，LKTPLFTGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCP RCP(SEQ ID No. 12)，和對(duì)于IgG4，SKYGPPCPSCP (SEQ ID No. 13)。再更特別地，優(yōu)選使用IgGl。實(shí)際上，在治療抗體的領(lǐng)域中，更特別地，在癌癥的治療中，優(yōu)選產(chǎn)生IgGl，以獲得與特異性結(jié)合靶向抗原相關(guān)的功能以外的效應(yīng)物功能，如 ADCC 禾口 CDC0本發(fā)明方法的特征在于所述單克隆抗體是IgGl。在本發(fā)明的意思內(nèi)，“目標(biāo)分子”涉及單克隆抗體能夠特異性結(jié)合或調(diào)節(jié)活性的任何分子。通常，將這樣的目標(biāo)分子稱為“抗原”。作為單克隆抗體靶向的目標(biāo)分子的非限制性實(shí)例可以提及可溶性配體、受體 (如，跨膜受體)、跨膜腫瘤標(biāo)記等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述目標(biāo)分子是跨膜受體。表述“跨膜受體”指的是跨過細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜的蛋白，該蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域具有結(jié)合配體的能力，而胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有在配體結(jié)合時(shí)可以改變(提高或降低)的活性(如，蛋白激酶)。換句話說，跨膜受體是完整的膜蛋白，典型地其存在于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)，并在其中運(yùn)作，但也在一些亞細(xì)胞區(qū)室和細(xì)胞器的膜中。在膜一側(cè)結(jié)合信號(hào)分子或有時(shí)結(jié)合一對(duì)這樣的分子時(shí)，跨膜受體啟動(dòng)另一側(cè)的應(yīng)答。以這種方式，它們?cè)诩?xì)胞交流和信號(hào)傳導(dǎo)中起著獨(dú)特且重要的作用。許多跨膜受體由兩個(gè)或多個(gè)蛋白亞基組成，這些亞基共同運(yùn)行，并且在配體結(jié)合、 脫離或在其“激活”循環(huán)的另一個(gè)階段時(shí)，可能分離。通?；谒鼈兊姆肿咏Y(jié)構(gòu)來歸類，或因?yàn)槌艘恍┦荏w以外對(duì)于所有受體結(jié)構(gòu)的任何詳細(xì)內(nèi)容是未知的，基于它們的假設(shè)(并且有時(shí)候是實(shí)驗(yàn)證實(shí)的)膜拓?fù)鋵W(xué)來歸類。預(yù)測最簡單的多肽鏈只穿過脂雙層一次，而其他穿過多達(dá)七次(稱為G-蛋白偶聯(lián)受體或GPCIO或更多次。與任何完整的膜蛋白相似，跨膜受體可以細(xì)分成三個(gè)部分或結(jié)構(gòu)域，胞外結(jié)構(gòu)域， 跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域是受體伸出細(xì)胞或細(xì)胞器外側(cè)膜的一部分。如果受體的多肽鏈穿過雙層幾次，外部結(jié)構(gòu)域可以包含幾個(gè)伸出膜外的“環(huán)”根據(jù)定義，受體的主要功能是識(shí)別并應(yīng)答特定的配體，例如，神經(jīng)遞質(zhì)或激素(盡管特定的受體也應(yīng)答跨膜勢能的變化)，并且在許多受體中，這些配體結(jié)合胞外結(jié)構(gòu)域。在存在結(jié)構(gòu)證據(jù)的大部分受體中，跨膜α螺旋構(gòu)成大部分的跨膜結(jié)構(gòu)域。在特定的受體中，如尼古丁乙酰膽堿受體中，跨膜結(jié)構(gòu)域形成通過膜的蛋白質(zhì)線紋的孔，或離子通道。通過結(jié)合合適的配體激活胞外結(jié)構(gòu)域時(shí)，孔變成離子可接近的，其隨后通過。在其他受體中，認(rèn)為跨膜結(jié)構(gòu)域在結(jié)合時(shí)經(jīng)歷構(gòu)象變化，這在胞內(nèi)發(fā)揮出作用。在一些受體中，如7ΤΜ 超家族的成員，跨膜結(jié)構(gòu)域可以含有配體結(jié)合袋。
受體的胞內(nèi)(或細(xì)胞質(zhì))結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞或細(xì)胞器的內(nèi)部相互作用，轉(zhuǎn)播信號(hào)。對(duì)于這種相互作用基本上存在兩種不同途徑，a)通過與效應(yīng)物蛋白的特定蛋白-蛋白-相互作用的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域交流，其隨后將信號(hào)沿著信號(hào)鏈傳送至其終點(diǎn)和b)使用酶相連的受體， 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有酶活性。通常，這是酪氨酸激酶活性。酶活性也可以位于與胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相關(guān)的酶上。對(duì)于細(xì)胞調(diào)節(jié)跨膜受體的活性，存在幾種方式。大部分通過胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域來工作。最重要的方式是磷酸化和內(nèi)在化(參見遍在蛋白)或第二信使級(jí)聯(lián)如cAMP、IP、Ca2+或cGMP 的激活。具有本發(fā)明中所述修飾的抗體還可以靶向顯示出酶活性的所有膜蛋白。作為實(shí)例，可以提及，但不限于，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族，“解整聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域蛋白酶”(ADAM)家族、腺苷酸環(huán)化酶、……具有本發(fā)明中所述修飾的抗體還可以靶向作用于離子通道、孔和轉(zhuǎn)運(yùn)子的所有膜蛋白。作為實(shí)例，可以提及，但不限于，鈉通道家族、鉀通道家族、尼古丁乙酰膽堿受體家族、 sigma受體、一元胺轉(zhuǎn)運(yùn)子家族。更寬泛地，通過抗體處理還可以靶向?qū)τ诮o定疾病鑒定為特異性標(biāo)記的所有膜蛋白，該抗體也可以通過本發(fā)明中所述的修飾來改進(jìn)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述跨膜受體選自酪氨酸激酶受體、四跨膜蛋白和 GPCR0在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述跨膜受體是酪氨酸激酶受體，其優(yōu)選選自IGF-1R、 c-Met、RON、AxU VEGF, VEGFR、Her_2neu、ErbB 家族的同型二聚體和異型二聚體，等。在本申請(qǐng)中，更特別地，在以下的說明書中，將根據(jù)IMGT來限定序列。已經(jīng)限定了 IMGT獨(dú)特的編號(hào)來比較可變結(jié)構(gòu)域，無論哪一種抗原受體、鏈類型或物種[Lefranc M. -P.， Immunology Today 18,509(1997) ；Lefranc Μ.-P.，The Immunologist，7，132-136(1999)； Lefranc, Μ.-P. , Pommie, C, Ruiz, Μ. , Giudicelli, V. , Foulquier, Ε. , Truong, L., Thouvenin-Contet, V.禾口 Lefranc，Dev. Comp. Immunol, 27, 55—77 (2003)]。在 IMGT 獨(dú)特的編號(hào)中，保守氨基酸通常具有相同的位置，例如，半胱氨酸23 (第一 -CYQ、色氨酸41 (保守的-TRP)、疏水氨基酸89、半胱氨酸104(第二 -CYQ、苯丙氨酸或色氨酸118 (J-PHE或 J-TRP)。IMGT獨(dú)特的編號(hào)提供了框架區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)化劃界(FR1-IMGT 位置1至^，F(xiàn)R2_IMGT 39至55，F(xiàn)R3-IMGT 66至104和FR4-IMGT :118至128)和互補(bǔ)決定區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)化劃界 CDR1-IMGT 27 至 38，CDR2-IMGT 56 至 65 和 CDR3-IMGT :105 至 117。因?yàn)槿笨诒硎疚凑紦?jù)的位置，⑶R-IMGT長度(顯示于括號(hào)中并由點(diǎn)分開，例如，[8.8.13])成為關(guān)鍵信息。將IMGT獨(dú)特的編號(hào)用于2D繪圖表示中，稱為IMGT Colliers de Perles [Ruiz, Μ.和 Lefranc,Μ. -P. ,Immunogenetics,53,857-883(2002) ；Kaas,Q.禾口 Lefranc,Μ· _Ρ· ,Current Bioinformatics，2，21-3(K2007)]，和用于 IMGT/3D 結(jié)構(gòu)-DB 的 3D 結(jié)構(gòu)中[Kaas，Q. ,Ruiz, Μ.禾口 Lefranc，Μ. -P.，T cell receptor and MHC structural data(T 細(xì)胞受體禾口 MHC 結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù))，Nucl. Acids. Res.，32，D208-D210 (2004)]。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，將根據(jù)IMGT系統(tǒng)所述的本發(fā)明變換成任何其他編號(hào)系統(tǒng) (例如，Kabat編號(hào)系統(tǒng))是顯而易見的。對(duì)于所有物種的所有IG和TR V-REGION的IMTG獨(dú)特編碼依賴于可變區(qū)結(jié)構(gòu)的高保守性。該編號(hào)，在比對(duì)超過5000個(gè)序列后設(shè)定，考慮并結(jié)合框架(FR)和互補(bǔ)決定區(qū) (CDR)的限定，來自X-射線衍射研究的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和超變環(huán)的表征。已經(jīng)限定了 FR-IMGT 和⑶R-IMGT區(qū)的邊界。相似地，IMGT獨(dú)特的編號(hào)已經(jīng)用于C-D0MAIN，并且使得可以精確地界定Ig-樣結(jié)構(gòu)域。C-DOMAIN對(duì)應(yīng)于完整的C-REGI0N、大部分C-REGION或僅僅一部分 C-REGI0N，這取決于免疫球蛋白(IG)類型。對(duì)于C-D0MAIN(IG和TR)的IMGT編號(hào)衍生為對(duì)于V-D0MAIN的IMGT獨(dú)特編號(hào)，從對(duì)于V-REGION的最初IMGT獨(dú)特編號(hào)，直至位置104。因此，可以容易地比較C-DOMAIN和 V-DOMAIN之間的氨基酸位置。為了精確地定位鉸鏈區(qū)，將C-DOMAIN的IMGT編號(hào)用于精確地定位CHl和CH2結(jié)構(gòu)域。鉸鏈區(qū)包括IMGT-CHl的最后一個(gè)殘基和IMGT-CH2的第一個(gè)殘基之間的所有氨基酸殘基。涵蓋相同鉸鏈區(qū)的所有其他免疫球蛋白編號(hào)方案，如Kabat或A. Honegger，包括在本發(fā)明中。作為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例，基于如上所述的IMGT編號(hào)系統(tǒng)，IgGl鉸鏈區(qū)的氨基酸序列包含殘基Hl至H14，片段Hl至H9對(duì)應(yīng)于上鉸鏈，片段HlO至H14對(duì)應(yīng)于核心鉸鏈。更特別地，人IgGl鉸鏈區(qū)包含氨基酸序列PKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID No. 11)，鼠IgGl鉸鏈區(qū)包含氨基酸序歹丨J PRDCGCKPCICT(SEQ ID No. 14)。表 權(quán)利要求
1.一種提高針對(duì)特定目標(biāo)分子的單克隆抗體、或其二價(jià)功能片段或衍生物的拮抗活性的方法，所述抗體能夠抑制所述目標(biāo)分子的一種或多種生物活性，其中所述方法包括鉸鏈區(qū)重新構(gòu)建的階段，該階段由通過至少一個(gè)氨基酸的刪除、添加或置換來修飾所述鉸鏈區(qū)的氨基酸序列組成。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中所述修飾選自i)所述鉸鏈區(qū)氨基酸序列的至少一個(gè)氨基酸的刪除；和/或 )將至少一個(gè)二硫橋鍵添加至所述鉸鏈區(qū)中。
3.如權(quán)利要求2的方法，其中修飾i)由所述鉸鏈區(qū)氨基酸序列的至多2、3或4個(gè)氨基酸的刪除組成。
4.如權(quán)利要求1至3之一的方法，其中所述單克隆抗體是二價(jià)抗體。
5.如權(quán)利要求1至3之一的方法，其中所述單克隆抗體是嵌合抗體。
6.如權(quán)利要求1至3之一的方法，其中所述單克隆抗體是人源化抗體。
7.如權(quán)利要求1至3之一的方法，其中所述單克隆抗體是人抗體。
8.如權(quán)利要求1至7之一的方法，其中所述單克隆抗體是IgGl。
9.如權(quán)利要求1至8之一的方法，其中所述目標(biāo)分子是跨膜受體。
10.如權(quán)利要求9的方法，其中所述跨膜受體選自酪氨酸激酶受體、四跨膜蛋白和 GPCR0
11.如權(quán)利要求1至10之一的方法，其中所述修飾由選自位置!11、!12、!13、!15、!16、!17、 H8、H9、H1UH12或H14氨基酸的至少一個(gè)氨基酸的刪除組成。
12.如權(quán)利要求1至10之一的方法，其中所述修飾由位于所述鉸鏈區(qū)氨基酸序列的位置Hl和H9之間的“上鉸鏈”區(qū)中的至少一個(gè)氨基酸的刪除組成。
13.如權(quán)利要求1至12之一的方法，其中所述修飾由優(yōu)選位于位置H4的“上鉸鏈”區(qū)中的至少一個(gè)半胱氨酸的刪除組成。
14.如權(quán)利要求1至12之一的方法，其中所述修飾由向“上鉸鏈”區(qū)中引入至少一個(gè)半胱氨酸組成。
15.如權(quán)利要求14的方法，其中所述修飾由“上鉸鏈”區(qū)中位置H7的蘇氨酸由半胱氨酸的置換組成。
16.如權(quán)利要求14的方法，其中所述修飾由“上鉸鏈”區(qū)中位置H6的賴氨酸由半胱氨酸的置換組成。
17.如權(quán)利要求14的方法，其中所述修飾由“上鉸鏈”區(qū)中位置Hl的脯氨酸由半胱氨酸的置換組成。
18.如權(quán)利要求14的方法，其中所述修飾由“上鉸鏈”區(qū)中位置H2的賴氨酸由半胱氨酸的置換組成。
19.如權(quán)利要求14的方法，其中所述修飾由“上鉸鏈”區(qū)中位置H3的絲氨酸由半胱氨酸的置換組成。
20.如權(quán)利要求14的方法，其中所述修飾由“上鉸鏈”區(qū)中位置H5的天冬氨酸由半胱氨酸的置換組成。
21.如權(quán)利要求14的方法，其中所述修飾由“上鉸鏈”區(qū)中位置H8的組氨酸由半胱氨酸的置換組成。
22.如權(quán)利要求14的方法，其中所述修飾由“上鉸鏈”區(qū)中位置H9的蘇氨酸由半胱氨酸的置換組成。
23.如權(quán)利要求1至10的方法，其中希望提高其拮抗活性的所述單克隆抗體是IgGl 時(shí)，所述修飾由IgGl鉸鏈區(qū)的氨基酸Hl至H14由IgG2鉸鏈區(qū)的氨基酸Hl至H14替代組成。
24.一種篩選針對(duì)特定目標(biāo)分子的拮抗劑單克隆抗體、或其二價(jià)功能性片段或衍生物的方法，所述抗體能夠抑制所述目標(biāo)分子的一種或多種生物活性，其中所述方法包括步驟(a)選擇具有所述目標(biāo)分子的所述一種或多種生物活性的抑制的初始水平的初始抗體，(b)通過權(quán)利要求1至23之一的方法修飾所述初始抗體鉸鏈區(qū)的氨基酸序列，(c)評(píng)價(jià)步驟(b)的修飾抗體抑制所述目標(biāo)分子的所述一種或多種生物活性的能力，禾口(d)選擇作為陽性結(jié)果的步驟(c)的抗體，其具有高于所述抑制初始水平的所述目標(biāo)分子的所述一種或多種生物活性的抑制水平。
25.一種通過權(quán)利要求1至M之一的方法獲得的針對(duì)特定目標(biāo)分子的單克隆抗體，或其二價(jià)功能性片段或衍生物，其特征在于包含選自以下的鉸鏈區(qū)氨基酸序列SEQ ID No. 1(PRDCGCKPCICT), SEQ ID No. 2(PKSCGCKPCICT)，SEQ ID No. 3 (PKSCGCKPCICP)，SEQ ID No. 4(PRDCGCKPCPPCP)，SEQ ID No. 5(PRDCGCHTCPPCP)，SEQ ID No. 6(PKSCDCHCPPCP)，SEQ ID No. 7(RKCCVECPPCP)，SEQ ID No. 22(CKSCDKTHTCPPCP)， SEQ ID No. 23 (PCSCDKTHTCPPCP) , SEQ ID No. 24 (PKCCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 25 (PKSCCKTHTCPPCP) , SEQ ID No. 26 (PKSCDCTHTCPPCP) SEQ ID No. 27 (PKSCDKCHTCPPCP) , SEQ ID No· 28 (PKSCDKTCTCPPCP)， SEQ ID No. 29 (PKSCDKTHCCPPCP) , SEQ ID No. 30 (PKSCDKTHTCCPCP), SEQ ID No.31 (PKSCDKTHTCPCCP), SEQ ID No.32(PKSCDKTHTCPPCC), SEQ ID No. 33(PSCDKTHTCPPCP)，SEQ ID N ο. 34(PKSCDTHTCPPCP)，SEQ ID No. 35 (PKSCDKTHCPPCP)， SEQ ID No. 36 (KCDKTHTCPPCP) , SEQ ID No. 37 (PSCKTHTCPPCP) , SEQ ID No.38 (PKSCDTHCPPCP)，SEQ ID No. 39(PKSCTHTCPPCP)，SEQ ID No. 40(PKSCDKTTCPCP)， SEQ ID No.41(PKSCDKTHCPPC), SEQ ID No.42(PKSCDCHTCPPCP), SEQ ID No. 43(PKSCDCTHCPPCP)，SEQ ID No. 44(PCSCKHTCPPCP)，SEQ ID No. 45(PSCCTHTCPPCP)，SEQ ID No. 46(PSCDKHCCPPCP)，SEQ ID No. 47(PKSTHTCPPCP)，SEQ ID No. 48(PKSCTCPPCP)或 SEQ ID No. 49(PKSCDKCVECPPCP)。
26.一種單克隆抗體，其特征在于包含選自以下的氨基酸序列SEQ ID No.1(PRDCGCKPCICT), SEQ ID No. 2(PKSCGCKPCICT), SEQ ID No. 3(PKSCGCKPCICP), SEQ ID No. 4 (PRDCGCKPCPPCP), SEQ ID No. 5 (PRDCGCHTCPPCP) , SEQ ID No. 6(PKSCDCHCPPCP)，SEQ ID No. 7(RKCCVECPPCP)，SEQ ID No. 22(CKSCDKTHTCPPCP)， SEQ ID No. 23 (PCSCDKTHTCPPCP) , SEQ ID No. 24 (PKCCDKTHTCPPCP), SEQ ID No. 25 (PKSCCKTHTCPPCP) , SEQ ID No. 26 (PKSCDCTHTCPPCP) SEQ ID No. 27 (PKSCDKCHTCPPCP) , SEQ ID No· 28 (PKSCDKTCTCPPCP)，SEQ ID No. 29 (PKSCDKTHCCPPCP) , SEQ ID No· 30 (PKSCDKTHTCCPCP)， SEQ ID No. 31 (PKSCDKTHTCPCCP) , SEQ ID No. 32 (PKSCDKTHTCPPCC) , SEQ ID No.33 (PSCDKTHTCPPCP)，SEQ ID No. 34(PKSCDTHTCPPCP)，SEQ ID No.35 (PKSCDKTHCPPCP)， SEQ ID No. 36 (KCDKTHTCPPCP) , SEQ ID No. 37 (PSCKTHTCPPCP) , SEQ ID No.38 (PKSCDTHCPPCP)，SEQ ID No. 39(PKSCTHTCPPCP)，SEQ ID No. 40(PKSCDKTTCPCP)， SEQ ID No.41 (PKSCDKTHCPPC), SEQ ID No. 42 (PKSCDCHTCPPCP), SEQ ID No. 43(PKSCDCTHCPPCP)，SEQ ID No. 44(PCSCKHTCPPCP)，SEQ ID No. 45(PSCCTHTCPPCP)，SEQ ID No. 46(PSCDKHCCPPCP)，SEQ ID No. 47(PKSTHTCPPCP)，SEQ ID No. 48(PKSCTCPPCP)或 SEQ ID No. 49(PKSCDKCVECPPCP)。
27.如權(quán)利要求25和沈之一的單克隆抗體，其中所述抗體是人抗體。
28.如權(quán)利要求25至27之一的單克隆抗體，其中所述抗體是IgGl抗體。
29.一種分離核酸，其編碼權(quán)利要求25至觀的單克隆抗體。
30.如權(quán)利要求四的分離核酸，其中所述核酸包含選自SEQID No. 15至SEQ ID No. 21 和SEQ ID No. 50至SEQ ID No. 77的核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開內(nèi)容涉及抗體工程化領(lǐng)域，并且更特別地，涉及篩選抗體和/或調(diào)節(jié)抗體激動(dòng)/拮抗活性的方法。更特別地，本發(fā)明公開內(nèi)容涉及提高針對(duì)特定目標(biāo)分子的單克隆抗體，或其二價(jià)功能片段或衍生物的拮抗活性的方法，所述抗體能夠抑制所述目標(biāo)分子的一種或多種生物活性，其中所述方法包括鉸鏈區(qū)重新構(gòu)建的階段，該階段由通過至少一個(gè)氨基酸的刪除、添加或置換來修飾所述鉸鏈區(qū)的氨基酸序列組成。本發(fā)明公開內(nèi)容還涉及用于這種調(diào)節(jié)方法的多肽和所獲得的抗體。
文檔編號(hào)C07K16/00GK102232086SQ200980148318
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2009年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月2日
發(fā)明者L·格奇, T·沃琴 申請(qǐng)人:皮埃爾法布雷醫(yī)藥公司